CN110982898A - 基于ARMS-PCR的MyD88基因L265P突变检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

基于ARMS-PCR的MyD88基因L265P突变检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于ARMS‑PCR的MyD88基因L265P突变检测试剂盒，包含：(1)外周血单个核细胞富集试剂；(2)蛋白酶K；(3)DNA抽提柱；(4)DNA抽提套管；(5)清洗液A；(6)清洗液B；(7)DNA洗脱液；(8)ARMS‑PCR特异性引物Fw；(9)ARMS‑PCR特异性引物Fm；(10)ARMS‑PCR特异性引物R0；(11)ARMS‑PCR反应体系试剂。本发明在特异性引物的3’末端人为地引入了一个错配，以提高其特异性；同时控制反应中DNA模板、引物的浓度均在一个较低的水平以保证其反应的特异性。

Description

基于ARMS-PCR的MyD88基因L265P突变检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于ARMS-PCR的MyD88基因L265P突变检测试剂盒及检测方法。
背景技术
淋巴浆细胞淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma,LPL)/华氏巨球蛋白血症 (
Figure RE-RE-GDA0002394599110000011
macroglobulinemia,WM)是一种血液系统肿瘤性疾病，其发病率和年龄正相关，并具有一定的家族倾向性。在LPL/WM的患者中MyD88基因 L265P突变是最常见的体细胞突变之一，其检出率可达90％以上，且这一突变与肿瘤细胞的生长、存活相关。虽然在如弥漫大B细胞淋巴瘤、IgM型意义未明的单克隆丙种球蛋白血症等其他的一些血液系统疾病中也能有MyD88 L265P突变的检出，但2016年这一突变仍作为一个重要的辅助诊断指标写进了淋巴浆细胞淋巴瘤/华氏巨球蛋白诊断与治疗的专家共识中，因此针对该突变敏感的检测方法是针对相关血液系统疾病的重要辅助诊断指标。
目前用于这一突变检测的Sanger测序法有着检出率低、检测灵敏度差的特点。ARMS-PCR作为一种经典的PCR方法，具有较高的检测敏感性和特异性，且由于其仅需荧光定量PCR仪或扩增仪就能开展的特点，也便于其在一些不便于开展当下以NGS为主的测序法的地区推广。反应的特异性是 ARMS-PCR检测的关键，标本浓度过高、引物设计不佳等都容易使其产生非特异的扩增。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种基于ARMS-PCR的MyD88基因 L265P突变检测试剂盒及检测方法，具有和金标准方法较高的一致性，同时该方法具有灵敏度和特异性较高而成本较低的特点，可作为临床实验室常规检测方法进行开展。
为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种基于ARMS-PCR的 MyD88基因L265P突变检测试剂盒，包含：
(1)外周血单个核细胞富集试剂；
(2)蛋白酶K；
(3)DNA抽提柱；
(4)DNA抽提套管；
(5)清洗液A；
(6)清洗液B；
(7)DNA洗脱液；
(8)ARMS-PCR特异性引物Fw；
(9)ARMS-PCR特异性引物Fm；
(10)ARMS-PCR特异性引物R0；
(11)ARMS-PCR反应体系试剂。
优选的，步骤(1)中，所述外周血单个核细胞富集试剂采用Ficoll试剂。
其中，步骤(8)中，所述ARMS-PCR特异性引物Fw为：
Fw：5’-gtgcccatcagaagcgcct-3’。
其中，步骤(9)中，所述ARMS-PCR特异性引物Fm为：
Fm:5’-gtgcccatcagaagcgccc-3’。
其中，步骤(10)中，所述ARMS-PCR特异性引物R0为：
R0:5’-GACGTGTCTGTGAAGTTGGCATCTC-3’。
其中，步骤(11)中，所述ARMS-PCR反应体系试剂包括：
DNA模板，Power SYBR Green预混酶液，1μM的上游、下游引物，去离子无酶水。
进一步，所述ARMS-PCR反应体系试剂为20μl，包括DNA模板2μl，Power SYBR Green预混酶液10μl，1μM的上游、下游引物各1μl(野生型和突变型上游引物分别加入不同体系中)，去离子无酶水6μl。
本发明实施例还提供一种利用上述的试剂盒检测基因L265P突变的方法，包括如下步骤：
(a)应用外周血单个核细胞富集试剂富集4-6mL外周血中单个核细胞；
(b)抽提总DNA；
(c)采用ARMS-PCR方法检测基因L265P突变。
其中，步骤(c)中ARMS-PCR反应条件为：94℃2min，1个循环；94℃ 30s，63℃30s，72℃30s，40个循环；72℃5分钟，1个循环，最后降温至40℃。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：
1、本发明建立的ARMS-PCR法和“金标准”方法进行比对验证，证明了本发明的检测方法具有和金标准方法较高的一致性，同时该方法具有灵敏度和特异性较高而成本较低的特点，可作为临床实验室常规检测方法进行开展。
2、本发明的ARMS-PCR作为一种经典的PCR方法，具有较高的检测敏感性和特异性，且由于其仅需荧光定量PCR仪或扩增仪就能开展的特点，也便于其在一些不便于开展当下以NGS为主的测序法的地区推广。反应的特异性是ARMS-PCR检测的关键，标本浓度过高、引物设计不佳等都容易使其产生非特异的扩增。因此，本发明在特异性引物的3’末端人为地引入了一个错配，以提高其特异性；同时控制反应中DNA模板、引物的浓度均在一个较低的水平以保证其反应的特异性。
附图说明
图1为本发明中检测试剂盒的结构示意图；
图2(a)所示为MyD88基因L265P突变阳性；
图2(b)所示为未检测到MyD88基因L265P突变阳性；
图3(a)所示为该临床诊断为LPL/WM患者免疫固定电泳及骨髓图片结果，箭头所注为电泳可见IgM－kappa型M带；
图3(b)所示为该LPL/WM患者骨髓涂片结果，箭头所注为浆样淋巴细胞(瑞氏吉姆萨染色400x)；
图3(c)所示为LPL/WM患者的传统Sanger测序结果，检测结果为野生型；
图3(d)为LPL/WM患者使用本发明方法检测结果，检测处MyD88基因L265P突变。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。
实施例1
如图1所示，一种基于ARMS-PCR的MyD88基因L265P突变检测试剂盒，包含：1、外周血单个核细胞富集试剂；2、蛋白酶K；3、DNA抽提柱； 4、DNA抽提套管；5、清洗液A；6、清洗液B；7、DNA洗脱液；8、ARMS-PCR 特异性引物Fw；9、ARMS-PCR特异性引物Fm；10、ARMS-PCR特异性引物R0；11、ARMS-PCR反应体系试剂。
其中，所述ARMS-PCR特异性引物分别为：
Fw:5’-gtgcccatcagaagcgcct-3’；
Fm:5’-gtgcccatcagaagcgccc-3’；
R0:5’-GACGTGTCTGTGAAGTTGGCATCTC-3’。
其中，所述ARMS-PCR反应体系试剂包括：DNA模板2μl，Power SYBR Green预混酶液10μl，1μM的上游、下游引物各1μl(野生型和突变型上游引物分别加入不同体系中)，去离子无酶水6μl，共计20μl。
利用上述的试剂盒检测基因L265P突变的方法，包括如下步骤：
(a)应用外周血单个核细胞富集试剂富集4-6mL外周血中单个核细胞；
(b)抽提总DNA；
(c)采用ARMS-PCR方法检测基因L265P突变，
其中，ARMS-PCR反应体系：DNA模板2μl，Power SYBR Green预混酶液10μl，1μM的上游、下游引物各1μl(野生型和突变型上游引物分别加入不同体系中)，去离子无酶水6μl，共计20μl。ARMS-PCR反应条件：94℃2min， 1个循环；94℃30s，63℃30s，72℃30s，40个循环，；72℃5分钟，1个循环，最后降温至40℃。
使用上述方法对浓度调整为10ng/μl的OCI-LY19细胞系DNA(含MyD88 基因L265P突变)进行20次检测，将突变孔反应曲线的循环数阈值(cycle threshold,Ct值)<32定义为检测到突变；32≤Ct＜35定义为建议进行复检； Ct≥35定义为低于检出下限如图2所示，其中图2(a)所示为MyD88基因 L265P突变阳性，图2(b)所示为未检测到MyD88基因L265P突变阳性。
实施例2
一种基于ARMS-PCR的MyD88基因L265P突变检测试剂盒及检测方法，组成与实施例1相同。
使用上述方法对突变比例为0％、25％、75％和100％的混合质粒分别进行 Sanger测序和ARMS-PCR检测，结果显示，两方法的一致性为100％(表1)，表明本研究设定的ARMS-PCR方法具有和临床“金标准”方法具有较好的一致性。
表1，ARMS－PCR方法正确度验证表
Figure RE-RE-GDA0002394599110000051
实施例3
一种基于ARMS-PCR的MyD88基因L265P突变检测试剂盒及检测方法，组成与实施例1相同。
使用上述方法对浓度调整为10ng/μl，突变比例分别为0％、1％、2％、5％、 10％、20％和100％的混合质粒检测的结果显示，突变比例为1％的混合质粒 Ct值>32的比例较多，而2％的混合质粒，其判断为“检测到突变”的比例＞ 95％；而突变比例5％～100％的混合质粒的符合度为100％。因此定义2％为该方法的检出下限。
21，ARMS－PCR方法分析度验证表
Figure RE-RE-GDA0002394599110000052
实施例4
一种基于ARMS-PCR的MyD88基因L265P突变检测试剂盒及检测方法，组成与实施例1相同。
使用上述方法对1例临床确证华氏巨球蛋白血症患者进行检测，其Sanger 测序法由于检测灵敏度所限，检出结果为阴性。而本方法检测出患者存在MyD88基因L265P突变，如图3所示，其中，图3(a)所示为该临床诊断为 LPL/WM患者免疫固定电泳及骨髓图片结果，箭头所注为电泳可见IgM－ kappa型M带；图3(b)该LPL/WM患者骨髓涂片结果，箭头所注为浆样淋巴细胞(瑞氏吉姆萨染色400x)；图3(c)所示为LPL/WM患者的传统 Sanger测序结果，检测结果为野生型；图3(d)为LPL/WM患者使用本发明方法检测结果，检测处MyD88基因L265P突变。本发明的ARMS-PCR作为一种经典的PCR方法，具有较高的检测敏感性和特异性，且由于其仅需荧光定量PCR仪或扩增仪就能开展的特点，也便于其在一些不便于开展当下以NGS为主的测序法的地区推广。反应的特异性是ARMS-PCR检测的关键，标本浓度过高、引物设计不佳等都容易使其产生非特异的扩增。因此，本发明在特异性引物的3’末端人为地引入了一个错配，以提高其特异性；同时控制反应中DNA模板、引物的浓度均在一个较低的水平以保证其反应的特异性。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种基于ARMS-PCR的MyD88基因L265P突变检测试剂盒，其特征在于，包含：
(1)外周血单个核细胞富集试剂；
(2)蛋白酶K；
(3)DNA抽提柱；
(4)DNA抽提套管；
(5)清洗液A；
(6)清洗液B；
(7)DNA洗脱液；
(8)ARMS-PCR特异性引物Fw；
(9)ARMS-PCR特异性引物Fm；
(10)ARMS-PCR特异性引物R0；
(11)ARMS-PCR反应体系试剂。
2.根据权利要求1所述的基于ARMS-PCR的MyD88基因L265P突变检测试剂盒，其特征在于，步骤(1)中，所述外周血单个核细胞富集试剂采用Ficoll试剂。
3.根据权利要求1所述的基于ARMS-PCR的MyD88基因L265P突变检测试剂盒，其特征在于，步骤(8)中，所述ARMS-PCR特异性引物为：
Fw:5’-gtgcccatcagaagcgcct-3’。
4.根据权利要求1所述的基于ARMS-PCR的MyD88基因L265P突变检测试剂盒，其特征在于，步骤(9)中，所述ARMS-PCR特异性引物为：
Fm:5’-gtgcccatcagaagcgccc-3’。
5.根据权利要求1所述的基于ARMS-PCR的MyD88基因L265P突变检测试剂盒，其特征在于，步骤(10)中，所述ARMS-PCR特异性引物为：
R0:5’-GACGTGTCTGTGAAGTTGGCATCTC-3’。
6.根据权利要求1所述的基于ARMS-PCR的MyD88基因L265P突变检测试剂盒，其特征在于，步骤(11)中，所述ARMS-PCR反应体系试剂包括：
DNA模板，Power SYBR Green预混酶液，1μM的上游、下游引物，去离子无酶水。
7.根据权利要求6所述的基于ARMS-PCR的MyD88基因L265P突变检测试剂盒，其特征在于，所述ARMS-PCR反应体系试剂为20μl，包括DNA模板2μl，Power SYBR Green预混酶液10μl，1μM的上游、下游引物各1μl，去离子无酶水6μl。
8.一种利用权利要求1～7中任一项所述的试剂盒检测基因L265P突变的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)应用外周血单个核细胞富集试剂富集4-6mL外周血中单个核细胞；
(b)抽提总DNA；
(c)采用ARMS-PCR方法检测基因L265P突变。
9.根据权利要求8所述的检测基因L265P突变的方法，其特征在于，步骤(c)中ARMS-PCR反应条件为：94℃2min，1个循环；94℃30s，63℃30s，72℃30s，40个循环；72℃5分钟，1个循环，最后降温至40℃。
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