CN113265473B - 一种影响高山美利奴羊初生重的snp分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种影响高山美利奴羊初生重的SNP分子标记及其应用。所述的SNP分子标记位于国际绵羊参考基因组Oar_v4.0版本第14号染色体上第18805219个核苷酸位点C＞G突变。本发明还涉及了利用SNaPshot技术检测上述SNP分子标记的特异性引物对和含有该特异性引物对的试剂盒及核苷酸多态性检测方法，与传统的检测法相比，该技术具有准确性高，检测速度快，成本低廉，结果容易判断等特点。将SNP位点检测用于开展高山美利奴羊初生重性状早期选择，缩短培育周期、加快培育进程，建立一种高山美利奴羊初生重性状早期选择技术，减少高山美利奴羊初生重性状优良性状的育种时间，降低育种成本，具有很高的应用价值。

Description

一种影响高山美利奴羊初生重的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明属于分子遗传学技术领域，具体涉及一种影响高山美利奴羊初生重的SNP分子标记及其应用。

背景技术

对于种畜而言，繁殖力就是生产力，繁殖性能直接关系到畜牧产业的经济效应。羊的繁殖性能主要包括总产羔数、产活羔数、初生重、初生窝重、断奶窝重等指标。羊出生时的体重即羊初生重，是衡量羊的一个重要数量性状，影响羊的生长发育、生产性能和胴体等级等。初生重与断奶成活率、断奶重、出栏重也呈正相关，与出栏日龄呈负相关。而且初生重低的羊，大多生长发育不良。因此有针对性的提高羊初生重，可使得羊有更高的成活率和更优良的生产性能，进而为生产者带来更大的经济效益。

初生重是一个复杂的数量性状，由多基因共同调控，且受到品种、胎次、营养及环境等诸多因素的影响。传统的育种方法多采用传统表型选育技术，即根据后代表型信息推断亲本生产力，选育周期长，遗传进展缓慢。采用分子标记辅助选择进行选育，其优势在于不易受其他外界环境等因素的影响，可缩短育种时间，提高选育的准确性。SNP是1996年由美国麻省理工学院的人类基因组研究中心学者Lander提出的一类分子遗传标记，主要是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP表现出的多态性仅涉及到单个碱基的变异，表现是有转换、颠换、插入和缺失等。SNP分子标记具有遗传稳定、突变率低、便于自动化检测等优点。因此，寻找与产羔性状紧密连锁的分子辅助标记基因，筛选调控产羔性状的功能基因，是实现现代分子育种技术与常规育种技术有机结合，提高繁殖效率的有益手段。

本发明发现了一种影响高山美利奴羊初生重性状的SNP分子标记，位于国际绵羊基因组Oar_v4.0版本第8号染色体上第18804822位点的碱基处；当碱基为C时，基因型为CC；当碱基为G时，基因型为CG或GG；所述基因型CC和基因型CG的高山美利奴羊初生重显著大于GG基因型(p<0.05)，CC和CG基因型个体间并未表现出显著差异(p>0.05)。本发明提供的利用SNaPshot技术检测与高山美利奴羊初生重相关的核苷酸多态性的方法，该技术准确性高，检测速度快，成本低廉，并且结果判读更容易。利用本方法可对初生重相关的SNP位点多态性实现自动化检测，通过对高山美利奴羊初生重性状相关的SNP位点进行检测，可用于育种早期选留，将CC和CG基因型个体保留下来，提高高山美利奴羊选育准确性，在对高山美利奴羊进行大规模分子精准育种中具有潜在的应用价值。

发明内容

本发明提供了一种影响高山美利奴羊初生重性状的SNP分子标记，并通过检测所述SNP分子标记碱基类型，实现初生高山美利奴羊的基因分型，所述SNP分子标记碱基为C时，基因型为CC；当所述SNP分子标记碱基为G时，基因型为CG或GG；所述基因型CC和基因型CG的高山美利奴羊初生重显著大于GG基因型，通过基因分型分析高山美利奴羊初生重，进行选育育种。具体包括以下内容：

第一方面，本发明提供了一种检测与高山美利奴羊初生重性状相关的SNP分子标记的试剂在检测高山美利奴羊初生重中的应用，所述SNP分子标记位于国际绵羊基因组Oar_v4.0版本第8号染色体上第18804822位点的碱基处；突变碱基为C或G。

优选地，所述SNP分子标记碱基为C时，基因型为CC；当所述SNP分子标记碱基为G时，基因型为CG或GG；所述基因型CC和基因型CG的高山美利奴羊初生重显著大于GG基因型。

优先地，所述试剂包括用于扩增含有所述SNP分子标记的核苷酸序列的引物对。

优选地，所述含有SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述的SNP分子标记位于第47位。

第二方面，本发明提供了一种检测与高山美利奴羊初生重性状相关的SNP分子标记的试剂在高山美利奴羊育种中的应用，所述SNP分子标记位于国际绵羊基因组Oar_v4.0版本第8号染色体上第18804822位点的碱基处；突变碱基为C或G。

优选地，所述SNP分子标记碱基为C时，基因型为CC；当所述SNP分子标记碱基为G时，基因型为CG或GG；所述基因型CC和基因型CG的高山美利奴羊初生重显著大于GG基因型。

优选地，所述试剂包括用于扩增含有所述SNP分子标记的核苷酸序列的引物对。

优选地，所述含有SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的SNP分子标记位于第47位。

第三方面，本发明提供了一种用于含有SNP分子标记的核苷酸序列的特异性引物对，所述的引物对序列为：

F：5'-CACTATGGTGGATAAGAG-3'，R：5'-CCAAATGCCTGAATCCTA-3'。

优选地，所述含有SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的SNP分子标记位于第47位。

第四方面，本发明提供了一种上述第三方面所述的特异性引物对在用于检测高山美利奴羊初生重，或用于高山美利奴羊育种中的应用。

优选地，实现检测高山美利奴羊初生重，或高山美利奴羊育种的方法包括：

(1)提取初生高山美利奴羊血液基因组DNA为模板DNA；

(2)利用所述的特异性引物对，将步骤(1)获得的待测细毛羊血液的基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；

(3)将步骤(2)获得的PCR扩增产物纯化，进行基因分型检测，当所述SNP分子标记碱基为C时，基因型为CC；当所述SNP分子标记碱基为G时，基因型为CG或GG；所述基因型CC和基因型CG的高山美利奴羊初生重显著大于GG基因型。

优选地，所述PCR扩增体系25μL：金牌Mix 22μL，上、下游引物各1μL，模板DNA1μL。

优选地，所述PCR扩增程序：98℃2min；94℃10s，56℃10s，72℃10s，共30个循环；72℃延伸1min。

第五方面，本发明提供了一种用于检测高山美利奴羊初生重，或用于高山美利奴羊育种的检测试剂盒，所述试剂盒包括上述第三方面所述的特异性引物对。

本发明的有益效果是：①本发明提供了一种影响高山美利奴羊初生重的SNP分子标记，所述的SNP分子标记位于国际绵羊基因组Oar_v4.0版本第8号染色体上第18804822位点的碱基处，当碱基为C时，基因型为CC；当碱基为G时，基因型为CG或GG；所述基因型CC和基因型CG的高山美利奴羊初生重显著大于GG基因型(p<0.05)，CC和CG基因型个体间并未表现出显著差异(p>0.05)；②本发明提供了利用SNaPshot技术检测与高山美利奴羊初生重相关的核苷酸多态性的方法，该技术准确性高，检测速度快，成本低廉，并且结果判读更容易。利用本方法可对高山美利奴羊初生重相关的SNP位点多态性实现自动化检测，通过对高山美利奴羊初生重相关的SNP位点进行检测，可用于育种早期选留，将CC和CG基因型个体保留下来，提高高山美利奴羊选育准确性，在对高山美利奴羊进行大规模分子精准育种中具有潜在的应用价值。

附图说明

图1PCR扩增结果；

图2PCR产物经纯化并测序后所得到的基因型分析结果，其中CC、CG、GG为三种基因型。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。需要指出的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所有试验的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所有试验的实验条件如无特殊说明，均为常规条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular cloning:a laboratory manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

本发明所述的SNP是单核苷酸多态性的简称，指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。

实施例1高山美利奴羊不同基因型与初生重之间的相关性

1.样品采集

样品来自甘肃省绵羊繁殖技术推广站，采集具有生产记录的228只高山美利奴羊血样，每只羊静脉采血5mL于加入EDTA-K2抗凝剂的采血管中，血样采集完毕后迅速混匀，放入含有冰袋的采样箱中暂存，运回实验室后于-20℃冰箱冷冻保存，用以DNA的提取。每只羊初生重由甘肃省绵羊繁育技术推广站现场测定。

2.主要试剂及仪器

EDTA-K2真空采血管购自江苏宇力医疗器械有限公司；血液基因组提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；NanoDrop2000分光光度计美国Thermo FisherScientific公司；DL2000 Marker、琼脂糖、核酸染料均购自北京索莱宝科技有限公司；金牌Mix(green)购自北京擎科新业生物技术有限公司；电泳仪购于北京六一仪器厂；PCR仪购自BioRad公司。

3.方法

3.1血液基因组DNA的提取

采用天根生化科技(北京)有限公司的血液基因组提取试剂盒，从血样中提取基因组DNA，将提取出的DNA置于紫外分光光度计下检测浓度与纯度，浓度＞20ng/μL、OD260/OD280在1.7-1.9之间即满足实验需要，存放于-20℃保存备用。

3.2引物设计

参考国际绵羊基因组Oar_v4.0版本第8号染色体基因序列(GenBank登录号：NC_040259.1，SNP标记位于第18804822位)，利用primer premier5.0软件设计一对特异性引物，如SEQ ID No.2-3，包含所述的SNP位点，扩增片段长度592bp，引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

F：5'-CACTATGGTGGATAAGAG-3'(SEQ ID NO.2)；

R：5'-CCAAATGCCTGAATCCTA-3'(SEQ ID NO.3)。

3.3PCR扩增与测序

PCR扩增体系25μL：金牌Mix(green)22μL，上、下游引物各1μL，模板1μL。

PCR扩增程序：98℃2min；94℃10s，56℃10s，72℃10s，共30个循环；72℃延伸1min。

PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格后，采用直接测序法进行测序，扩增的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，SNP标记位于SEQ ID No.1所示核苷酸序列的47位。由北京擎科新业生物技术有限公司完成测序。利用生物分析软件Vector NTI advance11.5软件对PCR产物测序结果进行比对，分析测序峰图，完成分型。

3.4统计分析

根据基因分型结果，统计各位点不同基因型的个体数。利用Popgen32软件计算所述SNP位点的基因频率、基因型频率、有效等位基因数(Ne)、位点杂合度(He)、Hardy-Weinberg平衡检验，利用PIC计算软件计算多态信息含量。采用IBM SPSS Statistics 22软件中一般线性模型分析高山美利奴羊不同基因型与初生重的关联性，结果以“平均值±标准误”表示。

4.结果

4.4 PCR扩增及测序结果

用1.5％琼脂糖凝胶检测高山美利奴羊第8号染色体所述SNP位点扩增产物，结果如图1所示，条带清晰无杂带，特异性良好，PCR产物片段大小为592bp符合预期大小，可以进行下一步实验。

PCR产物经纯化并测序后所得到的峰图及序列见图2。由图2可知，所述SNP位点发生A-G突变，存在GG、CG、CC三种基因型。

4.2统计分析结果

从群体遗传学角度对高山美利奴羊羊毛羊第8号染色体所述SNP位点的基因型和等位基因频率进行分析。由表1可见，在所述SNP位点上，CG基因型频率最高，为优势基因型，C等位基因频率为56.4％，表现为优势等位基因。由χ2适应性检验表明，SNP位点处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。该位点期望杂合度为0.371，多态信息含量(polymorphisminformation content，简称PIC)为0.371，0.25＜PIC＜0.50，属于中度多态。

表1高山美利奴羊羊毛羊第8号染色体g18804822C>G SNP位点多态性

4.3高山美利奴羊不同基因型与初生重的关联分析

采用IBM SPSS Statistics 22软件中一般线性模型分析高山美利奴羊不同基因型与初生重的关联性，CC和CG基因型的高山美利奴羊初生重显著大于GG基因型个体(p<0.05)，CC和CG基因型个体间并未表现出显著差异(p>0.05)。通过检测高山美利奴羊第8号染色体所述SNP位点的碱基，能够判断高山美利奴羊初生重，结果见表2。

表2高山美利奴羊不同基因型与初生重之间的相关分析

注：同一行数据间标有不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)

综上所述，本发明所述的SNP分子标记位于国际绵羊参考基因组Oar_v4.0版本第8号染色体上第18804822个碱基处；变异类型为C/G，存在三个基因型，当所述的第8号染色体上第18804822个碱基为C时，基因型为CC；当所述的第8号染色体上第18804822个碱基为G时，基因型为CG或GG；通过不同基因型与初生重的关联分析，发现所述CC和CG基因型的高山美利奴羊初生重显著大于GG基因型个体，P<0.05；CC和CG基因型个体间未表现出显著差异，P>0.05。

上述结果表明，通过检测高山美利奴羊羊毛羊第8号染色体上第18804822个核苷酸位点的碱基，能够判断高山美利奴羊初生重，为高山美利奴羊初生重的分子标记辅助育种提供依据，可以加强高山美利奴羊早期选择、提高选种准确性、缩短培育周期、加快培育进程。通过所述的特异性引物对，可建立高效准确的分子标记辅助育种技术，通过优选该SNP分子标记的优势等位基因，能够增加高山美利奴羊初生重的遗传进展，采用与初生重相关的分子标记进行体重性状甄选时，具有操作简单的优点，可以辅助筛选初生重高的高山美利奴羊，提高品种甄选的精确度，减少高山美利奴羊初生重优良性状的育种时间，降低育种成本，增加核心竞争。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所

<120> 一种影响高山美利奴羊初生重的SNP分子标记及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 592

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cactatggtg gataagagga tcagaggaaa tatacaagtt ctatggacac tgataattta 60

ataaaatact tacgaaggct tttcctgatt tgaaaaacta taaattgaga gagagcattt 120

agtactgacg aggtatttcg ttctcagagg aaacattcag ttaatatggt ttaagtgtgt 180

gaagtagaaa aaaagtcaac tcatcaaagc taaaaagatt gaatgagctt ccagtgaata 240

aaagaaagaa gggcatctgc tccaagactg gggaaacatg tataatggat ttttacatta 300

gatcaattta ctcagataac cttcattttg aaggctgcaa aagaatgttt tcccaaatta 360

accaaaagaa atccactgct ccagacatac cagtaggaaa gattgctaaa gagcttcctg 420

aaaaagagaa gtagctaata tcactaattt taagaatacc aagggggtaa acctaaagga 480

agggggaagg attgtggagt ggggaggagg gaaattagat tgagaatgtg aatatagtgg 540

tagaaaaatc tatttttttt ttttaatctc ataataggat tcaggcattt gg 592

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cactatggtg gataagag 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccaaatgcct gaatccta 18

Claims (8)

1.一种检测与高山美利奴羊初生重性状相关的SNP分子标记的试剂在检测高山美利奴羊初生重中的应用，其特征在于，所述SNP分子标记位于国际绵羊基因组Oar_v4.0版本第8号染色体上第18804822位点的碱基处；突变碱基为C或G，基因型为CC、CG或GG，所述基因型CC和基因型CG的高山美利奴羊初生重显著大于GG基因型。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括用于扩增含有所述SNP分子标记的核苷酸序列的引物对。

3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述含有SNP分子标记的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，所述的SNP分子标记位于第47位。

4.一种用于扩增如权利要求3所述的含有SNP分子标记的核苷酸序列的特异性引物对，其特征在于，所述的引物对序列为：

F：5'-CACTATGGTGGATAAGAG-3'，R：5'-CCAAATGCCTGAATCCTA-3'。

5.如权利要求4所述的特异性引物对在检测高山美利奴羊初生重中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，实现检测高山美利奴羊初生重的方法包括：

（1）提取初生高山美利奴羊血液基因组DNA为模板DNA；

（2）利用所述的特异性引物对，将步骤（1）获得的待测细毛羊血液的基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；

（3）将步骤（2）获得的PCR扩增产物纯化，进行基因分型检测，基因型为CC、CG或GG，所述基因型CC和基因型CG的高山美利奴羊初生重显著大于GG基因型。

7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增体系25μL：预混液22μL，上、下游引物各1μL，模板DNA 1μL。

8. 如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增程序：98℃ 2min；94℃ 10s，56℃ 10s，72℃ 10s，共30个循环；72℃延伸1min。

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