KR20080042777A

KR20080042777A - 질환의 유전 소인 고-처리량 분석 및 그 결과에 적합한예방 처치 알고리즘 소프트웨어 프로그램 그리고 이들을포함하는 워크스테이션

Info

Publication number: KR20080042777A
Application number: KR1020080030340A
Authority: KR
Inventors: 박민구; 이지원
Original assignee: 박민구
Priority date: 2008-04-01
Filing date: 2008-04-01
Publication date: 2008-05-15

Abstract

본 발명은 질환 상관 계수(Disease correlation coefficient)와 위험 변수(Risk value)의 연산으로 산출되는 질환별 위험 예측 표지 대립유전자들의 유전 지수(Genetic index)로부터 도출되는 질환 감수성 예측치(Susceptibility expected value) 데이터, 식이(Dietetics), 영양(Nutrition), 기왕력, 가족병력, 질환양태 등에 대한 데이터, 그리고 검사 대상 질환과 관련된 일반임상검사 결과 데이터가 저장되는 데이터베이스 모듈, 상기 3개 그룹의 자료를 통합 분석하여 질환별 유전 소인을 종합 평가하고 이에 적절한 기능성 식이, 영양 및 생활습관 레시피를 도출하는 알고리즘 소프트웨어 프로그램을 포함하는 중앙처리장치 모듈, 그리고 DNA 추출 모듈, 멀티플렉스 PCR 모듈, 고-처리량 단일 염기 다형성(SNP) 분석 모듈로 구성된 워크스테이션 시스템을 제공한다.

기능성 식이, 영양, 고-처리량, 단일 염기 다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP), 멀티플렉스 PCR, 질환 감수성 예측치, 분석 워크스테이션.

Description

질환의 유전 소인 고-처리량 분석 및 그 결과에 적합한 예방 처치 알고리즘 소프트웨어 프로그램 그리고 이들을 포함하는 워크스테이션{High-throughput analysis of genetic disposition of diseases and suitable treatment algorithm software program thereof and workstation comprising same}

본 발명은 질환 위험 예측 표지 유전자의 단일 염기 다형성을 고-처리량으로 분석할 수 있는 워크스테이션 시스템에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 이 워크스테이션을 통해 식이(Dietetics), 영양(Nutrition), 기왕력(Anamnesis), 가족병력, 질환양태 등에 대한 임상문진 데이터, 검사 대상 질환과 관련된 일반임상검사 결과 데이터, 그리고 질환 위험 예측 표지 대립유전자들의 SNP 유전형 분석 결과 등 3가지 주요 데이터 그룹의 자료를 통합 분석하여 질환 감수성 등급 판정 및 이에 적합한 예방 처치 레시피를 도출하는 방법, 단계, 알고리즘 소프트웨어 프로그램, 및 분석장비로 구성된 모듈 및 상기 모두를 포함하는 워크스테이션 시스템에 관한 것이다.

유전체(genome)는 유전자(gene)로, 유전자는 DNA(deoxyribonucleic acid)로, DNA는 뉴클레오타이드(nucleotide)로, 뉴클레오타이드는 아데닌(adenine), 시토신(cytosine), 구아닌(guanine), 티민(thymine) 4개의 염기(base)가 유전정보에 따라 당-인산(sugar-phosphate) 뼈대(backbone)에 연결되어 구성된다.

2003년 완료된 인간 게놈 프로젝트(human genome project)의 결과로, 인간의 DNA는 31.6 억개의 뉴클레오타이드(nucleotide)로 구성되어 있으며 이로부터 2.5 만개 내외의 유전자(gene)가 인코딩(encoding)되고 모든 인간의 DNA 염기서열의 99.9%는 동일한 것으로 보고되었다(International Human Genome Sequencing Consortium, Nature(2004), 431(7011):931-45).

이러한 0.1%의 차이가 개인, 집단, 인종간 유전적 다형성(polymorphism)을 나타내며 질환 감수성(susceptibility)과 약물 대사(drug metabolism)의 개체간 차이 등을 포함하는 표현형(phenotype)과 관련되어 있는 것으로 알려지고 있다.

다형성에는 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism, 이하 SNP 표기), 단기 일렬 반복(short tandem repeats, STR) 다형성 등이 알려져 있다. 인간 DNA 다형성의 90% 이상은 단일 염기 다형성(SNP)으로 나타나며 이는 비만, 당뇨, 심혈관계 질환, 고혈압, 암과 같은 다인자 질환(multifactorial disorder)과 관련이 있는 것으로 보고되고 있다. 인간의 경우 평균 1.2 kb(kilo base pair)마다 1회의 빈도로 SNP가 발생하는 것으로 알려져 있는데 이는 이론적으로 3백만개의 SNP가 인간 게놈(genome)상에 존재한다는 걸 의미한다.

단일 염기 변이의 빈도가 인구의 1% 이상의 빈도로 나타날 경우 SNP로 분류하는데 SNP는 돌연변이율도 낮고 인간 게놈(genome)상에 거의 균일하게 많은 수가 존재하기 때문에 기존의 마이크로새틀라이트 표지인자(microsatellite marker)보다 질병관련 유전자 분석용 표지인자로 더 유용하다.

SNP의 1/3은 코딩 영역(coding region) 서열에 발생하고 2/3는 비코딩 영역(non-coding region) 서열에서 발생하는데, SNP가 코딩 영역(coding SNP)에서 발생할 경우 결함이 있거나 변이 단백질이 발현될 수 있으며, 프로모터(promoter) 영역 등 전사 활성(transcription activity) 조절에 관계하는 조절부위 SNP(regulatory SNP)가 비코딩 영역 SNP 중에서 특히 중요하다. '코딩 영역 SNP'와 '조절부위 SNP' 분석을 통해 질환관련 유전자, 약물 대사 및 부작용에 대한 연구, 새로운 약물 치료법 개발 그리고 개인별 SNP 변이 유무에 근거한 질환 감수성 판별 등이 가능하게 된다.

질병의 직접적인 발병 원인 혹은 발병율을 증가시키는 요인으로 작용하는 유전자를 규명하는 방법 중에 대립 유전자(allele) 관련성(association) 연구는, 특정 질병을 가진 집단내의 특정 표지인자(marker) allele의 빈도수가 정상 집단과 차이가 있을 경우 해당 표지인자 가까이에 질병 유전자가 존재할 가능성이 큰 원리를 이용하는 것이다(Hirschhorn J. N. et al. Nat. Rev. Genet. (2005) 6:95-108, Davey Smith G. et al. Lancet (2005) 366:1484-1498). SNP는 질병과 관련된 대립유전자 관련성 연구에 가장 적합한 연구 수단(tool)인데 특히 유전적인 영향(genetic factor)뿐만이 아니라 환경적인 요인(environmental factor)이 작용하는 다인자 질환(multifactorial disorder)이나 여러 유전자가 동시에 발병 기전에 작용하는 다중 유전자(polygenic) 질환의 연구에 유용한 것으로 평가받고 있다( Lai E. et al. Nat. Genet. (2002) 32(3):353, Suh Y. et al. Mutat Res. (2005) 573(1-2):41-53).

20세기 의학이 암을 비롯한 각종 만성 복합질환이 발병된 이후 항암제 등의 약물을 통한 '치료의 시대'였으나, 21세기는 질병에 대한 개인의 유전적 소인(disposition) 분석결과에 따라 맞춤형 대응(customized intervention)을 추구하는 '예방의 시대'가 될 것으로 전문가들은 예상하고 있다. 만성 성인질환에 대한 기존 검사법은 호르몬, 생리 활성물질 등을 측정하는 현상학적(phenomenological) 결과에 의존하는 미시적인 검사방법이고 검사 대상 항목도 제한적이었다. 이는 검사결과에 대한 신뢰도가 만족스럽지 못한 것으로 귀결되었다. 최근에는 영양(nutrition), 식이(dietetics), 생활습관(life style)이 독립적인 영역이 아니고 상호작용을 한다는 영양유전학(nutrigenetics)의 기조(tenet) 아래, 만성 성인질환에 대한 예방 차원의 연구가 활발히 진행되고 있다(Muller M. et al. Nature Rev. (2003) 4:315-322, German J. B. et al. J. Am. Dietet. Assn. (2005) 105:530-531). 영양소(nutrients)-유전자 상호작용에 있어서, 몇몇 영양소 또는 이의 대사산물(metabolite)이 리간드(ligand)로 작용하여 전사 인자(transcription factor)와 결합하는 것이 대표적인 기전이다. 전사 인자는 유전자의 프로모터(promoter) 부위에 존재하는 결합 부위(binding region)에 결합하여 프로모터가 조절하게되는 유전자의 발현을 증가 또는 감소시키는 작용을 하는데, 영양소 또는 이로부터 유래한 대사산물은 전사인자와 결합을 함으로써 특정 유전자의 전사 과정에 영향을 주게 된다.

SNP를 포함한 부모로부터 물려받은 유전 정보는 거의 고정 불변하기에 질환 의 이환율(morbidity rate)을 감소시키기 위한 수단으로, 질환에 대한 유전적 감수성이 높은 잠재적 환자들의 개인별 유전 소인 분석 결과를 토대로 이에 적절한 식이(dietetics), 영양(nutrient) 및 생활습관을 권고함으로써 질병에 대한 대처를 하자는 것이 영양유전학의 근본 취지이다. 근래에 "식이 및 영양이 개인의 건강에 미치는 영향은 개인의 유전적 구성(makeup)에 의존적이다"라는 영양유전학의 주요 기조를 뒷받침하는 임상결과들이 보고되고 있다(Kaput J. et al. Physiol. Genomics (2004) 16:166--177, Ordovas J. M. et al. Am. J. Clin. Nutr. (2006) 83(Suppl):443S-446S). 아포지단백질 A-1(APOA1) 유전자의 SNP가 불포화 지방산(polyunsaturated fatty acids)의 대사에 영향을 주어 혈액내 고밀도지단백질-콜레스테롤(HDL-cholesterol) 수준이 개인마다 유전형에 따라 차이가 발생함을 보고한 연구가 매우 적절한 예가 될 수 있다(Ordovas J. M. Am. J. Clin. Nutr. (2002) 75:38-46).

또한 만성 성인질환은 다인자 질환으로서 유전적인 영향뿐만이 아니라 환경적인 요인이 작용하기에 환경 요인 및 생활습관에 대한 개인별 자료 수집이 병행되어야 한다.

본 발명은 질환 위험 예측 표지 대립유전자들의 SNP를 질환별로 그룹화(categorized)하고, 이를 비교분석함으로써 개인별 특정 만성 질환에 대해 어느 정도의 감수성(susceptibility)이 있는지 여부를 판정하는 방법과 이를 포함하는 워크스테이션을 제공한다. 또한 본 발명은 SNP 분석결과에 따른 질환 이환 위험도를 수치화한 임상 데이터베이스(database)를 제공하고 그 위험도를 상쇄하거나 완화시킬 수 있는 적절한 식이(dietetics), 영양(nutrients) 및 생활습관(life style)을 도출하는 알고리즘(algorithm) 소프트웨어 프로그램을 제공한다.

본 발명은 1회에 1종의 SNP만을 분석할 수 있었던 종래의 방법과 대별되는 고-효율, 고-처리량(high-throughput) 분석 장비가 모듈(module)형태로 연동되는 워크스테이션 시스템을 통해 1회에 최대 384종의 SNP 분석이 가능한 멀티플렉스 분석방법 및 이를 구현하는 워크스테이션을 제공하고자 한다.

또한 유전 요인 외에 환경요인과 일반 임상 결과를 통합 분석하는 알고리즘을 통해 질환 이환 위험도를 상쇄하거나 경감시킬 수 있는 기능성 식이, 영양 및 생활습관 레시피를 도출하고자 한다.

상기 목적을 구현하기 위해서, 본 발명은 식이, 영양, 기왕력, 가족병력, 질환양태 등에 대한 문진 데이터, 검사 대상 질환과 관련된 일반임상검사 결과, 질환 위험 예측 표지 대립유전자들의 질환 상관 계수(DCC) 및 위험 변수(RV) 등이 입력되거나 연산 처리된 후 결과 수치가 저장되는 데이터베이스 모듈(10)과,

검체로부터 핵산을 추출하는 자동화 DNA 순수분리 모듈(20),

상기 DNA 시료를 이용하여 분석 대상 질환 위험 예측 표지 대립유전자들을 다중증폭하는 멀티플렉스 PCR 모듈(21),

상기 증폭 산물을 이용한 질환 위험 예측 표지 대립유전자들의 SNP 유전자형 고-처리량 분석 단계 및 이를 수행하는 고-처리량 SNP 분석 모듈(22),

질환 상관 계수(DCC)와 질환 위험 예측 표지 대립유전자들의 SNP 유전형에 따른 위험 변수(RV)를 대입한 유전 지수(GI), 그리고 이로부터 질환 감수성 예측치(SEV)를 연산하는 단계, 그리고 상기 데이터와 문진 정보, 일반임상검사 결과를 통합 분석하여 질환별 유전 소인을 종합 평가하는 알고리즘, 그리고 해당 유전 소인에 적절한 기능성 식이, 영양 및 생활습관 레시피를 도출하는 소프트웨어 프로그램 및 이를 포함하는 중앙처리장치 모듈(30),

분석 결과가 디스플레이되거나 출력 수단이 결합된 디스플레이/출력부(40),

워크스테이션 시스템의 조작부(50),

그리고 상기 모두가 연동되는 워크스테이션 시스템을 제공한다.

본 발명에 따른 워크스테이션 시스템을 통해 유전 요인 외에 환경요인과 일반 임상 결과의 통합 분석이 가능하며, 질환별 유전 소인 종합 평가에 따라 이에 적절한 기능성 식이, 영양 및 생활습관 레시피를 제공함으로써 질환 이환 위험도 그룹별 적절한 조절(intervention)이 가능해지고 그에 따른 질환의 위험을 예방하거나 경감시킬 수 있다.

이하 도면 및 표를 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명한다. 본 명세서에 기재된 도면, 표 및 실시예에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

또한 본 발명이 청구하는 범위내에서 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변형의 실시가 가능하며 이러한 변형은 본 발명의 범위에 속한다.

< 실시예 1> 문진을 통한 임상정보와 일반임상검사 데이터의 축적

만성 성인질환은 복합형질질환으로서 질환의 원인을 규명하는데 있어서 유전요인뿐만이 아니라 환경적인 요인을 고려해야 하므로 식이(dietetics), 영양(nutrition), 생활습관, 기왕력, 가족병력 등에 대한 기본적인 문진 정보와 만성 성인질환의 진단에 중요한 임상검사 항목들을 질환별로 실시(11)하여 그 데이터 수치들을 워크스테이션 데이터베이스(10)에 파일링한다(표 1 참조). 이러한 환경요인을 포함한 기본 임상정보들은 이후 단계에서 도출되는 만성 질환 위험도의 증가와 상관성이 높은 대립유전자들의 SNP 결과(22)와 통합된 후, 종합분석 알고리즘을 거쳐 최종적으로 유전소인과 환경요인이 반영된 질환 이환도를 예방하거나 경감할 수 있는 개인별 기능성 식약품 및 생활습관 처방 리포트가 도출된다(도 1, 2 참조).

워크스테이션 데이터베이스(10)는 또한 세계 최대의 의학 및 생명과학 전반의 문헌 데이터베이스인 PubMed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=PubMed)의 질환 위험 감수성 관련있는 유전자 연구 검색 결과와 이를 통합한 메타-분석(meta-analysis)자료들로 부터 선별한 질환 위험 예측 표지 유전자 및 NCBI의 Entrez SNP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=snp) 등으로부터 검색된 SNP 위 치, 대립유전자 빈도 및 대표 연구 논문등에 대한 자료등이 파일링되어있다. 이러한 데이터에 기초하여 질환 위험 감수성의 증가와 관련된 분석 대상 유전자들을 추출한 후, 질환 위험 예측 대립유전자들을 선정하고 2X2 교차분석(case-control study)과 판별 분석(logistic regression)을 통해 분석 대상 위험 대립유전자들을 최종 선정하였다.

기본 문진정보	기왕력 및 가족병력	일반임상검사 (심혈관계질환)	일반임상검사 (항산화/해독)	일반임상검사 (염증)	일반임상검사 (골다공증)
□ 신장(cm)	□ 암	□ hsCRP(high sensitivity C-reactive protein, mg/L log scale)	□ antioxidant test	□ hsCRP(high sensitivity C-reactive protein, mg/L log scale)	□ 혈청 오스테오칼신(serum osteocalcin)
□ 몸무게(kg)	□ 심혈관계질환(고지혈증, 동맥경화증, 고혈압 포함)	□ 호모시스테인(homocysteine)	□ BMI(Body Mass Index, kg/m²)	□ elastase, granulocyte (ug/L)	□ urine DPD(deoxypyridinoline)
□ 허리둘레 (inch)	□ 뇌졸중	□ pro-BNP (Pro-Brain Natriuretic Peptide)			□ BMI(Body Mass Index, kg/m²)
□ 혈압 (수축기/이완기 mmHg)	□ 당뇨 (1형, 2형)	□ HDL-콜레스테롤(mmol/L)			□ serum leptin(ng/mL)
□ 공복혈당 (mg/dL)	□ 중증 비만				□ 흡연습관 (갑/일)
□ 주간 운동 빈도(회, 평균시간)	□ 골다공증				□ 칼슘 섭취량(mg/일)
□ 신체상태 (정상, 임신, 수유, 폐경, 성장발달, 갱년)	□ 합병증
□ 1일 야채/과일 섭취 빈도(회)	□ 기타
□ 흡연습관 (갑/일)
□ 현재 섭취하는 건강기능식품(영양제 포함)
□ 직업군 (영업직, 사무직, 생산직, 가정주부 등)

< 실시예 2> 자동화 장비를 통한 임상 검체로부터 게노믹 DNA 분리

본 발명이 구성하는 워크스테이션(도 1 참조)에 포함되는 DNA 추출 모듈(20)은 혈액, 조직, 체액(body fluid) 등 다양한 검체로부터 게노믹 DNA를 추출하는 반자동 또는 자동화 장비이다. 신뢰도가 높은 검사 결과를 도출하기 위해서는 양질의 적절한 농도의 DNA가 확보되어야 하기에 자동화 장비를 사용하였다.

스핀 칼럼(spin column) 방식으로 DNA를 추출하는 경우, 0.1 - 0.2 mL 부피의 시료를 96-웰 또는 384-웰 플레이트(well plate)에 검체 수만큼 첨가하여 모듈에 위치시켰다. 이후 8-채널 피펫팅 헤드(pipetting head)가 피펫 팁 랙(tip rack)의 피펫을 장착한 후 시료를 분해하는 TL 완충용액(buffer) 100 uL를 흡인하여 상기 라이시스(lysis) 플레이트의 각 웰에 첨가하여 풀어주고 단백분해효소 K(Proteinase K, 100 mg/mL) 10 uL를 첨가하고 반응액을 피펫으로 업 앤 다운 5회를 통해 혼합하고 10분간 반응시킨다. 이후 반응물에 TB 완충용액 400 uL를 첨가하고 반응물을 혼합한다. 이어서 반응물을 96-웰 스핀 칼럼(spin column) 플레이트의 상층부에 로딩(loading)하고 진공 펌프(vacuum pump)를 통해 DNA를 제외한 반응액은 칼럼 하단부를 통해 폐액 저장기(waste reservoir)로 용출하고 DNA는 멤브레인(membrane)에 결합된다. 칼럼 멤브레인에 결합된 DNA를 세척하기 위해 BW 완충용액 700 uL를 첨가하고 25 킬로파스칼(kPa)의 압력이 작용하는 진공 펌프를 통해 완충용액을 용출하고 이를 반복한다. 이후 멤브레인으로부터 불순물을 제거하는 NW 완충용액 400 uL를 첨가하고 역시 진공 상태에서 완충용액을 용출시킨다. 최종단계로 DNA를 용출시키기 위해 탈이온(de-ionized) 멸균 3차 증류수 100 uL를 로딩하고 실온에서 5분 처리하고 진공상태에서 순수 DNA를 용출하여 멀티플렉스 PCR 반응 전까지 보관하였다.

마그네틱 비드(magnetic bead) 방식으로 DNA를 추출하는 경우, 0.01 - 0.02 mL 부피의 시료를 96-웰 또는 384-웰 플레이트(well plate)에 검체 수만큼 첨가하여 모듈에 위치시켰다. 이후 8-채널 피펫팅 헤드(pipetting head)가 피펫 팁 랙(tip rack)의 피펫을 장착한 후 시료를 분해하는 완충용액 믹스(mix) 500 uL를 흡인하여 상기 라이시스(lysis) 플레이트의 각 웰에 첨가하여 10분간 반응시킨다. 반응 도중 반응액을 피펫으로 업 앤 다운 15회 반복하면서 혼합하여 반응을 촉진한다. 이후 마그네틱 비드가 포함된 반응액 70 uL를 첨가하고 피펫으로 혼합한 뒤 1분간 실온에서 정치한 후 마그네틱 분리기(separator)가 작동되고 추가로 2분간 반응한다. 비드를 제외한 상층액을 폐액 저장기(waste reservoir)로 용출하여 제거하고 마그네틱 분리기의 작동을 중단한다. 이후 단백분해효소 K가 포함되지 않은 라이시스(lysis) 완충용액 500 uL를 첨가하고 마그네틱 비드가 균일하게 퍼지도록 피펫으로 혼합한다. 그리고 정제 완충용액 50 uL를 첨가하고 피펫으로 혼합한 뒤 1분간 실온에서 정치한 후 마그네틱 분리기(separator)가 작동되고 추가로 2분간 반응한다. 상기와 마찬가지로 비드를 제외한 상층액을 폐액 저장기(waste reservoir)로 용출하여 제거하고 마그네틱 분리기의 작동을 중단한다. 이후 세척 완충용액 500 uL를 첨가하고 마그네틱 분리기가 작동되어 불순물을 제거하는 과정을 2회 반복한다. 최종 과정으로 DNA를 회수하기 위해 용출 완충용액 100 uL를 로딩하고 피펫으로 업 앤 다운 50회를 반복하면서 실온에서 5분 처리하고 순수 DNA를 포함하는 상층액이 회수되어 멀티플렉스 PCR 반응 전까지 보관하였다.

< 실시예 3> 멀티플렉스 PCR 을 통한 질환 위험 표지 유전자 증폭

본 발명에 따른 만성 성인질환의 질환별 발병 위험 표지 유전자들의 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응(multiplex polymerase chain reaction, 멀티플렉스 PCR)에 대한 일실시예는 다음과 같다. 본 실시예에 나타낸 만성 성인질환은 심혈관계질환, 항산화 및 해독 기전, 염증반응 그리고 골다공증을 포함한다.

DNA 추출 모듈(20)로부터 시료 DNA를 포함하고 있는 96-웰 인풋(input) 플레이트를 멀티플렉스 PCR 모듈(21)로 이동시킨다(도 1 참조). 프리메이드(pre-made) PCR 마스터믹스(mastermix)와 시료 DNA가 96-웰 PCR 반응 아웃풋(output) 플레이트의 목적하는 웰로 첨가되어 반응물이 조제되고 아웃풋 플레이트를 PCR 기기에 장착하여 질환 위험 예측 표지 유전자들을 증폭하는 것이 멀티플렉스 PCR 모듈(21) 내부의 분석과정 흐름이다. 본 실시예에 기술하는 만성 성인질환의 멀티플렉스 PCR을 위한 프리메이드 PCR 마스터믹스의 구성 조성은 표2, 3, 4와 같다.

심혈관계 질환 8종 멀티플렉스 PCR 반응액 조성 및 PCR 조건

PCR 반응액 조성	부피(uL)	PCR 반응 조건
탈이온 3차 멸균 증류수	5	초기변성 (Initial denaturation)	95℃, 15분	1회
심혈관계질환 8종 프라이머 프리믹스(primer premix) ; 표 5 서열목록번호 (정방향/역방향 프라이머 ) 1번/2번, 3번/4번, 5번/6번, 7번/8번, 9번/10번, 11번/12번, 15번/16번, 17번/18번	5	변성 (Denaturation)	95℃, 30초	35회
2X 멀티플렉스 PCR 프리믹스	15	결합 (Annealing)	58℃, 40초
주형 DNA(40 ng 이상)	5	연장 (Extension)	72℃, 40초
최종 부피	30	최종연장 (Extension)	72℃, 7분	1회

항산화 및 해독 기전 7종 멀티플렉스 PCR 반응액 조성 및 PCR 조건

PCR 반응액 조성	부피(uL)	PCR 반응 조건
탈이온 3차 멸균 증류수	6	초기변성 (Initial denaturation)	95℃, 15분	1회
항산화 및 해독 기전 7종 프라이머 프리믹스(primer premix) ; 표 5 서열목록번호 (정방향/역방향 프라이머 ) 19번/20번, 21번/22번, 23번/24번, 25번/26번, 13번/14번, 27번/28번, 29번/30번	4	변성 (Denaturation)	95℃, 30초	35회
2X 멀티플렉스 PCR 프리믹스	15	결합 (Annealing)	58℃, 30초
주형 DNA(40 ng 이상)	5	연장 (Extension)	72℃, 30초
최종 부피	30	최종연장 (Extension)	72℃, 5분	1회

염증반응 및 골다공증 5종 멀티플렉스 PCR 반응액 조성 및 PCR 조건

PCR 반응액 조성	부피(uL)	PCR 반응 조건
탈이온 3차 멸균 증류수	7.5	초기변성 (Initial denaturation)	95℃, 15분	1회
염증반응 및 골다공증 5종 프라이머 프리믹스(primer premix) ; 표 5 서열목록번호 (정방향/역방향 프라이머 ) 31번/32번, 33번/34번, 35번/36번, 37번/38번, 39번/40번	2.5	변성 (Denaturation)	95℃, 50초	35회
2X 멀티플렉스 PCR 프리믹스	15	결합 (Annealing)	58℃, 60초
주형 DNA(40 ng 이상)	5	연장 (Extension)	72℃, 60초
최종 부피	30	최종연장 (Extension)	72℃, 10분	1회

멀티플렉스 PCR 모듈(21) 덱(deck)의 시약(reagents) 플레이트에 위치하는 탈이온 3차 멸균 증류수, 2X 멀티플렉스 PCR 프리믹스(premix), 프라이머 프리믹스 가 순차적으로 각각의 용기(bottle)로부터 8-채널 피펫팅 헤드(pipetting head)에 장착된 20 uL 또는 200 uL 피펫 팁을 통해 PCR 아웃풋 플레이트로 분주(transfer)된다. 시료 DNA는 96-웰 인풋(input) DNA 플레이트로부터 PCR 아웃풋 플레이트로 분주되며 PCR 반응 셋업(setup)을 마친 아웃풋 플레이트는 ABI GeneAmp 2720 PCR 기기(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)로 옮겨져 유전자 증폭반응이 개시된다. 모든 시료는 duplicate 또는 triplicate으로 분석하여 분석 오류를 방지하였다. 반응별로 NTC(No template control) 음성 대조군과 인간베타글로빈 유전자를 사용한 내부 대조군(internal control) 그리고 각 유전자별 양성 대조군을 포함시켰다. 멀티플렉스 PCR 반응액 혼합물에 포함되는 PCR 완충용액의 최종농도는 50 mM KCl, 3.5 mM MgCl₂, 10mM Tris-HCl, pH 8.2이며, 2.5 unit의 Taq 중합효소, 300 uM dNTPs(Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany), 10 mg/mL 소혈청알부민(Bovine serum albumin)을 포함한다.

본 발명에 따른 만성 성인질환의 질환 위험 예측 표지 유전자들의 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 고 처리량 분석을 위해 우선적으로 해당 유전자들의 증폭이 선행되어야 하며 성공적인 분석법 세팅에 프라이머들의 성공적인 디자인이 매우 중요하였다. 본 실시예에 따른 프라이머 세트들은 미국 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 SNP 데이터베이스인 Entrez SNP, 일본의 DDBJ(The DNA Data Bank of Japan, 그리고 유럽연합의 EMBL(the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) 염기서열 데이터베이스로부터 검색된 질환별 위험 예측 표지 유전자들의 SNP 정보 및 관련 염기서열을 분석하여 제작하였다. 해당 유전자별로 가급적 SNP 부위와 근접한 5' 및 3' 방향의 염기서열 부위를 프라이머 타겟 부위로 지정하고 프라이머 프리미어(Primer premier version 5, Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA), 디엔에이시스 맥스 (DNASIS MAX Version 2.7, MiraiBio Group, South San Francisco, CA, USA) 프로그램을 응용하여 특이적(specific) 프라이머를 디자인하였다. 프라이머 선발 조건은 다음과 같다 ; 프라이머 길이(18 - 25 base pair), 융해온도[Tm(℃), 58 - 63℃], 3' 말단의 GC 함량이 높지 않아야하며, 프라이머 서열내 염기 4개 이상 연속해서 상보적이지 않도록 해서 이차구조 형성을 방지하였으며, 3'말단에 동일한 염기가 3개 이상 연속해서 위치하지 않도록 해서 프라이머 이합체(dimer)의 형성을 방지하였다. 또한 프라이머 염기서열이 본 발명의 바람직한 실현을 위해 포함되는 타 유전자와 cross-reactive 하지 않도록 검증을 거쳤다. 합성이 끝난 프라이머들은 몰디-토프(MALDI-TOF, Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight)를 통해 불순물 함유 여부를 확인하고, 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)로 정제한 후 사용하였다(Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA).멀티플렉스 PCR에 관하여 본 일실시예에 포함되는 프라이머(primer)들의 염기서열목록 정보는 표 5와 같다.

서열 목록 번호	타겟 유전자명 ( SNP locus )	프라이머 방향, 염기서열(5'-3')	길이
1	5,10-methylenetetrahydrofolate reductase (exon 4)	정방향, TGA AGG AGA AGG TGT CTG CGG GA	23
2	5,10-methylenetetrahydrofolate reductase (exon 4)	역방향, AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG	20
3	5,10-methylenetetrahydrofolate reductase (exon 7)	정방향, GGG AGG AGC TGA CCA GTG CAG	21
4	5,10-methylenetetrahydrofolate reductase (exon 7)	역방향, GGG GTC AGG CCA GGG GCA G	19
5	Cholesteryl ester transfer protein, plasma precursor (intron 1)	정방향, CAC TAG CCC AGA GAG AGG AGT GCC	24
6		역방향, CTG AGC CCA GCC GCA CAC TAA C	22
7	Angiotensin I converting enzyme (intron 16)	정방향, CTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT	24
8	Angiotensin I converting enzyme (intron 16)	역방향, GAT GTG GCC ATC ACA TTC GTC AGA T	25
9	Angiotensin I converting enzyme (intron 16)	정방향, TGG GAC CAC AGG CGC CCG CCA CTA C	25
10	Angiotensin I converting enzyme (intron 16)	역방향, TCG CCA GCC CTC CCA TGC CCA TAA	24
11	5-methyltetrahydrofolate-homocysteine methyltransferase (exon 26)	정방향, GGT GTG TTC CCA GCT GTT AGA TG	23
12		역방향, GAC ACT GAA GAC CTC TGA TTT GAA C	25
13	Superoxide dismutase 2, mitochondrial (mitochondrial targeting sequence)	정방향, CAG CCC AGC CTG CGT AGA CG	20
14		역방향, GCG TTG ATG TGA GGT TCC AG	20
15	Apolipoprotein C-III precursor (3' UTR of exon 4)	정방향, CAT GGT TGC CTA CAG AGG AGT TC	23
16	Apolipoprotein C-III precursor (3' UTR of exon 4)	역방향, TTG ACC TTC CGC ACA AAG C	19
17	Apolipoprotein AV (promoter)	정방향, GGA GCT TGT GAA CGT GTG TAT GAG T	25
18	Apolipoprotein AV (promoter)	역방향, CCC CAG GAA CTG GAG CGA AAT T	22
19	Glutathione S-transferase Mu 1 (exon 6, 7)	정방향, GAA CTC CCT GAA AAG CTA AAG C	22
20	Glutathione S-transferase Mu 1 (exon 6, 7)	역방향, GTT GGG CTC AAA TAT ACG GTG G	22
21	Glutathione S-transferase theta 1 (exon 4, 5)	정방향, TTC CTT ACT GGT CCT CAC ATC TC	23
22	Glutathione S-transferase theta 1 (exon 4, 5)	역방향, TCA CCG GAT CAT GGC CAG CA	20
23	Glutathione S-transferase pi 1 (exon 5)	정방향, ACC CCA GGG CTC TAT GGG AA	20
24	Glutathione S-transferase pi 1 (exon 5)	역방향, TGA GGG CAC AAG AAG CCC CT	20
25	Nitric oxide synthase 3 ,endothelial cell (exon 7)	정방향, AAG GCA GGA GAC AGT GGA TGG A	22
26	Nitric oxide synthase 3 ,endothelial cell (exon 7)	역방향, CCC AGT CAA TCC CTT TGG TGC TCA	24
27	Cytochrome P450, family 1, subfamily A, polypeptide 1 (3' end)	정방향, CAG TGA AGA GGT GTA GCC GC	20
28		역방향, TAG GAG TCT TGT CTC ATG CC	20
29	Cytochrome P450, family 1, subfamily A, polypeptide 1 (exon 7)	정방향, GAA GCT ATG GGT CAA CCC ATC	21
30		역방향, CTA AGA GCG CAG CTG CAT TTG	21
31	Tumor necrosis factor alpha (promoter)	정방향, AGG CAA TAG GTT TTG AGG GCC AT	23
32	Tumor necrosis factor alpha (promoter)	역방향, TCC TCC CTG CTC CGA TTC CG	20
33	Vitamin D (1,25-dihydroxyvitamin D3) receptor (intron 8)	정방향, AAC TTG CAT GAG GAG GAG CAT GTC	24
34	Vitamin D (1,25-dihydroxyvitamin D3) receptor (intron 8)	역방향, GGA GAG GAG CCT GTG TCC CAT TTG	24
35	Vitamin D (1,25-dihydroxyvitamin D3) receptor (exon 2)	정방향, AGC TGG CCC TGG CAC TGA CTC TGC TCT	27
36	Vitamin D (1,25-dihydroxyvitamin D3) receptor (exon 2)	역방향, ATG GAA ACA CCT TGC TTC TTC TCC CTC	27
37	Vitamin D (1,25-dihydroxyvitamin D3) receptor (exon 9)	정방향, CAG AGC ATG GAC AGG GAG CAA G	22
38	Vitamin D (1,25-dihydroxyvitamin D3) receptor (exon 9)	역방향, GCA ACT CCT CAT GGC TGA GGT CTC	24
39	Alpha 1 type I collagen preproprotein (intron 1)	정방향, TAA CTT CTG GAC TAT TTG CGG ACT TTT TGG	30
40	Alpha 1 type I collagen preproprotein (intron 1)	역방향, GGG CGA GGG AGG AGA GAA	18

심혈관계질환 멀티플렉스 PCR 반응을 위한 프라이머(primer) 프리믹스에 포함되는 8종 정방향/역방향 프라이머들의 혼합비율은 다음과 같다. 서열목록번호 1번/2번 2.5 pmole each, 3번/4번 4 pmole each, 5번/6번 7 pmole each, 7번/8번 12 pmole each, 9번/10번 8 pmole each, 11번/12번 10 pmole each, 15번/16번 6 pmole each, 17번/18번 4 pmole each의 최종농도를 갖도록 조제하였다. 항산화 및 해독 기전 멀티플렉스 PCR 반응을 위한 프라이머(primer) 프리믹스에 포함되는 7종 정방향/역방향 프라이머들의 혼합비율은 다음과 같다. 서열목록번호 19번/20번 4 pmole each, 21번/22번 9 pmole each, 23번/24번 6 pmole each, 25번/26번 5 pmole each, 13번/14번 4 pmole each, 27번/28번 11 pmole each, 29번/30번 6 pmole each의 최종농도를 갖도록 하였다. 염증반응 및 골다공증 질환 멀티플렉스 PCR 반응을 위한 프라이머(primer) 프리믹스에 포함되는 5종 정방향/역방향 프라이머들의 혼합비율은 다음과 같다. 서열목록번호 31번/32번 6 pmole each, 33번/34번 10 pmole each, 35번/36번 4 pmole each, 37번/38번 12 pmole each, 39번/40번 4 pmole each의 최종농도를 갖도록 조제하였다.

< 실시예 4> 질환 위험 표지 유전자들에 대한 고-처리량 SNP 분석

상기 실시예 3을 통해 질환 위험 예측 표지 유전자들의 SNP 타겟 부위들이 당해 발명의 바람직한 구성에 따른 멀티플렉스 PCR 모듈(21)을 통해 3회 반응만으로 총 21종의 SNP 분석 타겟 유전자들을 증폭할 수 있었다. 멀티플렉스 PCR을 통해 증폭된 질환 위험 예측 SNP 대립유전자들을 1회에 1종의 SNP만을 분석할 수 있었던 종래의 비효율적 분석과 대별되는 고-효율, 고-처리량(high-throughput) SNP 분석 모듈(22)을 통해 분석하였다. 본 발명이 추구하는 고-처리량 SNP 분석 모듈(22)은 다양한 분석 플랫폼(platform)을 지원할 수 있으며 본 실시예에서는 3가지 분석 방법에 대한 일실시예들을 나타내었다.

1) RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism) 분석

실시예 3을 통해 증폭된 질환 위험 예측 SNP 대립유전자들을 멀티플렉스 반응 튜브별로 증폭 산물만을 순수분리하는 과정을 거친후, 해당 SNP 분석에 적합한 제한효소를 처리하여 유전형을 판정하였다. PCR 증폭 산물로부터 프라이머(primer), 염(salt), dNTPs를 제거하기 위해 Montage PCR₉₆ Cleanup Kit(Millipore, Danvers, MA, USA, Cat No. LSKC 096 24)를 사용하였다. 증폭산물을 멀티스크린₉₆ PCR 플레이트로 이동시킨 후 멀티스크린 매니폴드(manifold)에 끼워 맞추고 진공 압력(609 토르)을 5 - 10분 가해서 증폭산물을 플레이트로부터 용출시키고 증폭산물은 플레이트의 멤브레인에 결합하여 잔류하도록 처리하였다. 이후 탈이온 3차 멸균 증류수 100 uL를 첨가하고 플레이트 교반기로 1,000 rpm, 5분간 교반한 후 제한효소 처리 전까지 냉장보관하였다. 순수 정제된 증폭 산물로부터 해당하는 제한효소(New England Biolabs, Beverly, MA, USA)를 처리하여 질환 위험 예측 SNP 대립유전자들의 유전형 판정 과정은 표 6과 같다. 제한효소 처리 후 절단(digestion)된 DNA 단편들은 해당 크기별로 0.8 - 3% 아가로스 젤 전기영동을 통해 정확한 길이(size)를 판별하였다.

질환 위험 예측 SNP 분석용 대립유전자	대립 유전자 유전형 ( RFLP 단편 크기)	대립 유전자 빈도	SNP 분석을 위한 RFLP 반응조건
5,10-methylenetetrahydrofolate reductase	677CC(wild type) : 198bp 677CT(hetero) : 198, 175, 23bp 677TT(mutant) : 175, 23bp	C : T = 0.68: 0.32	제한효소 : HinfI, 10U 완충용액 : NEB buffer 2 반응온도 : 37℃ 반응시간 : 2시간
5,10-methylenetetrahydrofolate reductase	1298AA(wild type) : 138bp 1298AC(hetero) : 138, 119, 19bp 1298CC(mutant) : 119, 19bp	A : C = 0.84 : 0.16	제한효소 : Fnu4HI, 10U 완충용액 : NEB buffer 4 반응온도 : 37℃ 반응시간 : 2시간
Cholesteryl ester transfer protein, plasma precursor	B2B2(wild type) : 535bp B2B1(hetero) : 535, 361, 174bp B1B1(mutant) : 361, 174bp	B2 : B1 = 0.62 : 0.38	제한효소 : TaqI, 10U 완충용액 : NEB buffer 4 반응온도 : 65℃ 반응시간 : 4시간
Angiotensin I converting enzyme	Insertion : 490bp Ins/Del : 490, 190bp Deletion : 190bp	Ins : Del = 0.58 : 0.42	해당없음
Angiotensin I converting enzyme	Insertion : 337bp	Ins : Del = 0.58 : 0.42	해당없음
5-methyltetrahydro folate-homocysteine methyltransferase	2756AA(wild type) : 265bp 2756AG(hetero) : 265, 180, 85bp 2756GG(mutant) : 180, 85bp	A : G = 0.84 : 0.16	제한효소 : HaeIII, 10U 완충용액 : NEB buffer 2 반응온도 : 37℃ 반응시간 : 2시간
Superoxide dismutase 2, mitochondrial	(-9)CC(wild type) : 172bp (-9)CT(hetero) : 172, 87, 85bp (-9)TT(mutant) : 87, 85bp	C : T = 0.51 : 0.49	제한효소 : BsaWI, 10U 완충용액 : NEB buffer 2 반응온도 : 60℃ 반응시간 : 4시간
Apolipoprotein C-III precursor	3238CC(wild type) : 591bp 3238CG(hetero) : 591, 366, 225bp 3238GG(mutant) : 366, 225bp	C : G = 0.79 : 0.21	제한효소 : SacI, 10U 완충용액 : NEB buffer 1 반응온도 : 37℃ 반응시간 : 2시간
Apolipoprotein AV	(-1131)TT(wild type) : 133, 21bp (-1131)TC(hetero) : 154, 133, 21bp (-1131)CC(mutant) : 154bp	T : C = 0.75 : 0.25	제한효소 : MseI, 10U 완충용액 : NEB buffer 2 반응온도 : 65℃ 반응시간 : 4시간
Glutathione S-transferase Mu 1	보유형(wild type) : 215bp null(mutant) : 증폭산물 없음	+/+ : 0/0 = 0.46 : 0.54	Direct PCR
Glutathione S-transferase Theta 1	보유형(wild type) : 480bp null(mutant) : 증폭산물 없음	+/+ : 0/0 = 0.47 : 0.53	Direct PCR
Glutathione S-transferase Pi 1	1578AA(wild type) : 176bp 1578AG(hetero) : 176, 91, 85bp 1578GG(mutant) : 91, 85bp	A : G = 0.79 : 0.21	제한효소 : BsmAI, 10U 완충용액 : NEB buffer 3 반응온도 : 55℃ 반응시간 : 4시간
Nitric oxide synthase 3 (endothelial cell)	894GG(wild type) : 163, 85bp 894GT(hetero) : 248, 163, 85bp 894TT(mutant) : 248bp	G : T = 0.87 : 0.13	제한효소 : BanII, 10U 완충용액 : NEB buffer 4 반응온도 : 37℃ 반응시간 : 2시간
Cytochrome P450, family 1, subfamily A, polypeptide 1	3801TT(wild type) : 340bp 3801TC(hetero) : 340, 200, 140bp 3801CC(mutant) : 200, 140bp	T : C = 0.71 : 0.29	제한효소 : MspI, 10U 완충용액 : NEB buffer 2 반응온도 : 37℃ 반응시간 : 2시간
Cytochrome P450, family 1, subfamily A, polypeptide 1	2455AA(wild type) : 286bp 2455AG(hetero) : 286, 157, 129bp 2455GG(mutant) : 157, 129bp	A : G = 0.84 : 0.16	제한효소 : BsrDI, 10U 완충용액 : NEB buffer 2 반응온도 : 65℃ 반응시간 : 4시간
Tumor necrosis factor-alpha	(-308)GG(wild type) : 87, 20bp (-308)GA(hetero) : 107, 87, 20bp (-308)AA(mutant) : 107bp	G : A = 0.91 : 0.09	제한효소 : NcoI, 10U 완충용액 : NEB buffer 4 반응온도 : 37℃ 반응시간 : 2시간
Vitamin D (1,25-dihydroxy vitamin D3) receptor	bb(wild type) : 475, 338bp Bb(hetero) : 813, 475, 338bp BB(mutant) : 813bp	b : B = 0.94 : 0.06	제한효소 : BsmI, 10U 완충용액 : NEB buffer 2 반응온도 : 65℃ 반응시간 : 4시간
Vitamin D (1,25-dihydroxy vitamin D3) receptor	FF(wild type) : 265bp Ff(hetero) : 265, 196, 69bp ff(mutant) : 196, 69bp	F : f = 0.66 : 0.34	제한효소 : FokI, 10U 완충용액 : NEB buffer 4 반응온도 : 37℃ 반응시간 : 2시간
Vitamin D (1,25-dihydroxy vitamin D3) receptor	TT(wild type) : 495, 245bp Tt(hetero) : 495, 245, 205bp tt(mutant) : 290, 245, 205bp	T : t = 0.95 : 0.05	제한효소 : TaqI, 10U 완충용액 : NEB buffer 3 반응온도 : 65℃ 반응시간 : 4시간
Alpha 1 type I collagen preproprotein	SS(wild type) : 264bp Ss(hetero) : 264, 246, 16bp ss(mutant) : 246, 16bp	S : s = 0.98 : 0.02	제한효소 : FokI, 10U 완충용액 : NEB buffer 4 반응온도 : 37℃ 반응시간 : 2시간

2) SNaPshot 분석

실시예 3을 통해 증폭된 질환 위험 예측 SNP 대립유전자들을 멀티플렉스 반응 튜브별로, 증폭 산물만을 순수분리하는 과정을 통해 반응에 참여하지 못한(unincorporated) 프라이머와 dNTPs를 제거하였다. 슈림프 알칼라인 포스파테이즈(Shrimp alkaline phosphatase)와 엑소뉴클리에이즈 I (Exonuclease I)으로 구성된 ExoSAP-IT(USB Corp., Cleveland, OH, USA, Cat. No 78201) 4 uL와 멀티플렉스 PCR 반응 산물 10 uL를 혼합한 후 37℃, 1시간 반응하여 상기 분순물들을 가수분해하고 80℃, 15분 반응을 통해 효소들을 불활성화시키고 4℃ 보관하였다. 얼음위에 위치시킨 96-웰 플레이트의 각 웰에 순수 정제한 PCR 산물 3 uL와 SNaPshot multiplex ready rxn mix 5 uL(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA, Cat. No. 4323154), SNaPshot 프라이머 혼합물 1 uL, 탈이온 3차 멸균 증류수 1 uL를 첨가하였다. 이어서 해당 플레이트를 GeneAmp 9700 thermal cycler(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)에 장착하고 96℃, 10초, 50℃, 5초, 60℃, 30초 thermoprofile로 25 사이클 증폭하면서 단일 염기 연장(single-base extension)기술을 통해 SNP 유무를 분석하였다(표 7 참조).

SNaPshot 반응액 조성	부피(uL)	SNaPshot 반응 조건
탈이온 3차 멸균 증류수	1	변성 (Denaturation)	95℃, 10초	25회
SNaPshot 멀티플렉스 프라이머 프리믹스(primer premix)	1
2X SNaPshot 멀티플렉스 ready rxn mix	5	결합 (Annealing)	50℃, 5초
순수정제 멀티플렉스 PCR 산물	3	연장 (Extension)	60℃, 30초
최종 부피	30

이후 상기와 동일한 과정으로 ExoSAP-IT 처리를 통해 여분의 형광 표지된 ddNTPs를 제거하였다. SNaPshot 반응에 사용한 형광 dye는 다음과 같다. ddATP는 dR6G dye(green color), ddCTP는 dTAMRA(black color), ddGTP는 dR110(blue color), ddTTP 또는 ddUTP는 dROX(red color)로 형광 표지된 반응 조성액 믹스를 사용하였다. 단일 염기 연장 반응을 마친 SNaPshot 산물 0.5 uL에 GeneScan 120-LIZ size 스탠다드 0.5 uL 그리고 Hi-Di formamide 9 uL를 첨가하고 혼합한 후 95℃, 5분 반응을 통해 DNA를 단일가닥으로 변성시키고 4℃ 보관하였다. 이어서 상기 mixture를 ABI 3100 Genetic Analyzer(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용한 모세관 전기영동(capillary electrophoresis)으로 SNP 유전형을 판정하였다. POP4 폴리머가 충진된 36 cm 모세관을 포함하는 SNP36_POP4 module과 DS-02 매트릭스 스탠다드를 사용하고 분석 프로그램으로 GeneMapper 4.0을 제조사의 스탠다드 매뉴얼에 따라 사용하여 질환 위험 예측 표지 유전자들의 SNP 유전자형을 분석하였다.

3) Pyrosequencing 분석

파이로시퀀싱을 통해 질환 위험 예측 SNP 대립유전자들을 고-처리량 분석하기 위해서는 멀티플렉스 PCR 단계(21)에서 반응에 포함하는 대립유전자별 정방향 또는 역방향 프라이머 중 어느 한쪽은 5'-바이오틴(biotin)이 결합된 프라이머를 사용하여 이후 파이로시퀀싱 분석단계에서 스트렙트아비딘 세파로스 비드(bead)와의 결합을 유도하였다. 바이오틴이 결합되어있는 멀티플렉스 PCR 산물 30 uL와 스트렙트아비딘이 결합되어 있는 세파로즈 비드(Streptavidin Sepharose HP, GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, USA) 3 uL, 비드 결합 완충용액(bead binding buffer, 10 mM Tris-HCl pH 7.6, 2 M NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% Tween 20) 37 uL 그리고 탈이온 3차 멸균 증류수 10 uL를 혼합하고 1,400 rpm, 상온 10분간 교반함으로써 멀티플렉스 PCR 산물과 비드의 결합을 촉진하였다. 반응액으로부터 비드를 회수(isolation)하기 위해 필터 프로브(filter probe)에 캡쳐한 후, 진공 필트레이션 시스템(Vacuum Prep Tool, Biotage AB, Uppsala, Sweden)을 통해 70% 에탄올/5초, 0.2N NaOH/5초, 1X PSQ 세척 완충용액(10 mM Tris-acetate pH 7.6)/5초 처리하여 washing하였다. 이후 순수분리된 비드를 PSQ 96-웰 플레이트 로우(plate low)의 해당 웰로 분주하였다. 플레이트 로우의 각 웰에는 질환 위험 예측 SNP 대립유전자별로 1종의 시퀀싱 프라이머(final 10 pmole/reaction)와 어닐링 완충용액(20 mM Tris-acetate, 2 mM Magnesium acetate, pH 7.6) 45 uL를 미리 분주해 두었다. 상기 시퀀싱 프라이머/비드 혼합물을 90℃, 2분 열 변성시킨후 실온으로 cooling하였다. 시퀀싱 프라이머가 어닐링된(annealed) DNA에 엑소뉴클리에이즈가 결여된 클리나우 DNA 중합효소(Exonuclease-deficient Klenow DNA polymerase), 어피레이즈(apyrase), 루시퍼레이즈(luciferase), ATP 설퓨릴레이즈(ATP sulfurylase), 기질(substrate) 및 dNTPs를 첨가하고, 이후 파이로시퀀싱 제조사(PyroMark ID, Biotage AB, Uppsala, Sweden)의 표준 매뉴얼에 따라 질환 위험 예측 SNP 대립유전자들의 유전형을 고-처리량 분석하였고 최종결과는 PSQ 96 MA SNP 소프트웨어를 통해 유전형을 판별하였다.

< 실시예 5> 문진정보, 일반임상검사 결과, 질환 위험 예측 유전자들의 SNP 유전형에 따른 위험 변수 및 SNP 대립유전자별 질환 상관 계수등의 정보들을 통합하는 알고리즘 소프트웨어를 통한 개인별 질환 예방 처치

만성 성인질환은 복합형질질환으로서 질환의 원인을 규명하는데 있어서 유전요인뿐만이 아니라 환경적인 요인을 고려해야 하므로 식이(dietetics), 영양(nutrition), 기왕력, 가족병력, 검사 대상 질환과 관련있는 기본 체크항목(예를 들면 골다공증 질환의 경우, 흡연습관, 칼슘 섭취량, 체질량지수 등)에 대한 기본적인 문진 정보와 만성 성인질환의 진단에 중요한 일반임상검사 항목들을 질환별로 실시(11)하여 그 데이터 수치들을 워크스테이션 데이터베이스(10)에 파일링하였다(표 1 참조). 환경요인을 포함한 상기의 기본 임상정보들은 이후 단계에서 도출되는 만성 질환 위험도의 증가와 상관성이 높은 질환 위험 예측 표지 유전자들의 SNP 분석결과(22)와 통합된 후, 종합분석 알고리즘 소프트웨어 프로그램(30)을 거쳐 최종적으로 유전소인과 환경요인이 반영된 질환 감수성 위험도를 상쇄하거나 경감할 수 있는 개인별 적절한 식이(dietetics), 영양(nutrients) 및 생활습관 처방 리포트가 도출되는 것이 본 발명의 기술적 흐름이다(도 1, 2 참조).

1) 질환 위험 예측 표지 대립유전자들의 질환 상관 계수(DCC, disease correlation coefficient) 설정

질환의 유전 소인을 정확하게 분석하기 위해서 질환과 상관성이 있는 것으로 보고되어온 수많은 연구논문들과 또한 이 자료들을 토대로 통계학적 분석을 거친 메타 연구자료들로부터 분석 대상 SNP들을 선별하고 이들로부터 질환 위험 예측의 목적 달성 가능성이 매우 높은 위험 대립유전자들(risk alleles)을 추출하였다. 연구논문 검색은 1950년대 이후로 전세계 의학 및 생명과학 전반에 걸쳐 총 1,700만 문헌 인용(citation)정보를 보유하고있는 미국 국립 의학 도서관(U.S. NLM)의 NCBI PubMed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=pubmed)를 이용하였다.

미국 과학정보연구소(Institute for Scientific Information)가 세계 과학기술분야 학술지에 게재된 논문들의 색인을 수록한 데이터베이스인 SCI(Science Citation Index)를 통해 특정 논문이나 책이 얼마나 많이 인용되었는지 검색이 가능하며 따라서 해당 연구자료의 질을 반영하는 자료로 활용가능하다. 또한 특정 저널에 실린 논문들이 다른 저널의 논문들에 얼마나 많이 인용되었는지를 나타내는 인용지수(impact factor)를 통해 해당 과학논문의 질을 평가할 수 있다.

따라서, 본 발명의 바람직한 실현을 위해서, 상기 일실시예들에 포함된 질환 위험 예측 표지 대립유전자들의 질환 상관 계수(DCC, disease correlation coefficient)는 다음과 같은 개념에 근거하여 산출된 수치이다. PubMed를 기준으로 해당 대립유전자의 변이와 그에 따른 질환 감수성 변화에 대한 임상적 연구결과를 포함하는 문헌 보고 횟수(hits)가 500례 이하일 경우 가중치 1, 1,000례 이하일 경우 가중치 2, 1,500례 미만일 경우 가중치 3, 1,500례 이상일 경우 가중치 4를 부여하였다. 또한 상기 해당 연구논문들 중 SCI에 등재된 저널의 인용지수 평균값을 4분위로 나누고 그에 따른 가중치를 질환 상관 계수 연산 수식에 대입하였다. 인용지수 평균값이 2이하일 경우 가중치 1, 인용지수 평균값이 3이하일 경우 가중치 2, 인용지수 평균값이 4이하일 경우 가중치 3, 인용지수 평균값이 4이상일 경우 가중치 4를 부여하였다. 또한 문헌의 작성형식에 대한 가중치도 부여하였다. 전체 연구 문헌 중에 메타-분석, 임상시험, review 논문의 보고 횟수 빈도를 4분위로 설정하고 그에 따른 가중치도 마찬가지로 질환 상관 계수 연산 수식에 대입하였다. 메타-분석등의 보고 횟수(hits)가 10례 이하일 경우 가중치 1, 20례 이하일 경우 가중치 2, 30례 미만일 경우 가중치 3, 30례 이상일 경우 가중치 4를 부여하였다. 종합분석 알고리즘 소프트웨어 프로그램(30)은 질환 위험 예측 표지 대립유전자들의 질환 상관 계수를 하기의 연산과정을 통해 산출한다.

Hf : 해당 질환 위험 예측 표지 대립유전자의 PubMed 보고 hits 가중치^*

IFf : SCI 저널 임팩트 팩터 평균값 4분위 가중치^*

ATf : 메타-분석, 임상연구, 리뷰 논문의 빈도 4분위 가중치^*

Nf : DCC 연산에 포함된 factor 총 합(상기의 경우 3)

^* : 가중치 값과 범위는 상기 내용 참조

질환 위험 예측 표지 대립유전자들의 신규 후보군을 비롯한 기존 그룹들의 질환 상관 계수는 최소 1년에 1회 이상 정기적으로 계수 조정하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 최소 6개월에 1회 이상 재분석을 통한 계수 조정이 필요하다.

2) 질환별 질환 위험 예측 표지 대립유전자들의 질환 상관 계수(DCC) 및 SNP 분석 유전자형에 따른 위험 변수(RV, risk variable)를 적용한 질환 감수성 예측치(SEV, Susceptibility expected value) 연산

질환 위험 예측 표지 대립유전자들의 SNP 분석 유전자형에 따른 위험 변수는 이들의 유전자형이 즉, 염색체에 존재하는 DNA 염기서열이 전사 및 해독과정을 거쳐 이에 상응하는 단백질로 발현되었을 때 이 단백질의 세포내 활성(in vivo enzymatic activity)이 정상 유전자형(wild type)에 비해 어느 정도의 차이가 발생하고 이것이 세포 신호 기전에 어떤 영향을 미치는지에 대한 연구 논문들에 근거하여 산출된 값이다. 일례를 들면, 5,10-Methylenetetrahydrofolate reductase(MTHFR)의 677CT 헤테로 유전자형으로부터 encoding되는 단백질은 정상 유전자형의 단백질에 비해 약 65%의 활성을 가지며, MTHFR 677TT 변이 유전자형으로부터 encoding되는 단백질은 정상 유전자형의 단백질에 비해 약 30%만의 활성을갖는다. 감소된 단백질 활성으로 인해 호모시스테인의 메틸화 기전이 영향을 받아 혈중 호모시스테인의 수준이 최대 25%까지 상승하는 것으로 다수의 연구자 그룹으로부터 반복 확인되고 있다. 이러한 근거를 바탕으로 질환 위험 예측 표지 대립유전자별 위험 변수(RV)를 다음과 같이 설정하였다(표 8 참조). 질환 위험 예측 표지 대립유전자들의 SNP 분석 유전자형에 따른 위험 변수는 최소 1년에 1회 이상 정기적으로 계수 조정하는 것이 바람직하다.

분석대상 만성질환명	질환 위험 예측 표지 대립유전자	정상 유전자형 : 위험 변수 값	헤테로 유전자형 : 위험 변수 값	변이 유전자형 : 위험 변수 값
심혈관계질환	5,10-methylenetetrahydrofolate reductase	677CC : 1	677CT : 4	677TT : 8
	5,10-methylenetetrahydrofolate reductase	1298AA : 1	1298AC : 4	1298CC : 8
	Cholesteryl ester transfer protein, plasma precursor	B2B2 : 1	B2B1 : 2	B1B1 : 3
	Angiotensin I converting enzyme	Ins/Ins : 1 Ins/Del : 2 Del/Del : 3
	5-methyltetrahydrofolate-homocysteine methyltransferase	2756AA : 1	2756AG : 2	2756GG : 4
	Superoxide dismutase 2, mitochondrial	(-9)CC : 1	(-9)CT : 2	(-9)TT : 3
	Apolipoprotein C-III precursor	3238CC : 1	3238CG : 2	3238GG : 3
	Apolipoprotein AV	(-1131)TT : 1	(-1131)TC : 2	(-1131)CC : 3
항산화/해독 기전 그리고 염증반응 공통	Glutathione S-transferase Mu 1	+/+ : 1 0/0 : 3
	Glutathione S-transferase Theta 1	+/+ : 1 0/0 : 3
	Glutathione S-transferase Pi 1	+/+ : 1 0/0 : 3
항산화/해독 기전	Nitric oxide synthase 3 ,endothelial cell	894GG : 1	894GT : 2	894TT : 4
	Cytochrome P450, family 1, subfamily A, polypeptide 1	3801TT : 1	3801TC : 2	3801CC : 3
	Cytochrome P450, family 1, subfamily A, polypeptide 1	2455AA : 1	2455AG : 2	2455GG : 3
염증반응	Tumor necrosis factor alpha	(-308)GG : 1	(-308)GA : 2	(-308)AA : 4
염증반응	Interleukin-6	(-174)GG : 1	(-174)GC : 2	(-174)CC : 3
골다공증	Vitamin D (1,25-dihydroxyvitamin D3) receptor	bb : 1	bB : 2	BB : 3
	Vitamin D (1,25-dihydroxyvitamin D3) receptor	FF : 1	Ff : 2	ff : 3
	Vitamin D (1,25-dihydroxyvitamin D3) receptor	TT : 1	Tt : 2	tt : 3
	Alpha 1 type I collagen preproprotein	SS : 1	Ss : 2	ss : 3

본 발명의 바람직한 실현을 위해서 상기 실시예들에 열거한 만성 성인질환의 유전 소인 고-처리량 분석에 포함되는 4대 질환(심혈관계질환, 항산화 및 해독 기전, 염증반응, 골다공증)에 대한 질환 감수성 예측치(SEV, Susceptibility expected value) 연산은 다음과 같다. 우선, 질환별 질환 위험 예측 표지 대립유전자들의 질환 상관 계수(DCC)와 SNP 분석 유전자형에 따른 위험 변수(RV)를 대입한 해당 대립유전자별 유전 지수 (GI, Genetic index)를 계산한다.

본 발명의 목적에 따른 일 양태로 만성 성인질환에 대한 질환 감수성 예측치(SEV)를 연산하면 다음과 같다. 분석 대상인 질환 위험 예측 표지 대립유전자별 DCC 및 RV 값을 처리하여 GI value를 구한다. 이후 질환 감수성 예측치를 산출할 수 있는데 다음의 함수를 따른다.

GImin : 최소 2개 이상으로 구성된 질환별 위험 예측 표지 대립유전자들의

도출 가능한 GI 최소값 평균. 즉, 해당질환의 분석 대상 대립유전자

들의 분석결과가 모두 정상 유전자형인 경우의 GI value.

GImax : 최소 2개 이상으로 구성된 질환별 위험 예측 표지 대립유전자들의

도출 가능한 GI 최대값 평균. 즉, 해당질환의 분석 대상 대립유전자

들의 분석결과가 모두 변이 유전자형인 경우의 GI value.

GImedian : 최소 2개 이상으로 구성된 질환별 위험 예측 표지 대립유전자들

의 유전 지수(GI) 총합을 대립유전자 총합으로 나눈 중앙값.

4) 문진정보, 일반임상검사 결과, 질환 위험 예측 대립유전자들의 질환 상관계수(DCC) 및 대립유전자들의 SNP 유전형에 따른 위험 변수(RV) 등의 정보들을 통합하는 알고리즘 소프트웨어를 통한 개인별 질환 예방 처치 이를 구현하는 소프트웨어 프로그램

질환별 위험 예측 표지 대립유전자들의 질환 상관 계수(DCC)는 분석에 앞서 산출되어 워크스테이션 데이터베이스(10)에 저장되고 6개월 또는 1년 주기로 재평가(revaluation)하고 그 결과를 반영한다. 또한 분석 의뢰자의 식이(dietetics), 영양(nutrition), 기왕력, 가족병력, 검사 대상 질환과 관련있는 임상문진항목에 대한 데이터와 만성 성인질환의 진단에 중요한 일반임상검사 항목들의 결과들도 분석 초기시점에 워크스테이션 데이터베이스(10)에 저장된다. 이후, 검체 시료로부터 DNA 추출 모듈(20), 멀티플렉스 PCR 모듈(21)과 고-처리량 SNP 분석 모듈(22)을 통해 질환 위험 예측 대립유전자별 SNP 유전자형에 따른 위험 변수(RV)가 도출된다.

유전 소인 분석 및 예방 처치 레시피 판정 프로그램(30)은 워크스테이션 데이터베이스(10)에 파일링되어있는 대립유전자별 질환 상관 계수(DCC) 데이터와 고-처리량 SNP 분석 모듈(22)로부터 도출된 SNP 유전자형에 따른 위험 변수(RV)를 이용하여 질환 위험 예측 표지 대립유전자별 유전 지수 (GI, Genetic index)를 연산한다. 이후, 해당 질환의 유전 소인 분석을 위해 포함된 모든 질환 위험 예측 표지 대립유전자들의 GI value들을 SEV 함수에 적용하여 해당 질환의 감수성 예측치(SEV)를 산출한다. 이어서, 백분율로 도출되는 감수성 예측치(SEV)와 워크스테이션 데이터베이스(10)에 파일링되어있는 임상문진 정보, 일반임상검사 결과들을 통합분석하는 알고리즘 소프트웨어 프로그램(30)을 통해 최종적으로 유전 소인과 환경 요인이 반영된 기능성 식이(functional dietetics), 영양(nutrients) 및 생활습관(life style) 레시피가 추출되고 이를 내과 임상 전문의와 임상 영양학자가 검토를 거쳐 의뢰자의 담당의에게 전달한다. 레시피는 기능성 식이, 영양 및 생활습관으로 구성되며, 정부 또는 공인기관이 식이, 영양성분별로 제정한 최대 무독성량(NOAEL, No observed adverse effect level)과 최저 독성량(LOAEL, Lowest observed adverse effect level)을 불확실 계수(UF, Uncertainty factor)로 나눈 값인 상한 섭취량(UL, Tolerable upper intake level)을 근거로 해당질환의 이환 위험을 상쇄하거나 경감할 수 있는 용량(dose)으로 4분위되어 있으며 In vivo animal model 그리고/또는 인체 임상연구를 통해 검증된 성분을 채택하였다. SEV 40% 미만은 고위험(highly severe) 그룹으로 즉각적인 헬스케어가 필요한 상태, SEV 41 - 60%는 중위험(severe) 그룹, SEV 61 - 80%는 주의(modest) 그룹, SEV 81% 이상은 양호(genetically healthy) 그룹으로 분류되고 그에 적절한 레시피가 도출된다.

도 1은 본 발명에 따른 질환의 유전 소인 고-처리량 분석 및 그 결과에 적합한 예방 처치 알고리즘 소프트웨어 프로그램을 포함하는 워크스테이션의 구성도를 나타낸다. 임상 문진 정보와 일반임상검사 항목들의 결과값이 저장되는 워크스테이션 데이터베이스(10), 분석 검체로부터 DNA를 추출하는 자동화 장비 모듈(20), 분석 대상인 질환 위험 예측 표지 대립유전자들을 증폭하는 멀티플렉스 PCR 모듈(21), 질환 위험 예측 표지 대립유전자들의 고-처리량 SNP 분석 모듈(22), 데이터베이스 정보와 SNP 분석 결과를 통합처리하는 종합분석 알고리즘 소프트웨어 프로그램(30), 디스플레이/출력부(40), 그리고 조작부(50)로 구성된다.

도 2는 본 발명의 구성에 따라 식이(dietetics), 영양(nutrition), 기왕력, 가족병력, 검사 대상 질환관련 체크항목에 대한 기본적인 문진 정보(10), 만성 성인질환의 진단에 중요한 일반임상검사 결과(11), 그리고 질환 위험 예측 표지 대립유전자들의 SNP 유전형 분석결과(22) 등 3가지 주요 결과 그룹으로부터의 정보를 종합하여 질환 감수성 등급 판정(30) 및 이에 적합한 예방 처치 리포트가 도출되는 워크스테이션의 분석 흐름도를 나타낸다.

도 3은 질환 상관 계수(DCC), 위험 변수(RV)를 대입한 유전 지수(GI)로부터 산출된 질환 감수성 예측치(SEV), 문진 정보, 일반임상검사 결과, 그리고 질환 위험 예측 표지 대립유전자 SNP 분석결과가 통합처리되는 논리 흐름을 나타낸다. 최종적으로 해당 질환의 이환 위험을 상쇄하거나 경감시킬 수 있는 예방 처치 레시피가 도출된다.

도 4는 본 발명이 구성하는 워크스테이션의 DNA 추출 모듈(20)로부터 스핀 칼럼 또는 마그네틱 비드 방식으로 분리한 시료 DNA를 아가로스 젤 전기영동을 통해 확인한 결과 예이다.

도 5는 본 발명이 구성하는 워크스테이션의 멀티플렉스 PCR 모듈(21)을 통해 질환 위험 예측 표지 대립유전자들을 증폭한 후, 그 산물을 아가로스 젤 전기영동을 통해 확인하는 결과 예이다. 심혈관계질환 8종, 항산화 및 해독 기전 7종, 그리고 염증 반응 및 골다공증 5종에 대한 멀티플렉스 PCR 결과를 확인하는 젤 사진 예이다. 범례에 나타낸 M은 분자량 마커, NTC는 DNA가 미첨가된 반응 대조군, P는 양성 대조군, S번호 그룹은 검체번호를 나타낸다.

도 6은 본 발명이 구성하는 워크스테이션의 고-처리량 SNP 분석 모듈(22)을 통해서 질환 위험 예측 표지 대립유전자들의 SNP 유전자형 분석이 가능한 3종류의 분석 방법에 따른 결과 예를 나타낸다. 범례에 나타낸 '숫자/숫자'는 표 5에 나타낸 질환 위험 예측 표지 대립유전자별 '정방향/역방향 프라이머 서열목록 번호'를 나타낸다. 일례로 1/2의 경우, 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase의 C677T SNP 유전자형 분석을 위해 사용된 정방향/역방향 프라이머 서열번호를 의미한다. R은 이의 좌측에 위치하는 정방향/역방향 프라이머로 증폭된 대립유전자의 SNP 유전형 분석 결과를 나타낸다.

도 7은 본 발명이 구성하는 워크스테이션의 유전 소인 통합 분석 알고리즘 소프트웨어 프로그램 및 예방 처치 레시피 도출 프로그램 모듈(30)로부터 디스플레이/출력부(40)로 전송되는 분석 결과 보고 형태의 일례를 나타낸다. 분석 대상 질 환명이 도시되는 부분(41), 질환 위험 예측 표지 대립유전자명, 이의 SNP 분석결과 유전형, 분석 결과가 해당 질환의 위험도 증가에 미치는 영향, 해당 유전자의 분포 빈도가 도시되는 부분(42), 질환 위험 예측 표지 대립유전자 SNP 분석을 통해 헤테로 또는 변이 유전자형으로 나타난 경우, 해당 유전형에 따른 임상적 특성을 열거하는 부분(43), 분석 대상 대립유전자들의 질환 감수성 예측치(SEV)들을 종합 분석하여 의뢰자의 해당질환 유전 소인 결과를 제시하는 부분(44), 임상 문진 정보, 일반임상검사 결과, 그리고 유전 소인 분석 결과를 통합 분석하여 도출된 기능성 식이(dietetics), 영양(nutrients) 및 생활습관(life style) 레시피를 도시하는 부분(45, 46)으로 구성된다.

Claims

식이(dietetics), 영양(nutrition), 기왕력, 가족병력, 질환양태 등에 대한 조사 항목 및 그 데이터, 검사 대상 질환과 관련된 일반임상검사 결과, 질환 위험 예측 표지 대립유전자들의 질환 상관 계수(DCC) 및 위험 변수(RV) 등이 입력되거나 연산 처리된 후 결과 수치가 저장되는 데이터베이스 모듈(10);

검체로부터 핵산을 추출하는 자동화 DNA 순수분리 모듈(20);

상기 DNA 시료를 이용하여 분석 대상 질환 위험 예측 표지 대립유전자들을 다중증폭하는 멀티플렉스 PCR 단계 및 이를 수행하는 모듈(21);

상기 증폭 산물을 이용한 질환 위험 예측 표지 대립유전자들의 SNP 유전자형 고-처리량 분석 단계 및 이를 수행하는 고-처리량 SNP 분석 모듈(22);

질환 상관 계수(DCC)와 질환 위험 예측 표지 대립유전자들의 SNP 유전형에 따른 위험 변수(RV)를 대입한 유전 지수(GI), 그리고 이로부터 질환 감수성 예측치(SEV)를 연산하는 단계, 그리고 상기 데이터와 문진 정보, 일반임상검사 결과를 통합 분석하여 질환별 유전 소인을 종합 평가하는 알고리즘, 그리고 해당 유전 소인에 적절한 기능성 식이, 영양 및 생활습관 레시피를 도출하는 소프트웨어 프로그램 및 이를 포함하는 중앙처리장치 모듈(30);

분석 결과가 디스플레이되거나 출력 수단이 결합된 디스플레이/출력부(40);

워크스테이션 시스템의 조작부(50);

상기 모듈 전부를 포함하고 연동되는 질환 소인 고-처리량 분석 및 그 결과 에 적합한 예방 처치 레시피 도출 워크스테이션 시스템.
제 1항에 있어서, 분석 대상 질환은 만성 성인질환을 포함하며, 바람직하게는 심혈관계 질환, 항산화 및 해독 기전, 염증 반응, 골다공증 등이 이에 속한다.
제 1항에 있어서, DNA 순수분리 모듈(20)은 칼럼(column)의 멤브레인에 DNA를 결합시키고 기타 성분을 진공 펌프를 이용해서 제거하는 칼럼 방식, 또는 마그네틱 비드(magnetic bead)를 사용해서 DNA를 순수 분리하는 방식을 통해서 검체로부터 DNA를 추출하는 자동화 장비 모듈.
제 1항에 있어서, 멀티플렉스 PCR(Polymerase chain reaction, 중합효소 연쇄반응) 모듈은 8-채널 피펫팅 헤드(pipetting head)가 장착된 액체 처리기(liquid handler)가 시약 플레이트에 위치하는 탈이온 3차 멸균 증류수, 2X 멀티플렉스 PCR 프리믹스(premix), 프라이머 프리믹스, 시료 DNA를 순차적으로 PCR 아웃풋 플레이트의 해당 반응 웰(well)로 첨가한 후, 이를 블락(block) 방식의 PCR 기기에 장착하여 유전자 증폭반응이 개시되는 검사 모듈.
제 1항에 있어서, 고-처리량 SNP(Single nucleotide polymorphism, 단일염기다형성) 분석 모듈(22)은 멀티플렉스 PCR 모듈(21)로부터 유입된 증폭 산물의 SNP 유전자형(genotype)을 고-효율, 고-처리량으로 분석할 수 있는 분석 기기를 포함하 며, 바람직하게는 RFLP(Restriction fragment length polymorphism) 방식을 구현하거나, 상업적으로 이용가능한 SNaPshot, Pyrosequencing, Luminex 방식 등의 분석이 가능한 장비를 포함한다.
제 1항에 있어서, 질환 상관 계수(Disease correlation coefficient, DCC)는 질환 위험 예측 표지 대립유전자가 해당 질환에 어느 정도의 상관성을 갖는지를 평가하는 수치로서 다음과 같이 표현된다.

여기서,

Hf는 해당 질환 위험 예측 표지 대립유전자의 PubMed 보고 hits 가중치,

IFf는 SCI 저널 임팩트 팩터 평균값 4분위 가중치,

ATf는 메타-분석, 임상연구, 리뷰 논문의 빈도 4분위 가중치,

Nf는 DCC 연산에 포함된 factor 총 합이다.
제 1항에 있어서, 위험 변수(RV, risk variable)는 질환 위험 예측 표지 대립유전자들의 SNP 유전자형에 따라 인코딩(encoding)된 단백질의 세포내 활성이 정상 유전자형에 비해 어느 정도의 차이가 발생하고 이것이 세포 신호 기전에 어떤 영향을 미치는지에 대한 연구 자료들에 근거하여 산출된 파라미터(parameter)이다.
제 1항에 있어서, 유전 지수(GI, genetic index)는 질환 상관 계수(DCC)와 질환 위험 예측 표지 대립유전자들의 SNP 유전형에 따른 위험 변수(RV)를 적용한 수치이고, 다음과 같이 나타낸다.
제 1항에 있어서, 질환 감수성 예측치(SEV, Susceptibility expected value)는 질환의 유전 소인을 분석하기 위해 질환별로 포함하고 있는 위험 예측 표지 대립유전자들의 GI 값들을 개별적으로 산출한 후, 그 중앙값(GImedian)과 GI 최소값 평균(GImin), GI 최대값 평균(GImax)을 대입하여 도출되는 백분율 값으로 해당 질환의 유전 소인 최종 평가 등급을 의미하며, 이를 근거로 기능성 식이, 영양 및 생활습관 레시피가 도출되는 수치. SEV는 다음과 같이 나타낸다.

GImin은 최소 2개 이상으로 구성된 질환별 위험 예측 표지 대립유전자들의 도출 가능한 GI 최소값 평균. 즉, 해당질환의 분석 대상 대립유전자들의 분석결과가 모두 정상 유전자형인 경우의 GI value 평균,

GImax는 최소 2개 이상으로 구성된 질환별 위험 예측 표지 대립유전자들의 도출 가능한 GI 최대값 평균. 즉, 해당질환의 분석 대상 대립유전자들의 분석결과가 모두 변이 유전자형인 경우의 GI value 평균,

GImedian은 최소 2개 이상으로 구성된 질환별 위험 예측 표지 대립유전자들 의 유전 지수(GI) 총합을 대립유전자 총 수로 나눈 중앙값을 나타낸다.

또한, SEV 40% 미만은 고위험(highly severe) 그룹으로 즉각적인 헬스케어가 필요한 상태, SEV 41 - 60%는 중위험(severe) 그룹, SEV 61 - 80%는 주의(modest) 그룹, SEV 81% 이상은 양호(genetically healthy) 그룹으로 분류하는 단계.
제 1, 2항에 있어서, 분석 대상 질환이 심혈관계 질환이고, 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase(MTHFR), Cholesteryl ester transfer protein, plasma precursor(CETP), Angiotensin I converting enzyme(ACE), 5-methyltetrahydrofolate-homocysteine methyltransferase(MTR), Superoxide dismutase 2, mitochondrial(MnSOD), Apolipoprotein C-III precursor(APOC3), Apolipoprotein AV(APOA5) 유전자의 SNP 분석을 통해서 심혈관계 질환 감수성 예측치를 도출하는 방법.
제 1, 2항에 있어서, 분석 대상 질환이 항산화 및 해독 기전 관련된 질환이고, Glutathione S-transferase Mu 1(GSTM1), Glutathione S-transferase Theta 1(GSTT1), Glutathione S-transferase Pi 1(GSTP1), Nitric oxide synthase 3,endothelial cell(eNOS), Superoxide dismutase 2, mitochondrial(MnSOD), Cytochrome P450, family 1, subfamily A, polypeptide 1(CYP1A1) 유전자의 SNP 분석을 통해서 항산화 및 해독 기전 관련된 질환 감수성 예측치를 도출하는 방법.
제 1, 2항에 있어서, 분석 대상 질환이 염증 반응 관련된 질환이고, Glutathione S-transferase Mu 1(GSTM1), Glutathione S-transferase Theta 1(GSTT1), Glutathione S-transferase Pi 1(GSTP1), Tumor necrosis factor alpha(TNF-α), Interleukin-6(IL-6) 유전자의 SNP 분석을 통해서 염증 반응 관련 감수성 예측치를 도출하는 방법.
제 1, 2항에 있어서, 분석 대상 질환이 골다공증이고, Vitamin D{1,25-dihydroxyvitamin D3} receptor(VDR), Alpha 1 type I collagen preproprotein(COL1A1), Interleukin-6(IL-6) 유전자의 SNP 분석을 통해서 골다공증 감수성 예측치를 도출하는 방법.
제 1항에 있어서, 심혈관계 질환의 유전 소인 종합 평가에 적절한 기능성 식이(dietetics), 영양(nutrients) 및 생활습관 레시피(recipe)는 엽산 400 - 1,000 마이크로그램/일, 비타민 B6 1.4 - 100 밀리그램/일, 비타민 B12 2.4 - 100 마이크로그램/일, 오메가-3 지방산 EPA 0.8 -1.2 그램/일, 오메가-3 지방산 DHA 0.4 - 0.6 그램/일, 오메가-6 지방산 6 - 9 그램/일, 코엔자임 Q10 30 - 80 밀리그램/일 범위의 기능성 식이 및 영양 레시피와, 정제 탄수화물, 포화지방, 콜레스테롤, 체중, 흡연, 운동 항목에 대한 등급별 생활습관 레시피로 구성되는 방법; 및 이를 구현하는 소프트웨어 프로그램.
제 1항에 있어서, 항산화 및 해독 기전 관련된 질환의 유전 소인 종합 평가에 적절한 기능성 식이(dietetics), 영양(nutrients) 및 생활습관 레시피(recipe)는 비타민 A 700 - 2,800 마이크로그램/일, 비타민 C 100 - 1,500 밀리그램/일, 비타민 E 10 - 380 밀리그램/일, 베타-카로틴 2,000 - 5,000 IU/일, 셀레늄 50 - 300 마이크로그램/일, 겨자과 야채 섭취 1 - 5회/주, 파, 마늘류 야채 섭취 1 - 5회/주 범위의 기능성 식이 및 영양 레시피와, 흡연에 대한 생활습관 레시피로 구성되는 방법; 및 이를 구현하는 소프트웨어 프로그램.
제 1항에 있어서, 염증 반응 관련된 질환의 유전 소인 종합 평가에 적절한 기능성 식이(dietetics), 영양(nutrients) 및 생활습관 레시피(recipe)는 비타민 A 700 - 2,800 마이크로그램/일, 비타민 C 100 - 1,500 밀리그램/일, 비타민 E 10 - 380 밀리그램/일, 오메가-3 지방산 EPA 0.8 -1.2 그램/일, 오메가-3 지방산 DHA 0.4 - 0.6 그램/일, 오메가-6 지방산 6 - 9 그램/일 범위의 기능성 식이 및 영양 레시피와, 체중, 흡연에 대한 생활습관 레시피로 구성되는 방법; 및 이를 구현하는 소프트웨어 프로그램.
제 1항에 있어서, 골다공증의 유전 소인 종합 평가에 적절한 기능성 식이(dietetics), 영양(nutrients) 및 생활습관 레시피(recipe)는 칼슘 900 - 1,700 밀리그램/일, 비타민 D 10 - 50 마이크로그램/일, 글루코사민 설페이트 800 - 1,000 밀리그램/일, 콘드로이친 600 - 800 밀리그램/일 범위의 기능성 식이 및 영 양 레시피와 체중, 운동, 흡연에 대한 생활습관 레시피로 구성되는 방법; 및 이를 구현하는 소프트웨어 프로그램.