CN101878313A

CN101878313A - 预测鳞状细胞肺癌的方法

Info

Publication number: CN101878313A
Application number: CN2008801141635A
Authority: CN
Inventors: M·拉波尼; L·E·多西
Original assignee: Janssen Diagnostics LLC
Current assignee: Janssen Diagnostics LLC
Priority date: 2007-10-30
Filing date: 2008-10-30
Publication date: 2010-11-03
Also published as: MX2010004916A; US20110171657A1; JP2011501964A; KR20100093538A; US7927805B2; IL205347A0; CA2704062A1; WO2009059016A1; EP2215263A1; BRPI0818478A2; US20090136949A1

Abstract

本说明书公开的是通过观测选择的微RNA序列的调控改变来预测鳞状细胞肺癌的预后的方法。这些序列可包括hsa-mir-146b、hsa-mir-191、hsa-mir-206、hsa-mir-299-3p、hsa-mir-155、hsa-mir-15a、hsa-mir-122a、hsa-mir-513、hsa-mir-184、hsa-mir-511、hsa-mir-100、hsa-mir-10a、hsa-mir-453、hsa-mir-379、hsa-mir-202、hsa-mir-21、hsa-mir-126、hsa-mir-494、hsa-mir-432、hsa-mir-370以及这些序列的组合。

Description

预测鳞状细胞肺癌的方法

相关专利申请的交叉引用

本专利申请要求于2007年十月30日提交的共同待审的美国临时专利申请系列号60/983,756的优先权和利益，将该专利申请以引用的方式全文并入本文。

对序列表、表格或程序表单的引用

本专利申请引用了下面列出的“序列表”，该序列表以电子文档提供，文档名为“Sequence listing.txt”(6kb，2008年十月29日创建)，将其以引用的方式全部并入本文。

技术领域

在一个实施例中，本发明涉及一种方法，该方法通过观测选择的微RNA(miRNA)序列产生的调控改变来提供对鳞状细胞肺癌的预后。通过观测特定序列的上调或下调，可确定癌细胞的存在以及癌的预后这两种情况。

发明背景

肺癌是世界范围内癌相关死亡的最通常原因，而非小细胞肺癌(NSCLC)为支气管肺癌的最常见类型。NSCLC是80％的美国全部肺癌死亡的原因并且主要由腺癌和鳞状上皮细胞癌(SSC)以及大细胞癌组成，大细胞癌较少。尽管可进行有可能治愈的外科手术，但大约40％的患者会在5年内复发。最近，NSCLC的基因组分布分析使得能对患有该疾病的患者进行预后。这种基因组分类器(genomic classifier)可包含最多数百种用于鉴别患有早期NSCLC的患者的基因，这些患者可能会受益于外科手术切除加上化学疗法。

发明内容

在本发明的一种形式中，本发明包括用于检测细胞样品中鳞状细胞肺癌的存在的方法。申请者已发现了某些miRNA，其在鳞状细胞肺癌中相对于野生型细胞受到差异调控。通过测定这类miRNA的调控改变程度，可确定组织样品是否包括鳞状细胞肺癌细胞。

在另一种形式中，本发明为预测鳞状细胞肺癌的预后的方法。申请者已发现了某些其他miRNA，其使得能对患有鳞状细胞肺癌的患者对预后进行预测。通过监测这些miRNA，可提供更准确的预后。

附图说明

本发明参照附图进行公开，其中：

图1A是将所关注的miRNA序列的数目与预测预后相关的坐标图。

图1B是针对miR-146b表达的两种差异水平的存活百分比与时间相关的坐标图。

对应参考符号表明贯穿若干视图的对应部分。本文列出的例子示出了本发明的几个实施例，但是不应该理解为以任何方式限制本发明的范围。

具体实施方式

定义

短语“调控改变”指细胞组分(例如miRNA)相对于野生型细胞中相同细胞组分丰度的丰度改变。短语“下调”指所考虑的细胞组分丰度的下降，而短语“上调”指组分丰度增加。

根据差异miRNA调控鉴别鳞状细胞肺癌

将鳞状细胞肺癌组织与野生型组织比较并鉴定了十五种差异表达的miRNA(表1)。组织样品包括细胞系和临床样品两者。根据常规技术从细胞样品提取总RNA。例如，可将mirVana分离试剂盒(Ambion)用于速冻样品而将RecoverAll^TM总核酸分离试剂盒用于福尔马林固定石蜡包埋的(FFPE)样品(Ambion)。也可以使用其他常规的RNA提取方法。一旦提取总RNA后，可通过凝胶电泳分离小的(少于四十个核苷酸的)RNA。对样品进行分析以确定特定miRNA序列的种类和丰度。可将任何合适的技术用来确定种类和丰度，例如但不限于市售的miRNA试剂盒，例如mirVana Bioarray(Ambion)。在鳞状细胞肺癌细胞中鉴定了十五种表达相对于野生型样品显著改变的miRNA。表1中示出了这些序列。

表1.在正常肺和肺鳞状细胞癌之间差异表达的miRNA。

LN＝肺正常信号强度(log2)；LC＝肺癌信号强度(log2)

改变倍数＝2^(LC-LN)

在本发明的一个实施例中，对样品进行分析以确定表1的特定miRNA序列的丰度。样品可以是组织样品，例如在外科手术操作期间获得的样品。或者，样品可从例如血样或从类似来源以非侵入性方式获得。确定样品中特定miRNA的丰度并观测相对于一般样品的调控改变。由于已知miRNA保持在细胞外，所以游离的miRNA可提供鳞状细胞肺癌的筛选方法。该筛选方法可用非侵入性采样技术来进行，例如简单的血试验。以这种方式，可对高风险群体中的患者进行常规的检测以帮助鉴别早期的癌发展。

在另一个实施例中，对miRNA丰度进行观测以将鳞状细胞肺癌与腺癌区分。通过观测miRNA表达的调控改变，即使是在组织形态未清晰时也可进行这种区别。

肺鳞状细胞癌的预后

已经发现了另外的miRNA序列，这些序列使得人们可对肺鳞状细胞癌的预后进行预测。因而二十种miRNA序列被鉴定为与鳞状细胞肺癌预后紧密相关。临床样品在1991年十月至2002年7月之间收集。还收集了每位患者的病历并在表现出调控改变的那些miRNA与患者预后之间进行相关分析。该相关分析方法的细节在本说明书其它地方进行论述。以这种方式，鉴定出强烈影响患者预后的那些miRNA序列。表2列出了所鉴别的序列。

表2.与鳞状细胞肺癌预后相关的miRNA。

平均0和平均1分别为野生型组织和癌性组织。

使用五倍交叉验证，发现，当单独使用miR-146b(SEQ ID NO.15)时预测三年内的总体存活率的最高平均值为78％。当以线性方式向Mir-146b增加三种或更多种另外的miRNA时，预测准确性降低至大约68％，但此后稳定。参见图1A。与低miRNA-146b组(95个月)相比，高miRNAmiR-146上调的患者具有显著更差的总体存活率(26个月)。参见图1B。在图1B中，“高”miRNA-146组(两条线中较低者)定义为miRNA-146水平高于中值的那些。“低”miRNA-146组(两条线中较高者)定义为miRNA-146水平低于中值的那些。

通过测量特定miRNA序列的丰度可给患者提供预测性预后。例如，可收集特定序列的miRNA丰度与随时间变化的患者存活率相关的统计数据。例如，对于某种miRNA序列有大的调控改变的患者，该数据可表明在接下来的三年内缓解的可能性为78％。可给患者提供这种预测性预后。图1B提供了miR-146b的样品数据，但这种数据不应理解为是限制性的。可将额外的数据(例如患者的人口统计信息)考虑在内，使得可收集更广泛的统计信息。

miRNA可用常规的技术从组织样品提取。这种样品可在外科手术操作期间获得。或者，可从非组织样品分离miRNA。例如，可从血液、粪便、尿或其他生物样品分离miRNA。将样品中存在的特定miRNA的丰度与正常样品进行比较。上调的或下调的miRNA丰度可指示癌。

特定miRNA序列的丰度可根据任意已知的技术测定。可使用例如但不限于QPCR。

随附的序列表中的miRNA序列代表了通常分离的miRNA序列。所列出的序列末端的改变是本领域已知的并且在本发明的范围内，前提条件是残基有至少95％的同源性。

尽管已参考具体的实施例描述了本发明，但本领域技术人员将会理解，可进行多种改变并且可用等价物取代其要素以适应于具体的情况而不背离本发明的范围。因而，旨在不使本发明受限于所公开的具体实施例或考虑用于执行本发明的具体方式，而是本发明将包括落入所附权利要求书的范围和精神的所有实施例。

方法

临床样品

总共，对六十一份速冻肺SCC样品和10份匹配的正常的相邻肺组织样品的miRNA表达进行评价。这些样品收集自1991年十月和2002年七月之间的密西根大学医院(University of Michigan Hospital)的患者，征得了患者的同意和伦理委员会(Institutional Review Board)的批准。选择用于分析的样品含有高于70％的肿瘤细胞。在这六十一份肿瘤样品中，五十七份样品具有足够充分的随访临床信息并将其用于预后分析。这五十七份中有五十四份此前用Affymetrix U133A GeneChip(GSE4573)进行了表达谱分析。

Ambion miRNA表达谱分析

采用含有328种人miRNA探针的mirVana Bioarray(Ambion，第2版)来鉴定肺SCC miRNA特征(signature)。用Trizol分离总RNA。用mirVana分离试剂盒(Ambion)从4ug总RNA分离MiRNA。然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(Flash-Page Ambion)分成级分并通过采用线性丙烯酰胺的乙醇沉淀来回收小RNA(＜40nt)。在进行miRNA阵列分析前，将miR-16的定量RT-PCR(qPCR)用于确认miRNA富集。如果miR-16的Ct值大于25，则认为miRNA分离失败。

让小RNA样品接受聚(A)聚合酶反应，其中掺入了胺改性的尿苷(Ambion)。然后用胺反应性Cy3(Invitrogen)对加尾的样品进行荧光标记。上述标记技术仅是一种可能的方法。在受益于阅读本说明书后，其他合适的标记技术对本领域技术人员来说将是显而易见的。这些替代方法可考虑用于本说明书。用玻璃纤维过滤器对荧光标记的RNA进行纯化并洗脱(Ambion)。然后在42℃(Ambion)下将每种样品与Bioarray芯片杂交14小时。洗涤阵列并用Agilent 2505B共聚焦微阵列扫描仪(Agilent)扫描，用Expression Analysis软件(Codelink，4.2版)获得数据。

miRNA定量PCR

用ABI miRNA Taqman试剂进行定量PCR(QPCR)以验证miRNA表达谱。根据生产商的说明书(Ambion)用大容量DNA库试剂盒(High CapacityDNA Archive kit)和3μl的5x RT引物将10ng的总RNA转化为cDNA。将15μl反应物在热循环仪中温育，16℃下30分钟、42℃下30分钟、85℃下5分钟并保持在4℃下。所有的逆转录酶反应均包括无模板对照。QPCR用标准的PCR试剂盒规程在Applied Biosystems 7900HT序列检测系统上进行。10ml PCR反应物包括0.66μl RT产物、1μl TaqmanmiRNA测定引物和探针混合物、5μl Taqman 2x通用PCR主混合物(NoAmperase UNG)和3.34μl水。将该反应物在95℃下于384孔板中温育10分钟，然后进行40个如下循环：95℃下15秒，60℃下2分钟。全部QPCR反应物均包括无cDNA对照并且全部反应一式三份来进行。

MiRNA统计分析

首先将Expression Analysis软件标记的探针除去并从点平均值减去背景中值。如果标记的探针的数目少于每个芯片标记探针的平均值减去标准偏差，则确定异常样品并除去。将低于零的点强度值设为0.5，然后将数据进行分数位标准化(quantile normalized)。通过将所有样品的重复探针的相关性对中值强度的中值作图确定背景截断值为6(log2标准化)。因此，如果标准化的信号强度在任一比较组中小于6，则在进一步的分析中将miRNA除去。由于低于该值时重复探针的相关性急剧下降，所以选择该截断值。

用微阵列显著性分析(SAM)算法(Tusher VG，Tibshirani R，Chu G.Significance analysis of microarrays applied to the ionizingradiation response.Proc Natl Acad Sci USA 2001；98(9)：5116-21)进行存活率分析。如果配对t-检验p-值小于0.05并且使用3-年截断值的接受器工作特征分析的曲线下面积(AUC)大于0.65，则将MiRNA选择为与总体存活率显著相关。采用了最多3年的随访，因为该群体中将会复发的患者大多数在3年内会复发。另外由于3年后非癌症相关疾病有可能增加，这些患者中有许多变老并死亡。为了确定用于构建预后分类器的miRNA的最小数目，通过根据等级次序一次添加一种基于来对基因表达标记物的组合进行检验。对于基因数目增加的每种特征，进行了用3年内死亡作为限定点的接收器工作特征(ROC)分析(在100次5倍交叉验证中)，以计算平均的曲线下面积(AUC)。

序列表

<110>Veridex L.L.C.

Raponi，Mitch

Arndt，Gregory M.

Dossey，Lesley

<120>用于预测鳞状细胞肺癌的预后的方法

<130>3035532 US01

<160>34

<170>PatentIn第3.5版

<210>1

<211>22

<212>RNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

cugugcgugu gacagcggcu ga 22

<210>2

<211>22

<212>RNA

<213>智人

<400>2

uaauacugcc ggguaaugau gg 22

<210>3

<211>24

<212>RNA

<213>智人

<400>3

caaagugcuu acagugcagg uagu 24

<210>4

<211>23

<212>RNA

<213>智人

<400>4

uaaagugcuu auagugcagg uag 23

<210>5

<211>23

<212>RNA

<213>智人

<400>5

ucccugagac ccuuuaaccu gug 23

<210>6

<211>21

<212>RNA

<213>智人

<400>6

ugagguagga gguuguauag u 21

<210>7

<211>22

<212>RNA

<213>智人

<400>7

uaacacuguc ugguaacgau gu 22

<210>8

<211>21

<212>RNA

<213>智人

<400>8

uaaagugcug acagugcaga u 21

<210>9

<211>22

<212>RNA

<213>智人

<400>9

aaagugcugu ucgugcaggu ag 22

<210>10

<211>22

<212>RNA

<213>智人

<400>10

uuuggcaaug guagaacuca ca 22

<210>11

<211>22

<212>RNA

<213>智人

<400>11

uauggcacug guagaauuca cu 22

<210>12

<211>23

<212>RNA

<213>智人

<400>12

aaaagugcuu acagugcagg uag 23

<210>13

<211>23

<212>RNA

<213>智人

<400>13

caaagugcuc auagugcagg uag 23

<210>14

<211>23

<212>RNA

<213>智人

<400>14

caagucacua gugguuccgu uua 23

<210>15

<211>22

<212>RNA

<213>智人

<400>15

ugagaacuga auuccauagg cu 22

<210>16

<211>22

<212>RNA

<213>智人

<400>16

caacggaauc ccaaaagcag cu 22

<210>17

<211>22

<212>RNA

<213>智人

<400>17

uggaauguaa ggaagugugu gg 22

<210>18

<211>22

<212>RNA

<213>智人

<400>18

uaugugggau gguaaaccgc uu 22

<210>19

<211>22

<212>RNA

<213>智人

<400>19

uuaaugcuaa ucgugauagg gg 22

<210>20

<211>22

<212>RNA

<213>智人

<400>20

uagcagcaca uaaugguuug ug 22

<210>21

<211>23

<212>RNA

<213>智人

<400>21

uggaguguga caaugguguu ugu 23

<210>22

<211>22

<212>RNA

<213>智人

<400>22

uucacaggga ggugucauuu au 22

<210>23

<211>22

<212>RNA

<213>智人

<400>23

uggacggaga acugauaagg gu 22

<210>24

<211>21

<212>RNA

<213>智人

<400>24

gugucuuuug cucugcaguc a 21

<210>25

<211>22

<212>RNA

<213>智人

<400>25

aacccguaga uccgaacuug ug 22

<210>26

<211>23

<212>RNA

<213>智人

<400>26

uacccuguag auccgaauuu gug 23

<210>27

<211>22

<212>RNA

<213>智人

<400>27

gagguugucc guggugaguu cg 22

<210>28

<211>19

<212>RNA

<213>智人

<400>28

ugguagacua uggaacgua 19

<210>29

<211>22

<212>RNA

<213>智人

<400>29

agagguauag ggcaugggaa aa 22

<210>30

<211>22

<212>RNA

<213>智人

<400>30

uagcuuauca gacugauguu ga 22

<210>31

<211>21

<212>RNA

<213>智人

<400>31

ucguaccgug aguaauaaug c 21

<210>32

<211>22

<212>RNA

<213>智人

<400>32

ugaaacauac acgggaaacc uc 22

<210>33

<211>23

<212>RNA

<213>智人

<400>33

ucuuggagua ggucauuggg ugg 23

<210>34

<211>21

<212>RNA

<213>智人

<400>34

gccugcuggg guggaaccug g 21

Claims

1.一种在人中预测鳞状细胞肺癌的预后的方法，包括如下步骤：

观测提取的RNA中微RNA相对于野生型肺组织样品中相同微RNA的调控改变，其中所述微RNA选自：SEQ ID NO.15、SEQID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQID NO.23、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQID NO.30、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34以及它们的组合；

根据所述观测预测鳞状细胞肺癌的预后。

2.根据权利要求1所述的方法，还包括在所述观测调控改变的步骤之前除去多于四十个核苷酸的RNA的步骤。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述微RNA选自SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31以及它们的组合。

4.根据权利要求3所述的方法，其中对上调进行观测。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述微RNA选自SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34以及它们的组合。

6.根据权利要求5所述的方法，其中对下调进行观测。

7.一种在人中预测鳞状细胞肺癌的预后的方法，包括如下步骤：

观测提取的RNA中SEQ ID NO.15相对于野生型肺组织样品中相同微RNA的调控变化；

根据所述观测预测鳞状细胞肺癌的预后。

8.根据权利要求7所述的方法，还包括从肺组织样品提取总RNA的步骤。

9.根据权利要求7所述的方法，其中所述观测步骤包括进行定量聚合酶链式反应的步骤。

10.一种在人中预测鳞状细胞肺癌的预后的方法，包括如下步骤：

观测样品中SEQ ID NO.15的丰度；

根据所述观测预测鳞状细胞肺癌的预后。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述观测丰度的步骤包括将所述样品的SEQ ID NO.15丰度与野生型样品中的SEQ ID NO.15丰度进行比较的步骤。

12.根据权利要求11所述的方法，其中当进行所述比较时，发现SEQID NO.15上调。

13.根据权利要求12所述的方法，其中当发现上调时，发现至少1.5倍的改变。

14.根据权利要求10所述的方法，其中SEQ ID NO.15为唯一观测的微RNA。

15.根据权利要求10所述的方法，其中所述观测步骤包括进行定量聚合酶链式反应的步骤。