CN110923332A - 一个影响绵羊早期生长的分子标记、检测方法及其应用 - Google Patents

一个影响绵羊早期生长的分子标记、检测方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一个影响绵羊早期生长的分子标记、检测方法及其应用。一个影响绵羊早期体重的分子标记，位于绵羊PLAG1基因NC_040260.1:g.39071254位点，且具有C/T多态性，CT型绵羊初生体重和断奶体重显著高于CC型绵羊。一种筛选早期快速生长绵羊品种(系)的方法，包括检测绵羊PLAG1基因NC_040260.1:g.39071254位点的C/T多态性，选择CT型个体留种。该多态位点可用于绵羊生长性状的早期辅助选择，提高选择的准确性，加快育种进程。

Description

一个影响绵羊早期生长的分子标记、检测方法及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一个影响绵羊早期生长的多形性腺瘤基因1(Pleomorphic adenoma gene 1，PLAG1)分子标记、检测方法及其应用。
背景技术
PLAG1是多形性腺瘤基因家族成员之一，属于锌指转录因子。最早发现其在多形性腺瘤中高表达，促进多形性腺瘤的发生，后来陆续发现能促进脂肪母细胞瘤、肝母细胞瘤等多种肿瘤的发生。高表达的PLAG1与IGF2 P3启动子结合，上调IGF2的表达，促进细胞的增殖与抗凋亡(Voz ML et al，2000)，而IGF2是胎儿正常生长所必须的(Kadakia R et al，2016)。
Hensen K等(2004)研究表明，PLAG1基因敲除的小鼠胎儿生长发育阻滞，且影响到出生后生长。11.5天的基因敲除纯合子胚胎较同窝正常对照组轻18％，初生重较正常小鼠轻30％，此外，基因敲除纯合子胚胎出生后生长速度慢，到21日龄时，其体重仅为同窝对照组的一半。虽然断奶后有一快速追赶期，但60日龄时仍只有对照组体重的70％。说明PLAG1基因对小鼠体重具有重要的调节作用。
Abi Habib W等(2018)发现PLAG1基因突变可导致RSS综合征——一种胎儿生长发育阻滞的人类遗传病。PLAG1第5外显子439、1363位胞嘧啶缺失导致移码突变，分别产生截短的227、469个氨基酸的肽，可导致胎儿出生体重和身高的下降。
全基因组关联分析发现，牛PLAG1基因邻近区域存在与腿肌重显著相关的数量性状位点(Song Y et al，2016)。PLAG1-NCAPG基因间隔区一个数量性状位点与日本和牛阉牛日增重、体长、胴体性状连锁(Hoshiba H et al，2013)。QTL、eQTL分析发现，PLAG1启动子区变异、PLAG1表达水平与牛生长、产奶性状(乳脂、乳蛋白、产奶量)相关(Fink T et al，2017)。PLAG1 SNPs影响牛早期体重、青春期体重和生长(Littlejohn M et al，2012)。PLAG1 SNPs影响韩牛的胴体性状(Kim HJ et al，2017)。PLAG1存在与牛体尺相关的SNPs(Xu W et al，2018；Zhong JL et al，2018)。进化分析表明，现代牛体长的恢复主要受到PLAG1单倍型(Q)选择的影响(Utsunomiya YT et al，2017)。
选择性清扫分析发现猪的脊椎数与PLAG1相关(Rubin CJ et al，2012；Zhang Yet al，2018)。全基因组关联分析表明PLAG1是影响猪平均背脂厚、肢骨长的候选基因(QiaoR et al，2015；Guo Y et al，2015)。
虽然目前已经发现牛、猪PLAG1基因多态性与生长性状相关，但绵羊PLAG1基因多态性及其与生长性状的相关性均未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服绵羊育种中生长性状表型选择准确性低，遗传进展慢的缺陷，提供一个影响绵羊早期体重的分子标记。
本发明的另一目的是提供该分子标记的应用。
本发明的又一目的是提供一种筛选高生长性状的绵羊品种(系)的方法。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一个影响绵羊早期体重的分子标记，所述的分子标记为克隆自绵羊基因组DNA且包含绵羊PLAG1基因3’UTR区NC_040260.1:g.39071254位点的一段核苷酸序列，该位点具有C/T多态性，CT型初生体重、断奶重高于CC型。
所述的分子标记优选以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对PCR扩增绵羊基因组DNA得到的490bp的扩增产物，其包含绵羊PLAG1基因3’UTR区NC_040260.1:g.39071254位点，该位点具有C/T多态性，CT型初生体重、断奶重高于CC型。
本发明所述的分子标记在绵羊育种中的应用，优选在筛选高生长性状的绵羊品种(系)中的应用。
一种用于扩增所述的分子标记的引物对，上游引物P1如SEQ ID NO：1所示，下游引物P2如SEQ ID NO：2所示。
本发明所述的引物对在绵羊分子育种中的应用；优选利用所述的引物对PCR扩增绵羊基因组中权利要求1所述的分子标记，对扩增产物进行测序，判读绵羊PLAG1基因NC_040260.1:g.39071254位点的C/T多态性。
一种检测本发明所述的分子标记的方法，包括利用所述的引物对PCR扩增绵羊基因组中所述的分子标记，对扩增产物进行测序，判读绵羊PLAG1基因NC_040260.1:g.39071254位点的C/T多态性。
一种筛选早期快速生长绵羊品种(系)的方法，包括检测绵羊PLAG1基因NC_040260.1:g.39071254位点的C/T多态性，选择CT型个体留种。
本发明所述的方法，优选包括以下步骤：
1)提取绵羊基因组DNA；
2)利用权利要求2所述的引物对PCR扩增PLAG1基因3’UTR区序列，得到490bp扩增产物；
3)利用权利要求2中所述的引物P2对490bp扩增产物进行测序分型，分为CC型、CT型；
4)选择CT型个体留种。
其中，所述PCR扩增的反应总体系为20μL，模板DNA 15-100ng，5U/μL Taq聚合酶0.2μL，10mM的dNTP0.5μL，引物P1和P2各5pmol，25mM的MgCl2 1.2-1.6μL，10×缓冲液2μL，加灭菌双蒸水至20μL；所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，52-54℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸7min。
有益效果
绵羊生长性状是一个重要的经济性状，属于数量性状，传统的表型选择准确性低，且表型值需要在绵羊成年后才能逐步表现出来，周期很长，无法进行超早期选择，遗传进展缓慢。本发明采用PCR扩增与测序相结合检测PLAG1基因NC_040260.1:g.39071254位点的C/T多态性，并将基因型与湖羊的早期体重进行关联分析，发现PLAG1基因NC_040260.1:g.39071254位点CT型绵羊初生体重、断奶体重均显著(p＜0.05)高于CC型绵羊。该多态位点可用于绵羊生长的辅助选择，提高选择的准确性，同时可以在绵羊出生时就通过检测基因型进行选择，加快育种进程，降低育种成本。不仅对进一步提高绵羊生长性状有重要的实际意义，而且对绵羊新品种(系)培育具有重要的实践价值。
附图说明
图1湖羊PLAG1基因NC_040260.1:g.39071254突变位点测序图
1a为CC型，1b为CT型。
具体实施方式
下述实施例中提到的实验方法，如无特别说明均为常规方法，PCR试剂购自南京擎科生物科技有限公司，PCR产物回收试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司，其余试剂购自南京生兴生物技术有限公司。
实施例1、湖羊早期生长的PLAG1基因NC_040260.1:g.39071254C/T分子标记选择方法材料与方法：
(一)羊群
352只湖羊样本由江苏西来原生态农业有限公司统一饲养管理，营养以及管理水平保持一致。其体重资料均由江苏西来原生态农业有限公司提供。
(二)方法
1、样品采集
每个个体采集耳组织样，置冰桶中带回实验室，-20℃保存。
2、DNA的提取
采用常规酚、氯仿法提取DNA，采用电泳及测定OD260/280检测DNA质量。
3、含PLAG1基因NC_040260.1:g.39071254位点序列的扩增
根据序列NC_040260.1，利用Primer Primer 5设计一对特异性引物(序列为P1：CCCTTTGCCTGTTGCTTTC(SEQ ID NO.1)，P2：CCGTGCTTCGGTATCTGGT(SEQ ID NO.2))，PCR扩增湖羊PLAG1基因NC_040260.1:g.39071254位点序列。
PCR扩增的反应总体系为20μL，模板DNA 15-100ng，5U/μL Taq聚合酶0.2μL，10mM的dNTP 0.5μL，引物P1和P2各5pmol，25mM的MgCl2 1.2-1.6μL，10×缓冲液2μL，加灭菌双蒸水至20μL；所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，52-54℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸7min。
4、PCR扩增产物的测序分型。采用引物P2对490bp扩增产物进行Sanger测序分型，分为CC型、CT型。
5、PLAG1基因NC_040260.1:g.39071254位点不同基因型湖羊早期体重的差异显著性分析，采用SPSS 11.5中的One-way ANOVA方法进行。
(三)结果与分析
1、PLAG1基因NC_040260.1:g.39071254位点多态性
352个湖羊样本DNA经PCR扩增的产物，采用P2引物Sanger测序，发现存在CC、CT两种基因型(图1)。
2、PLAG1基因NC_040260.1:g.39071254位点不同基因型湖羊早期体重差异显著性分析
采用单因素方差分析比较不同基因型羊群间早期体重的差异发现，CT型湖羊母羊初生体重、断奶体重均显著高于CC型湖羊(p＜0.05)(表1)；CT型湖羊公羊初生体重、断奶体重也显著高于CC型湖羊(p＜0.05)(表2)。
表1 PLAG1基因NC_040260.1:g.39071254位点不同基因型湖羊母羊早期体重
Figure BDA0002306937620000051
注：同行不同小写字母上标表示差异显著(p＜0.05)，下同。
表2 PLAG1基因NC_040260.1:g.39071254位点不同基因型湖羊公羊早期体重
Figure BDA0002306937620000052
综合分析以上结果可以看出，CT型绵羊在早期生长方面具有优势，该位点可以作为绵羊早期生长性状选择的分子标记，在留种时选择CT型个体。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一个影响绵羊早期生长的分子标记、检测方法及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccctttgcct gttgctttc 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccgtgcttcg gtatctggt 19

Claims (10)

1.一个影响绵羊早期体重的分子标记，其特征在于所述的分子标记为克隆自绵羊基因组DNA且包含绵羊PLAG1基因3’UTR区NC_040260.1:g.39071254位点的一段核苷酸序列，该位点具有C/T多态性，CT型初生体重、断奶重高于CC型。
2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于所述的分子标记为以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对PCR扩增绵羊基因组DNA得到的490bp的扩增产物，其包含绵羊PLAG1基因3’UTR区NC_040260.1:g.39071254位点，该位点具有C/T多态性，CT型初生体重、断奶重高于CC型。
3.权利要求1或2所述的分子标记在绵羊育种中的应用，优选在筛选高生长性状的绵羊品种或品系中的应用。
4.一种用于扩增权利要求1所述的分子标记的引物对，其特征在于上游引物P1如SEQID NO：1所示，下游引物P2如SEQ ID NO：2所示。
5.权利要求4所述的引物对在筛选高生长性状的绵羊分子育种中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于利用权利要求4所述的引物对PCR扩增绵羊基因组中权利要求1所述的分子标记，对扩增产物进行测序，判读绵羊PLAG1基因NC_040260.1:g.39071254位点的C/T多态性。
7.一种检测权利要求1所述的分子标记的方法，其特征在于包括利用权利要求4所述的引物对PCR扩增绵羊基因组中权利要求1所述的分子标记，对扩增产物进行测序，判读绵羊PLAG1基因NC_040260.1:g.39071254位点的C/T多态性。
8.一种筛选高生长性状的绵羊品种或品系的方法，其特征在于包括检测绵羊PLAG1基因NC_040260.1:g.39071254位点的C/T多态性，选择CT型个体留种。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于包含以下步骤：
1)提取绵羊基因组DNA；
2)利用权利要求4所述的引物对PCR扩增PLAG1基因3’UTR区序列，得到490bp扩增产物；
3)利用权利要求4中所述的引物P2对490bp扩增产物进行测序分型，分为CC型、CT型；
4)选择CT型个体留种。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述PCR扩增的反应总体系为20μL，模板DNA 15-100ng，5U/μL Taq聚合酶0.2μL，10mM的dNTP0.5μL，引物P1和P2各5pmol，25mM的MgCl2 1.2-1.6μL，10×缓冲液2μL，加灭菌双蒸水至20μL；所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，52-54℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸7min。
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