CN110423818A - 一种用于hla-loss检测和个体识别的引物、探针、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，且公开了一种用于HLA‑LOSS检测和个体识别的引物、探针、试剂盒及方法，基于最新的IMGT数据库中HLA在亚洲人群中错配率高的HLA位点，并针对错配率高的HLA位点，进一步设计特异性引物和探针组合。该用于HLA‑LOSS检测和个体识别的引物、探针、试剂盒及方法，具有特异性好、灵敏度高和简便快捷的优点，为亚洲人群进行HLA‑LOSS检测和个体识别提供了非常重要的检测手段。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体为一种用于HLA-LOSS检测和个体识别的引物、探针、试剂盒及方法。
背景技术
我国白血病发病率为3/10万，目前在我国有400万左右的白血病患者，而每年以4万的速度增长。在恶性肿瘤死亡率中，白血病居第6位(男性)和第八位(女性)，在儿童及35岁以下成人中则居第1位。对于白血病缓解后的治疗，一直采用化疗或者造血干细胞移植等方法，化疗治愈比例不到40％，移植治愈率虽然可达80％左右，但移植后引起的感染和相关并发症很高。
目前，异基因造血干细胞移植(HSCT)仍然是长期控制和治疗白血病的有效手段之一，这主要归功于移植免疫系统的抗肿瘤作用，即供者的淋巴细胞识别受者HLA错配的白血病细胞，从而达到GvL效应。移植后复发是异基因造血干细胞移植失败的主要原因之一，根据HLA是否发生丢失，将复发分为“经典”复发和HLA-LOSS复发。Vago L和Villalobos IB等研究发现，在单倍体移植中，超过1/3的移植后复发是由于患者特异性的HLA丢失引起的。Toffalori C等研究发现，HLA丢失不仅仅发生在单倍体移植中，而且在完全匹配无关供者异基因造血干细胞移植中也存在HLA丢失。HLA单体型错配的基因组丢失是单倍体造血干细胞移植后白血病免疫逃逸和复发的常见机制。然而，白血病能够通过错配的HLA单体型的特定基因组丢失而逃避GvL，同时保持匹配的HLA单体型，从而导致白血病复发，目前复发仍然是一个悬而未决的问题。
HLA丢失复发消除了供体淋巴细胞对白血病的识别，使得白血病细胞逃逸供者淋巴细胞的GvL效应和供体淋巴细胞输注无效，从而促使了替代性的挽救治疗方法的选择。因此，通过评估移植后白血病复发的HLA状态来区分“HLA丢失”和“经典”复发是很重要的，可以指导复发干预以及治疗方案的选择。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于HLA-LOSS检测和个体识别的引物、探针、试剂盒及方法，具备具有特异性好、灵敏度高和简便快捷的优点，为亚洲人群进行HLA-LOSS检测和个体识别提供了非常重要的检测手段等优点，解决了HLA-LOSS检测和个体识别特异性差，灵敏度低的问题。
(二)技术方案
1.为实现上述的目的，本发明提供如下技术方案：一种用于HLA-LOSS检测和个体识别的引物和探针，所述检测引物及探针的序列如下所示：
正向引物：HLA-B*1502F:5’-GCCGCGAGTCCGAGGATGGC-3’
反向引物1：HLA-B*1502R1:5’-GTGTGTTGGTCTTGGAGATCTG-3’
反向引物2：HLA-B*1502R2:5’-CGGTAAGTCTGTGTGTTGGTC-3’
荧光探针：TM-HLA-B*1502:5’荧光基团-ATAGAGCAGGAGGAGCCGGAGTAT-3’淬灭基团。
具体过程为：筛选HLA-LOSS检测引物和探针，基于数据库，从中筛选出针对人群中错配率高的HLA位点，它们分别为：
A*01:01；A*02:01；A*02:06；A*02:07；A*11:01；A*23:01；A*24:02；A*24:07；A*25:01；A*26:01；A*31:01；A*36:01；A*69:01；
B*15:01；B*15:02；B*35:01；B*40:01；B*46:01；B*51:01；B*58:01；
C*01:02；C*03:02；C*03:03；C*03:04；C*04:01:01:01；C*07:02；
DPB1*04:01；DPB1*08:01；DPB1*02:01；DPB1*04:02；DPB1*16:01；DPB1*17:01；
DPB1*01:01；DPB1*11:01；DPB1*13:01；DPB1*15:01。
优选的，所述试剂盒由以下试剂组成：
A1、全血基因组DNA提取试剂，购于QIAamp DNA Blood Mini kit试剂盒；
B2、RNase-Free ddH2O；
C3、2×Taqman Fast Advanced Master Mix反应液，购于Life；
D4、分别分装在相应编号离心管中的引物和探针组合。
优选的，所述试剂盒中每种引物的浓度为8μM，每种探针的浓度为4μM。
优选的，其包含以下步骤：
S1、获取待测样品的DNA。
DNA提取可以采用QIAamp DNA Blood Mini kit试剂盒。
S2、首先采用INDEL个体识别技术，找出患者特有的INDEL标记位点，根据患者特有的INDEL标记位点计算出移植术后标本中患者细胞占比，根据移植后与移植前ΔCt的差值(ΔΔCt)，可以计算获得术后患者细胞嵌合率％＝2-ΔΔCt×100％，其中ΔΔCt＝ΔCt移植后-ΔCt移植前＝(Ct标记基因移植后-Ct内参基因移植后)-(Ct标记基因移植前-Ct内参基因移植前)。
S3、采用本发明所述的HLA-LOSS检测引物和探针组合，或采用本发明所述的试剂盒，以步骤1中获取的DNA为模板，进行荧光PCR扩增，并收集荧光信号。
荧光PCR扩增的体系为20uL：10uL 2×Taqman Fast Advanced Master Mix反应液(Life)；1uL 8uM引物F；1uL 8uM引物R；1uL 4uM探针；1uL30-40ng/uL DNA；用RNase-FreeddH2O补足20uL反应体系。
荧光PCR的反应条件为：95℃预变性5min，然后95℃变性10s，60℃退火延伸30s，共进行40个循环，在60℃处收集荧光信号。
S4、根据INDEL个体识别技术待测样品进行微嵌合检测和根据HLA-LOSS检测移植术后患者HLA-LOSS。
优选的，所述数据库为IMGT数据库。
优选的，所述人群针对亚洲人群。
优选的，所述INDEL个体识别结果判读标准：通过Ct值来判断每个遗传标记阳性样本和阴性样本的Ct值区间范围，阳性样本Ct值落在24-29之间，阴性样本Ct值在38以上，阳性样本和阴性样本Ct值相差12以上，表示引物和探针的特异性良好，所述HLA-LOSS结果判读标准：通过Ct值来判断HLA位点阳性样本和阴性样本的Ct值区间范围，阳性HLA位点Ct小于30，阴性HLA位点Ct大于34，确定患者特有的HLA位点后，用该特有的HLA位点对移植术后样本进行检测，如果患者细胞比例在1％以上，且患者特异HLA位点没有明显的扩增曲线，说明该患者发生HLA-LOSS；如果患者特异HLA位点仍有明显的扩增曲线，说明该患者没有发生HLA-LOSS。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种用于HLA-LOSS检测和个体识别的引物、探针、试剂盒及方法，具备以下有益效果：
1、该用于HLA-LOSS检测和个体识别的引物、探针、试剂盒及方法，基于最新的IMGT数据库中HLA在亚洲人群中错配率高的HLA位点，并针对错配率高的HLA位点，进一步设计特异性引物和探针组合，具有特异性好、灵敏度高和简便快捷的优点，为亚洲人群进行HLA-LOSS检测和个体识别提供了非常重要的检测手段。
附图说明
图1：本发明用于检测引物和探针特异性的PCR扩增结果图；
图2：本发明提出的HLA*11:01的检测结果图；
图3：本发明提出的遗传标记HLA*01:01的标准品扩增曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
2.请参阅图1-3，一种用于HLA-LOSS检测和个体识别的引物和探针，检测引物及探针的序列如下所示：
正向引物：HLA-B*1502F:5’-GCCGCGAGTCCGAGGATGGC-3’
反向引物1：HLA-B*1502R1:5’-GTGTGTTGGTCTTGGAGATCTG-3’
反向引物2：HLA-B*1502R2:5’-CGGTAAGTCTGTGTGTTGGTC-3’
荧光探针：TM-HLA-B*1502:5’荧光基团-ATAGAGCAGGAGGAGCCGGAGTAT-3’淬灭基团。
具体过程为：筛选HLA-LOSS检测引物和探针，基于数据库，数据库为IMGT数据库，从中筛选出针对人群中错配率高的HLA位点，人群针对亚洲人，它们分别为：
A*01:01；A*02:01；A*02:06；A*02:07；A*11:01；A*23:01；A*24:02；A*24:07；A*25:01；A*26:01；A*31:01；A*36:01；A*69:01；
B*15:01；B*15:02；B*35:01；B*40:01；B*46:01；B*51:01；B*58:01；
C*01:02；C*03:02；C*03:03；C*03:04；C*04:01:01:01；C*07:02；
DPB1*04:01；DPB1*08:01；DPB1*02:01；DPB1*04:02；DPB1*16:01；DPB1*17:01；
DPB1*01:01；DPB1*11:01；DPB1*13:01；DPB1*15:01。
表1 引物和探针情况表
实施例1：引物的设计与合成
(一)HLA位点筛选
HLA位点进行筛选的原则是选择亚洲人群中HLA位点频率高且错配率高的位点，因为HLA-LOSS主要发生在HLA错配位点。
1、DNA提取
DNA提取按照QIAamp DNA Blood Mini kit试剂盒进行，随后采用RNase-FreeddH2O稀释到30-40ng/uL备用。
2、PCR扩增体系
荧光PCR扩增的体系为20uL：10uL 2×Taqman Fast Advanced Master Mix反应液(Life)；1uL 8uM引物F；1uL 8uM引物R；1uL 4uM探针；1uL30-40ng/uL DNA；用RNase-FreeddH2O补足20uL反应体系。
3、PCR反应条件
荧光PCR的反应条件为：95℃预变性5min，然后95℃变性10s，60℃退火延伸30s，共进行40个循环，在60℃处收集荧光信号。
4、结果的判读
通过Ct值来判断HLA位点阳性样本和阴性样本的Ct值区间范围，阳性HLA位点Ct小于30，阴性HLA位点Ct大于34。
实施例2：引物和探针特异性测试
在实施例1的前提下，分别选取已知的HLA位点的阳性样本对检测引物和探针的特异性验证。
1、荧光PCR扩增体系
荧光PCR扩增的体系为20uL：10uL 2×Taqman Fast Advanced Master Mix反应液(Life)；1uL 8uM引物F；1uL 8uM引物R；1uL 4uM探针；1uL30-40ng/uL DNA；用RNase-FreeddH2O补足20uL反应体系。
2、荧光PCR反应条件
荧光PCR的反应条件为：95℃预变性5min，然后95℃变性10s，60℃退火延伸30s，共进行40个循环，在60℃处收集荧光信号。
3、引物和探针特异性判断
通过Ct值来判断HLA位点阳性样本和阴性样本的Ct值区间范围，阳性HLA位点Ct小于30，阴性HLA位点Ct大于34。
以DPB1*04:01为例，阳性样本的Ct值落在范围30内(参见说明书附图1)，阴性样本的Ct值检测不到(即在40个PCR循环数下，没有检测到荧光信号，Ct值大于40)(参见说明书附图1)，表明引物和探针的特异性良好。
实施例3：引物和探针灵敏性测试
1、标准品构建
针对样本A(含有HLA*01:01位点)和样本B(不含有HLA*01:01位点)，以不同比例混合(50％、25％、10％、5％、1％、0.5％)，得到不同比例的浓度为40ng/uL的标准品。
2、通过定量分析的方法检测引物和探针的灵敏性
将制备的嵌合比例分别为50％、25％、10％、5％、1％、0.5％的标准品作为定量分析的模板，同时以RNase-Free ddH2O为模板作为空白对照，为了达到100ng DNA初始模板(1％的检测灵敏度)，即当患者的细胞在1％以上时，如果发生HLA-LOSS才能检测到，结果如图3所示。
实施例4：HLA-LOSS样本检测
1、术后患者细胞是否存在确认
利用IDP-PCR技术确认术后样本中患者自身的细胞存在，首先患者特异性IDP位点确认，术前和供者DNA浓度3ng/ul。
(1)荧光PCR扩增体系
荧光PCR扩增的体系为20uL：10uL 2×Taqman Fast Advanced Master Mix反应液(Life)；1uL 8uM引物F；1uL 8uM引物R；1uL 4uM探针；1uL30-40ng/uL DNA；用RNase-FreeddH2O补足20uL反应体系。
(2)荧光PCR反应条件
荧光PCR的反应条件为：95℃预变性5min，然后95℃变性10s，60℃退火延伸30s，共进行40个循环，在60℃处收集荧光信号。结果见表1：
表2 患者术前和供者定性
从表1可看出，Marker6，Marker11，Marker19，Marker31是患者特异的分子标记，选取Marker11，Marker19两个Marker作为术后样本中患者细胞比率计算，Marker 11嵌合率32.50％，Marker 19嵌合率35.60％，平均嵌合率34.05％，术后样本中，患者自身的细胞占34.05％，即Non-HLA Specific Assay结果为阳性。
2、HLA-LOSS实验
利用HLA-LOSS技术确认术后样本中患者自身HLA是否发生丢失，首先术前和供者样本定性实验，找出患者特异的HLA位点，术前和供者DNA浓度40ng/ul，结果如表2：
表3 患者术前和供者HLA定性
| 供者 | Ct值 | Markers | 患者术前 | Ct值 |
| 18TC00116 | 01-A | 18TC00117 | ||
| 18TC00116 | 24.41 | 02-A | 18TC00117 | 26.36 |
| 18TC00116 | 04-A | 18TC00117 | ||
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| 18TC00116 | 22-DPB1 | 18TC00117 | ||
| 18TC00116 | 23.76 | REF | 18TC00117 | 25.63 |
从表2可看出，520-DPB1Marker是患者特有的位点，即HLA错配位点(DPB1)，根据Non-HLA Specific Assay实验可知，患者术后样本中患者自身细胞占34.05％，采用20-DPB1患者特异Marker检测术后样本中是否存在DPB1位点。
(3)荧光PCR扩增体系
荧光PCR扩增的体系为20uL：10uL 2×Taqman Fast Advanced Master Mix反应液(Life)；1uL 8uM引物F；1uL 8uM引物R；1uL 4uM探针；1uL30-40ng/uL DNA；用RNase-FreeddH2O补足20uL反应体系。
(4)荧光PCR反应条件
荧光PCR的反应条件为：95℃预变性5min，然后95℃变性10s，60℃退火延伸30s，共进行40个循环，在60℃处收集荧光信号。
(5)结果判读
从图2可知，术后样本中患者特异的DPB1没有扩增曲线，可判断患者DPB1位点丢失，根据分型结果，HLA Specific Assay结果为阴性，可知HLA丢失为DPB1*04:01。
一种用于HLA-LOSS检测和个体识别的试剂盒，试剂盒由以下试剂组成：
A1、全血基因组DNA提取试剂，购于QIAamp DNA Blood Mini kit试剂盒；
B2、RNase-Free ddH2O；
C3、2×Taqman Fast Advanced Master Mix反应液，购于Life；
D4、分别分装在相应编号离心管中的引物和探针组合。
试剂盒中每种引物的浓度为8μM，每种探针的浓度为4μM。
一种用于HLA-LOSS检测和个体识别的方法，其包含以下步骤：
S1、获取待测样品的DNA。
DNA提取可以采用QIAamp DNA Blood Mini kit试剂盒。
S2、首先采用INDEL个体识别技术，找出患者特有的INDEL标记位点，根据患者特有的INDEL标记位点计算出移植术后标本中患者细胞占比，根据移植后与移植前ΔCt的差值(ΔΔCt)，可以计算获得术后患者细胞嵌合率％＝2-ΔΔCt×100％，其中ΔΔCt＝ΔCt移植后-ΔCt移植前＝(Ct标记基因移植后-Ct内参基因移植后)-(Ct标记基因移植前-Ct内参基因移植前)。
S3、采用本发明的HLA-LOSS检测引物和探针组合，或采用本发明的试剂盒，以步骤1中获取的DNA为模板，进行荧光PCR扩增，并收集荧光信号。
荧光PCR扩增的体系为20uL：10uL 2×Taqman Fast Advanced Master Mix反应液(Life)；1uL 8uM引物F；1uL 8uM引物R；1uL 4uM探针；1uL30-40ng/uL DNA；用RNase-FreeddH2O补足20uL反应体系。
荧光PCR的反应条件为：95℃预变性5min，然后95℃变性10s，60℃退火延伸30s，共进行40个循环，在60℃处收集荧光信号。
S4、根据INDEL个体识别技术待测样品进行微嵌合检测和根据HLA-LOSS检测移植术后患者HLA-LOSS，INDEL个体识别结果判读标准：通过Ct值来判断每个遗传标记阳性样本和阴性样本的Ct值区间范围，阳性样本Ct值落在24-29之间，阴性样本Ct值在38以上，阳性样本和阴性样本Ct值相差12以上，表示引物和探针的特异性良好，HLA-LOSS结果判读标准：通过Ct值来判断HLA位点阳性样本和阴性样本的Ct值区间范围，阳性HLA位点Ct小于30，阴性HLA位点Ct大于34，确定患者特有的HLA位点后，用该特有的HLA位点对移植术后样本进行检测，如果患者细胞比例在1％以上，且患者特异HLA位点没有明显的扩增曲线，说明该患者发生HLA-LOSS；如果患者特异HLA位点仍有明显的扩增曲线，说明该患者没有发生HLA-LOSS。
综上所述，该用于HLA-LOSS检测和个体识别的引物、探针、试剂盒及方法，基于最新的IMGT数据库中HLA在亚洲人群中错配率高的HLA位点，并针对错配率高的HLA位点，进一步设计特异性引物和探针组合，具有特异性好、灵敏度高和简便快捷的优点，为亚洲人群进行HLA-LOSS检测和个体识别提供了非常重要的检测手段。
需要说明的是，术语“包括”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (7)
1.一种用于HLA-LOSS检测和个体识别的引物、探针、试剂盒及方法，其特征在于，所述检测引物及探针的序列如下所示：
正向引物：HLA-B*1502 F:5’-GCCGCGAGTCCGAGGATGGC-3’
反向引物1：HLA-B*1502 R1:5’-GTGTGTTGGTCTTGGAGATCTG-3’
反向引物2：HLA-B*1502 R2:5’-CGGTAAGTCTGTGTGTTGGTC-3’
荧光探针：TM-HLA-B*1502:5’荧光基团-ATAGAGCAGGAGGAGCCGGAGTAT-3’淬灭基团。
具体过程为：筛选HLA-LOSS检测引物和探针，基于数据库，从中筛选出针对人群中错配率高的HLA位点，它们分别为：
A*01:01；A*02:01；A*02:06；A*02:07；A*11:01；A*23:01；A*24:02；A*24:07；A*25:01；A*26:01；A*31:01；A*36:01；A*69:01；
B*15:01；B*15:02；B*35:01；B*40:01；B*46:01；B*51:01；B*58:01；
C*01:02；C*03:02；C*03:03；C*03:04；C*04:01:01:01；C*07:02；
DPB1*04:01；DPB1*08:01；DPB1*02:01；DPB1*04:02；DPB1*16:01；DPB1*17:01；
DPB1*01:01；DPB1*11:01；DPB1*13:01；DPB1*15:01。
2.一种用于HLA-LOSS检测和个体识别的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由以下试剂组成：
A1、全血基因组DNA提取试剂，购于QIAamp DNA Blood Mini kit试剂盒；
B2、RNase-Free ddH2O；
C3、2×Taqman Fast Advanced Master Mix反应液，购于Life；
D4、分别分装在相应编号离心管中的引物和探针组合。
3.根据权利要求2所述的一种用于HLA-LOSS检测和个体识别的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中每种引物的浓度为8μM，每种探针的浓度为4μM。
4.一种用于HLA-LOSS检测和个体识别的方法，其特征在于：其包含以下步骤：
S1、获取待测样品的DNA。
DNA提取可以采用QIAamp DNA Blood Mini kit试剂盒。
S2、首先采用INDEL个体识别技术，找出患者特有的INDEL标记位点，根据患者特有的INDEL标记位点计算出移植术后标本中患者细胞占比，根据移植后与移植前ΔCt的差值(ΔΔCt)，可以计算获得术后患者细胞嵌合率％＝2-ΔΔCt×100％，其中ΔΔCt＝ΔCt移植后-ΔCt移植前＝(Ct标记基因移植后-Ct内参基因移植后)-(Ct标记基因移植前-Ct内参基因移植前)。
S3、采用本发明所述的HLA-LOSS检测引物和探针组合，或采用本发明所述的试剂盒，以步骤1中获取的DNA为模板，进行荧光PCR扩增，并收集荧光信号。
荧光PCR扩增的体系为20uL：10uL 2×Taqman Fast Advanced Master Mix反应液(Life)；1uL 8uM引物F；1uL 8uM引物R；1uL 4uM探针；1uL 30-40ng/uL DNA；用RNase-FreeddH2O补足20uL反应体系。
荧光PCR的反应条件为：95℃预变性5min，然后95℃变性10s，60℃退火延伸30s，共进行40个循环，在60℃处收集荧光信号。
S4、根据INDEL个体识别技术待测样品进行微嵌合检测和根据HLA-LOSS检测移植术后患者HLA-LOSS。
5.根据权利要求1所述的一种用于HLA-LOSS检测和个体识别的引物、探针、试剂盒及方法，其特征在于：所述数据库为IMGT数据库。
6.根据权利要求1所述的一种用于HLA-LOSS检测和个体识别的引物和探针，其特征在于：所述人群针对亚洲人群。
7.根据权利要求4所述的一种用于HLA-LOSS检测和个体识别的方法，其特征在于：所述INDEL个体识别结果判读标准：通过Ct值来判断每个遗传标记阳性样本和阴性样本的Ct值区间范围，阳性样本Ct值落在24-29之间，阴性样本Ct值在38以上，阳性样本和阴性样本Ct值相差12以上，表示引物和探针的特异性良好，所述HLA-LOSS结果判读标准：通过Ct值来判断HLA位点阳性样本和阴性样本的Ct值区间范围，阳性HLA位点Ct小于30，阴性HLA位点Ct大于34，确定患者特有的HLA位点后，用该特有的HLA位点对移植术后样本进行检测，如果患者细胞比例在1％以上，且患者特异HLA位点没有明显的扩增曲线，说明该患者发生HLA-LOSS；如果患者特异HLA位点仍有明显的扩增曲线，说明该患者没有发生HLA-LOSS。
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