CN110592227A

CN110592227A - 生物标志物在乳腺癌中的应用

Info

Publication number: CN110592227A
Application number: CN201911075476.0A
Authority: CN
Inventors: 袁成良; 巫奇; 贾新建; 魏伟; 汪亚丽
Original assignee: Peoples Hospital of Deyang City
Current assignee: Peoples Hospital of Deyang City
Priority date: 2019-04-15
Filing date: 2019-11-06
Publication date: 2019-12-20
Anticipated expiration: 2039-11-06
Also published as: CN109825594A; CN110592227B

Abstract

本发明公开了生物标志物在乳腺癌中的应用，所述生物标志物为lncRNA。本发明首次发现了LINC01781和LINC02014在乳腺癌中表达上调，通过检测LINC01781和LINC02014的表达水平可以判断受试者是否患有乳腺癌以及患乳腺癌的风险。本发明同时为乳腺癌的治疗提供了基因靶点。

Description

生物标志物在乳腺癌中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及生物标志物在乳腺癌中的应用，所述生物标志物为LINC01781和LINC02014。

背景技术

肿瘤是机体在物理、化学、生物等致瘤因素的作用下，局部组织中的某一个细胞在遗传学水平和表观遗传学水平上失去对其生长的正常调控，进而导致克隆性异常增生而形成的新生物。恶性肿瘤的发生和发展是一个长期而多阶段的复杂过程，此过程中伴随着有害突变的积累、基因组不稳定性增加、表观遗传学修饰的改变以及众多癌基因和抑癌基因的功能和表达异常等众多的分子事件，从本质上看，肿瘤是一种高度异质性的基因疾病。

乳腺癌是一种严重威胁妇女健康的恶性肿瘤，已经成为35-65岁妇女第一位死亡原因。这主要是由于乳腺癌本身具有高度异质性，发病因子、疾病演进、治疗反应和转移器官倾向等互异。要想彻底地战胜乳腺癌，更深入地研究乳腺癌发生、发展相关的信号通路，寻找新的治疗靶点成为提供个体化治疗及改善预后的关键。另外，各种治疗手段最大的问题是原发性、继发性耐药，信号转导通路异常是耐药的原因之一。乳腺癌具有不同的分子亚型，其中包括Luminal A型、Luminal B型、HER-2过表达型、基底细胞样及三阴性等分子亚型。而目前在国际上被公认的乳腺癌分子亚型主要包括4个种类:三阴性、HER-2过表达型、Luminal A型和Luminal B型。不同分子分型乳腺癌患者之间存在较大的预后及疗效差异，虽然现有的分子分型对患者的治疗及预后评估提供了较好的依据，但对于其中部分高异质性的乳腺癌患者仍不能解决治疗上的困境。

长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)是非编码RNA中的一种，长度大于200nt，其本身不编码蛋白质，但并不是“非功能”RNA，而是在多种层面上通过多种作用方式调控肿瘤细胞的基因表达，广泛参与肿瘤的发生及转移，成为许多生物学过程富有活力的参与者。近些年已经发现人类基因组中存在许多LncRNA，但关于其对基因组的调控及具体机制不是非常清楚。研究lncRNA与乳腺癌的关系，为乳腺癌的诊断和治疗提供了新的策略。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与乳腺癌相关的生物标志物，通过检测生物标志物的水平可以判断受试者是否患有乳腺癌以及患乳腺癌的风险；同时生物标志物可以作为乳腺癌的治疗靶标，应用于治疗药物的筛选以及药物的制备。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测基因表达水平的试剂在制备诊断乳腺癌的产品中的应用，所述基因选自中LINC01781或LINC02014的一种或两种。

进一步，所述试剂选自：

特异性识别LINC01781或LINC02014的探针；或

特异性扩增LINC01781或LINC02014的引物。

进一步，所述乳腺癌为Luminal B型乳腺癌。

本发明提供了一种诊断乳腺癌的产品，所述产品包括检测样本中的LINC01781或LINC02014的试剂。

进一步，所述试剂包括反转录PCR、实时定量PCR、原位杂交、Northern blotting、芯片或高通量测序平台检测LINC01781或LINC02014的试剂。

进一步，用实时定量PCR检测LINC01781或LINC02014的试剂至少包括一对特异性扩增LINC01781或LINC02014的引物。

进一步，所述特异性扩增LINC01781的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示，特异性扩增LINC02014的引物如SEQ ID NO.3～4所示。

本发明提供了LINC01781或LINC02014在构建预测乳腺癌的计算模型中的应用。

进一步，所述乳腺癌为Luminal B型乳腺癌。

本发明提供了LINC01781或LINC02014在筛选治疗乳腺癌的药物中的应用。

本发明提供了LINC01781或LINC02014在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。

进一步，所述乳腺癌为Luminal B型乳腺癌。

附图说明

图1是利用QPCR检测LINC01781或LINC02014基因在乳腺癌组织中的表达情况图，其中图A为LINC01781，图B为LINC02014。

图2是利用QPCR检测siRNA沉默LINC01781和LINC02014的情况图。

图3是利用CCK-8检测LINC01781和LINC02014对乳腺癌BT474细胞的增殖影响图。

图4是利用Transwell小室检测LINC01781和LINC02014对乳腺癌BT474细胞迁移侵袭能力的影响图。

具体的实施方式

本发明通过高通量方法，检测乳腺癌标本中lncRNA在肿瘤组织和正常组织的表达，发现其中具有明显表达差异的lncRNA，从而为乳腺癌的诊断和治疗提供新的策略，同时为揭示乳腺癌的发病机理提供理论。

LINC01781基因位于1号染色体上，基因ID为101927412，包括LINC01781基因及其的同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的LINC01781，以及源自细胞中加工的任何形式的LINC01781。该术语涵盖LINC01781的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。该术语涵盖例如LINC01781基因，人LINC01781的基因序列，以及来自任何其它脊椎动物来源。

目前，在genebank中公开的LINC01781存在三种转录产物，序列分别如NR_125940.1、NR_125941.1、NR_125942.1所示。熟悉本领域的技术人员可以了解，对测序结果进行生物信息学分析时，通常会将测序结果和已知的基因组进行比对，只要测序片段可以比对到相关的基因上，就可以看做是该基因的表达，因此，LINC01781的不同的转录产物同样包含在本发明中。

LINC02014基因位于3号染色体上，基因ID为105374105，包括LINC02014基因及其的同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的LINC02014，以及源自细胞中加工的任何形式的LINC02014。该术语涵盖LINC02014的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。该术语涵盖例如LINC02014基因，人LINC02014的基因序列，以及来自任何其它脊椎动物来源。

目前，在genebank中公开的LINC02014序列如NR_146710.1所示。

本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。

本文所用术语“差异表达”表示与第二种样品中相同的一种或多种本发明生物标志物的表达水平比较，经测定LncRNA的量或水平，在一个样品中本发明的一种或多种生物标志物的RNA和/或所述生物标志物lncRNA的一种或多种剪接变体表达水平的差异。差异表达可以如本文所述和本领域技术人员理解的方法确定。术语“差异表达”或“表达水平的变化”表示与第二种样品中给定生物标志物的可测定表达水平比较，经测定RNA的量，样品中给定生物标志物可测定表达水平的增加或降低。术语“差异表达”或“表达水平的变化”还可以表示与第二个样品群中生物标志物的可测定表达水平比较，样品群中给定生物标志物可测定表达水平的增加或降低。本文所用“差异表达”可以用给定生物标志物的表达水平相对于对照中给定生物标志物的平均表达水平的比率进行测定，其中比率不等于1.0。还可以用p值测定差异表达。当使用p值时，当p值小于0.1时生物标志物被鉴定为在第一和第二群体之间差异表达。更优选p值小于0.05。甚至更优选p值小于0.01。还更优选p值小于0.005。最优选p值小于0.001。当基于比率确定差异表达时，如果第一种和第二种样品中表达水平的比率大于或小于1.0，则RNA是差异表达的。举例来说，大于1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20的比率，或小于1的比率，例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05。在本发明的另一个实施方案中，如果第一群体的平均表达水平与第二群体的平均表达水平的比率大于或小于1.0，则核酸转录本是差异表达的。举例来说，大于1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20的比率，或小于1的比率，例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05。在本发明的另一个实施方案中，如果第一个样品中表达水平与第二个群体中平均表达水平的比率大于或小于1.0，例如包括比率大于1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20，或比率小于1，例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05，则核酸转录本是差异表达的。

“表达差异增加”或“上调”表示基因相对于对照而言，基因表达(以RNA表达)显示增加至少10％或更多，例如20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、90％或更多或1.1倍、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍或更多。

“表达差异降低”或“下调”表示基因相对于对照而言，基因表达(以RNA表达测定)显示降低至少10％或更多，例如20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、90％或少于1.0倍、0.8倍、0.6倍、0.4倍、0.2倍、0.1倍或更少的基因。例如，上调基因包括与从正常个体分离的RNA的表达相比，从以患有乳腺癌为特征的个体分离的样本中RNA表达水平增加的基因。例如，下调基因包括与从正常个体分离的样本相比，从以患有乳腺癌为特征的个体分离的样本中RNA表达水平降低的基因。

本发明的lncRNA使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测，包括但不限于反转录PCR、实时定量PCR、原位杂交、northern blotting、芯片或高通量测序平台。

所述用反转录PCR进行检测至少包括一对特异扩增LINC01781或LINC02014基因的引物；所述用实时定量PCR进行检测至少包括一对特异扩增LINC01781或LINC02014基因的引物；所述用原位杂交进行检测包括：与LINC01781或LINC02014基因的核酸序列杂交的探针；所述用northern blot进行检测至少包括与LINC01781或LINC02014基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片进行检测包括：与LINC01781或LINC02014基因的核酸序列杂交的探针。

在本发明中，术语“引物”的意思是，能够形成与模板链互补的碱基对(basepair)，并且起到用于复制模板链的起始点作用的7个～50个核酸序列。引物通常合成而得，但也可以使用自然生成的核酸。引物的序列并不一定需要与模板的序列完全相同，只要充分互补而能够与模板杂交即可。可以混入不改变引物的基本性质的追加特征。作为可以混入的追加特征的例子，有甲基化、带帽、一个以上的核酸被同系物取代和核酸间的修饰，但不限于此。

术语“探针”指短至几个到长达数百碱基的核酸片段如RNA或DNA，所述核酸片段可以与mRNA建立特异性结合并且可以因维持标记(Labeling)作用而确定特定mRNA的存在。探针可以按寡核苷酸探针、单链DNA(singlestrandedDNA)探针、双链DNA(doublestrandedDNA)探针和RNA探针等形式制备。在本发明中，可以通过使用本发明的标记多核苷酸及互补探针实施杂交，借助是否杂交来预测乳腺癌。可以基于本领域已知内容修改对探针和杂交条件的恰当选择。

本发明提供了LINC01781或LINC02014在制备预测乳腺癌的计算模型中的应用。正如熟练技术人员可以领会的，可以使用两种或更多种标志物的测量来改进调查中的诊断问题。生化标志物可以个别测定，或者在本发明的一个实施方案中，它们可以同时测定，例如使用芯片或基于珠的阵列技术。然后独立解读生物标志物的浓度，例如使用每种标志物的个别截留，或者它们组合进行解读。

在本发明中，可以以不同方式实施和实现将标志物水平与某种可能性或风险关联起来的步骤。优选地，在数学上组合基因和一种或多种其它标志物的测定浓度，并将组合值与根本的诊断问题关联起来。可以通过任何适宜的现有技术数学方法将标志物值的测定组合。

优选地，在标志物组合中应用的数学算法是一种对数函数。优选地，应用此类数学算法或此类对数函数的结果是单一值。根据根本的诊断问题，能容易地将此类值与例如个体关于乳腺癌的风险或与有助于评估乳腺癌松患者的其它有意诊断用途关联起来。以一种优选的方式，此类对数函数是如下获得的：a)将个体分类入组，例如正常人、有乳腺癌风险的个体、具有乳腺癌的患者等等，b)通过单变量分析来鉴定在这些组之间差异显著的标志物，c)对数回归分析以评估标志物的可用于评估这些不同组的独立差别值，并d)构建对数函数来组合独立差别值。在这种类型的分析中，标志物不再是独立的，而是代表一个标志物组合。

用于将标志物组合与疾病关联起来的对数函数优选采用通过应用统计方法开发和获得的算法。例如，适宜的统计方法是判别分析(DA)(即线性、二次、规则DA)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、PLS(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林方法、助推/装袋方法)、广义线性模型(即对数回归)、基于主分量的方法(即SIMCA)、广义叠加模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法。熟练技术人员在选择适宜的统计方法来评估本发明的标志物组合并由此获得适宜的数学算法方面不会有问题。在一个实施方案中，用于获得评估乳腺癌中使用的数学算法的统计方法选自DA(即线性、二次、规则判别分析)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、PLS(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林方法、助推方法)、或广义线性模型(即对数回归)。

本发明提供了LINC01781或LINC02014在筛选治疗乳腺癌的候选药物中的应用，包括如下步骤：

用待筛选物质处理表达或含有LINC01781或LINC02014基因的体系；和

检测所述体系中LINC01781或LINC02014基因的表达；

其中，若所述待筛选的物质可以抑制LINC01781或LINC02014基因的表达水平(优选显著降低，如低20％以上，较佳的低50％以上；更佳的低80％以上)，则表明该候选物质是治疗直肠腺癌的候选药物。所述体系选自：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

所述候选物质包括(但不限于)：针对LINC01781或LINC02014基因或其上游或下游基因设计的干扰分子、核酸抑制物、小分子化合物等。

本发明提供了LINC01781或LINC02014在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。所述药物包括了LINC01781或LINC02014的抑制剂，以及药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体包括(但不限于)稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与乳腺癌相关的基因标志物

1、样品收集

分别收集4例Luminal B型乳腺癌的癌组织及相对应的正常组织样本(距离肿瘤边缘5公分)，进行高通量测序，所有患者术前未进行化疗、放疗以及内分泌治疗，所有患者均知情同意，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意，病人信息如表1所示。

表1样本信息

2、RNA样品的制备及质量分析

使用TRIZOL法提取组织总RNA

1)用剪刀组织剪碎，加入1ml Trizol,振荡器上震荡1min；常温放置10min，使核蛋白体完全分解。

2)加入200μl三氯甲烷(氯仿)，盖紧管盖，剧烈震荡15s，常温静置10min。

3)4℃，11000rpm离心15min。

4)将水样层转移到一个新的离心管中，加入500μl异丙醇；颠倒混匀后，常温静置10min。

5)4℃，11000rpm离心15min。

6)用枪小心吸走液体，留沉淀在管底，加入1ml 75％的乙醇，在振荡器上震荡5s，洗涤沉淀一次。

7)4℃，8000rpm离心5min。

8)将上清小心去掉，干燥沉淀10min，加入适量的水溶解沉淀10min。

9)检测RNA浓度，鉴定RNA的产量和纯度。

3、cDNA文库的构建及测序

1)总RNA DNase I消化：利用DNase I消化Total RNA样品中存在的DNA片段，磁珠纯化回收反应产物，最后溶解于DEPC水；

2)去除rRNA：取消化好的Total RNA样品，使用Epicentre的Ribo-Zero试剂盒去除rRNA，去除之后进行Agilent 2100检测，验证rRNA去除效果；

3)RNA打断：取上一步样品，加入打断Buffer，置于PCR仪中进行热打断，打断到140-160nt；

4)反转录一链的合成：向打断后的样品中加入适量引物，充分混匀后在Thermomixer适温反应一定时间，使之打开二级结构并与引物结合，再加入提前配制的一链合成反应体系Mix，在PCR仪上按相应程序合成一链cDNA；

5)反转录二链的合成：配制二链合成反应体系，在Thermomixer上适温反应一定时间，合成带有dUTP的二链cDNA，反应产物用磁珠进行纯化回收；

6)末端修复：配制末端修复反应体系，在Thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，对反转录得到的cDNA双链的粘性末端进行修复，末端修复产物用磁珠进行纯化回收，最后将样品溶于EB Solution；

7)cDNA 3’末端加“A”：配制加“A”反应体系，在Thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，使末端修复的产物cDNA的3’末端加上A碱基；

8)cDNA 5’adapter的连接：配制接头连接反应体系，在Thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，使接头与A碱基连接，产物用磁珠进行纯化回收；

9)UNG消化cDNA二链：配制UNG消化反应体系，通过UNG酶消化掉双链DNA中的二链，并用磁珠对产物进行纯化回收；

10)PCR反应及产物回收：配制PCR反应体系，选择适当的PCR反应程序，对上步骤得到的产物进行扩增，对PCR产物进行磁珠纯化回收，回收产物溶于EB溶液中，贴上标签。

11)文库质量检测：使用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System对文库质量进行检测；

12)上机测序：检测合格的文库，加入NaOH变性成单链，按照预期上机数据量，稀释至一定的上机浓度。变性稀释后的文库加入到FlowCell内，与FlowCell上的接头杂交，在cBot上完成桥式PCR扩增，最后使用Illumina Hiseq x-ten平台进行测序。

4、生物信息学分析

1)用cutadapt对reads的5’和3’段进行trim，trim掉质量<20的碱基，并且删掉N大于10％的reads；

2)hisat2比对到参考基因组上。参考基因组来自于Ensembl数据库，基因组版本GRCh38，基因注释信息为Ensemble 92；

3)stringtie定量lncRNA的表达量并标准化输出；

4)edgeR包比较对照组跟疾病组lncRNA的表达差异，差异变动lncRNA的筛选标准是|log2FC|>1且pvalue<0.05。

5、结果

测序数据如表2所示，生物信息学分析发现，LINC01781和LINC02014在乳腺癌患者中表达显著上调，提示LINC01781和LINC02014可以作为可能的检测靶标应用于乳腺癌的早期诊断。

表2测序数据

实施例2 QPCR测序验证LINC01781和LINC02014基因的差异表达

1、按照实施例1的收集方式收集的25例luminal B型乳腺癌患者癌组织样本和正常组织样本对LINC01781和LINC02014基因差异表达进行大样本QPCR验证。

2、RNA提取

利用Trizol法提取组织RNA，具体步骤参见实施例1。

3、逆转录：使用TAKARA公司的反转录试剂盒(Takara code：DRR047A)进行操作。

1)去除基因组DNA

在试管中加入5×gDNA Eraser Bμffer 2.0μl，gDNA Eraser 1.0μl，总RNA 1μg，加Rnase Free ddH₂O使总体积至10μl，水浴锅中42℃加热2min。

2)反转录反应

将Buffer 2 4.0μl，RT Enzyme Mix I 1.0μl，RTPrimer Mix 1.0μl，RNase Free ddH₂O 4.0μl加入上述试管中一起混合共20μl，水浴锅中37℃15min，85℃5s。

4、QPCR扩增

1)引物设计

根据LINC01781、LINC02014和GADPH的基因序列设计引物，其中，选择LINC01781的不同转录本之间的共同区域进行引物设计，具体引物序列如下：

LINC01781基因：

正向引物为5’-CTGCCTCTATACCTCTAA-3’(SEQ ID NO.1)；

反向引物为5’-CTCTTGACATACAGACATT-3’(SEQ ID NO.2)。

LINC02014基因：

正向引物为5’-AACAGGACAGATAAGACA-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物为5’-GCAACAGACTAAGACATT-3’(SEQ ID NO.4)。

GAPDH基因：

正向引物为5’-AATCCCATCACCATCTTCCAG-3’(SEQ ID NO.5)；

反向引物为5’-GAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’(SEQ ID NO.6)。

2)QPCR扩增检验

用Premix Ex Taq^TM II(Takara Code:DRR081)试剂盒配置PCR反应体系，在Thermal CyclerReal Time System扩增仪上进行PCR扩增，反应结束后确认RealTime PCR的扩增曲线和溶解曲线，ΔΔCT法进行相对定量。

配置25μl反应体系：

Premix Ex TaqTM II(2×)12.5μl，正(反)向引物各1μl，DNA模板2μl，灭菌蒸馏水8.5μl。

反应条件：95℃30s，(95℃5s，60℃30s)×40

5、结果

QPCR结果如图1所示，与正常组织相比，LINC01781和LINC02014在乳腺癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同高通量测序结果一致，提示LINC01781和LINC02014可作为生物标志物应用于乳腺癌的诊断和治疗。

其中，LINC01781和LINC02014分别在27例和26例样本中表达上调，所述上调样本中分别包括24例和23例乳腺癌组织样本。

实施例3 LINC01781和LINC02014在乳腺癌细胞系中的表达情况

1、细胞培养

培养Luminal B型乳腺癌的BT474细胞系，细胞在含10％胎牛血清(Gibco公司)的DMEM培养液中，于5％CO₂，37℃的恒温培养箱中进行培养。

2、转染

本申请所用的通用siRNA-NC、siRNA-LINC01781和siRNA-LINC02014购自上海吉码制药技术有限公司，沉默LINC01781和LINC02014的siRNA序列分别如siRNA1(LINC01781)和siRNA2(LINC02014)所示。

如下所示。

siRNA1的序列：

正义链为5’-UUCUGUUACUGGUAUCAGCCA-3’(SEQ ID NO.7)

反义链为5’-GCUGAUACCAGUAACAGAAAA-3’(SEQ ID NO.8)

siRNA2的序列：

正义链为5’-UAUACACUAGAUUUCCAAGCC-3’(SEQ ID NO.9)

反义链为5’-CUUGGAAAUCUAGUGUAUAUU-3’(SEQ ID NO.10)

使用Invitrogen公司的Lipofectamin^TM2000试剂盒提供的方法，将LINC01781和LINC02014的siRNA转染至生长对数期的乳腺癌BT474细胞，细胞转染前准备取培养箱中提前种植在6孔板中的细胞，转染后24h，对6孔板中细胞进行换液并继续培养。将实验分为3组，对照组(BT474)、阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(siRNA1-2)。

4、QPCR检测LINC01781和LINC02014的表达水平

1)RNA的提取

在细胞转染后48h，使用Trizol法提取细胞RNA。

2)QPCR检测步骤同实施例2

5、结果

实验结果如图2所示，对照组(BT474)和阴性对照组(siRNA-NC)之间，LINC01781和LINC02014的表达水平无显著性差异(P>0.05)，相比对照组和阴性对照组，实验组能够显著降低LINC01781和LINC02014的表达水平，差异具有统计学意义(P<0.05)，其中siRNA1和siRNA2进行后续的实验。

实施例4 CCK-8法检测LINC01781和LINC02014基因对乳腺癌细胞增殖的影响

将转染siRNA1和siRNA2的乳腺癌细胞作为实验组，转染siRNA-NC的细胞作为对照组，加入到96孔板中，每孔加入的细胞数量为5000个，每组设置5个复孔。分别用于24h、48h、72h、96h检测时间点检测。

检测时，细胞孔中加入10μl的CCK-8检测液，将96孔板继续放入细胞培养箱中孵育4h左右，用酶标仪检测各孔在450nm波长处的吸光度值并记录数据，根据检测的OD值的平均值，绘制生长曲线。

生长曲线结果显示，实验组在转染siRNA后，细胞的增殖能力明显低于对照组(图3)，说明LINC01781和LINC02014影响乳腺癌细胞的增殖，通过抑制LINC01781和LINC02014的表达可以抑制乳腺癌细胞的增殖。

实施例5 Transwell小室检测LINC01781和LINC02014对细胞迁移及侵袭的影响

1、Transwell小室制备

无菌条件下Matrigel冰浴融化后按1:8比例稀释Matrigel胶，在Transwell上室内部缓慢加入上室底部，铺胶后迅速移入37℃的细胞培养箱中温育至其凝固成胶状。

2、上室加入数量为1×10⁵的100μl细胞悬液，下室加入600μl含10％胎牛血清培养基，每组设置3个复孔，37℃下恒温培养箱内培养24h。

3、染色

取出Transwell用PBS洗2遍，使用多聚甲醛进行固定，加入结晶紫染色，室温染色20min，用PBS漂洗2遍，放入荧光显微镜下观察并计数。

4、结果

Transwell实验结果如图4所示，转染siRNA1的实验组细胞迁移和侵袭数目相比对照组都显著降低(P<0.05)，转染siRNA2的实验组细胞迁移和侵袭数目相比对照组则无显著变化(P>0.05)，说明LINC01781的表达与乳腺癌细胞的迁移和侵袭相关。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 德阳市人民医院

<120> 生物标志物在乳腺癌中的应用

<150> 2019102988899

<151> 2019-04-15

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctgcctctat acctctaa 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctcttgacat acagacatt 19

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aacaggacag ataagaca 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcaacagact aagacatt 18

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aatcccatca ccatcttcca g 21

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gagccccagc cttctccat 19

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

uucuguuacu gguaucagcc a 21

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcugauacca guaacagaaa a 21

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

uauacacuag auuuccaagc c 21

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cuuggaaauc uaguguauau u 21

Claims

1.检测基因表达水平的试剂在制备诊断乳腺癌的产品中的应用，其特征在于，所述基因选自中LINC01781或LINC02014的一种或两种。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂选自：

特异性识别LINC01781或LINC02014的探针；或

特异性扩增LINC01781或LINC02014的引物。

3.根据权利要求1和2所述的应用，其特征在于，所述乳腺癌为Luminal B型乳腺癌。

4.一种诊断乳腺癌的产品，其特征在于，所述产品包括检测样本中的LINC01781或LINC02014的试剂。

5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述试剂包括反转录PCR、实时定量PCR、原位杂交、northern blotting、芯片或高通量测序平台检测LINC01781或LINC02014的试剂。

6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，用实时定量PCR检测LINC01781或LINC02014的试剂至少包括一对特异性扩增LINC01781或LINC02014的引物。

7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述特异性扩增LINC01781的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示，特异性扩增LINC02014的引物如SEQ ID NO.3～4所示。

8.LINC01781或LINC02014在构建预测乳腺癌的计算模型中的应用。

9.LINC01781或LINC02014在筛选治疗乳腺癌的药物中的应用。

10.LINC01781或LINC02014在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。