ES2322361T3 - Polimorfismo del gen igf2 y mejora de las caracteristicas del ganado. - Google Patents

Abstract

Método para identificar un fenotipo en ganado bovino, el método comprendiendo: detectar un polimorfismo presente en el gen IGF2 en la posición 150 de la SEC ID NO: 1; y donde la presencia de un residuo C (un alelo C) está asociada al fenotipo de mayor tamaño del músculo longissimus dorsi en comparación con el bovino con un residuo T (alelo T) en la posición 150 de la SEC ID NO: 1.

Description

Polimorfismo del gen IGF2 y mejora de las características del ganado.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a métodos de cría selectiva y gestión de ganado bovino, y en particular para predecir características de producción de un genotipo.

Antecedentes

El peso de nacimiento de un ternero es considerado uno de los factores más críticos para obtener un ternero vivo y en consecuencia es muy importante para el éxito de la cría de terneros. La creencia tradicional entre los rancheros (Canadian Cattlemen magazine, Calving Special 2003) era que los productores tendrían que sacrificar un alto nivel de ganancias para obtener un ternero más pequeño al nacer. Un peso pequeño al nacer reduce mucho la necesidad de asistencia en los partos y aumenta el nivel de supervivencia de los terneros y de las vacas. Así se suelen desear animales progenitores que produzcan descendencia que pesen poco al nacer para mejorar la probabilidad de supervivencia. El peso de nacimiento es una característica muy hereditaria.

El aumento de peso de un animal durante su crecimiento y desarrollo normalmente sigue un patrón trifásico que es cuidadosamente gestionado por los productores y mataderos comerciales. Se sabe que la eficiencia de la conversión calórica (nutrición) del régimen alimenticio para el aumento de peso durante un incremento de tiempo varía durante estas tres fases, aunque se sabe poco sobre la base genética o fisiológica de la variabilidad.

Se considera que la primera fase de crecimiento comprende aquella parte de la vida de un animal bovino desde el nacimiento hasta el destete. Normalmente en las operaciones comerciales de alimentación y sacrificado de ganado se presta poca atención a esta fase de crecimiento pues el alimento es proporcionado por la madre por lo que hay poco que hacer en términos de gestión de racionamiento de alimentos.

Una segunda fase de crecimiento comprende aquella parte de la vida de un animal bovino desde el destete hasta alcanzar la madurez musculo- esquelética. Como la eficiencia de conversión alimenticia es poca durante esta fase, los productores de ganado suelen restringir la ingesta calórica en un esfuerzo por mantener los costes de alimentación tan bajos como sea práctico sin afectar el proceso de maduración muscular. La limitación de la ingesta calórica tiene el efecto de prolongar esta fase de crecimiento, pero también suelen generar animales con un cuerpo más grande, que es el objetivo principal de la gestión del régimen alimenticio durante esta fase. Durante la segunda fase el aumento de peso está unido a aumentos principalmente en la masa esquelética y muscular.

La tercera fase de crecimiento está unida principalmente a la acumulación de grasa. Durante esta fase y después de que un animal haya alcanzado la madurez musculo-esquelética, la eficiencia de conversión alimenticia se reduce más de manera que requiere incluso más alimento para aumentar el peso de un animal en una cantidad particular.

Otro objetivo de los programas de gestión de reproducción y cría es aumentar la proporción de cortes de carne de alto valor en el animal final, aumentando de ese modo el valor del animal en el matadero. Una medida asociada a carcasas de mayor valor es el tamaño del músculo longissimus dorsi (REA del inglés Rib Eye Area). Como se sabe que existe variabilidad entre animales respecto a la eficiencia de conversión alimenticia y la tendencia de producir carne de alto valor, los productores han intentado desarrollar métodos de selección de animales para predecir cuáles producirán el mayor valor como producto acabado. Un método de cría y selección, basado en el tamaño del cuerpo del animal progenitor, sirve de algo a la hora de juzgar el potencial de animales pero no cumple todo el potencial genético de un animal individual en términos de eficiencia de conversión alimentaria y la proporción de cortes de carne de alto valor que podría proveer eventualmente.

El factor de crecimiento de tipo insulina 2 (IGF2) es una hormona peptídica de 67 aminoácidos que tiene múltiples efectos fenotípicos en el crecimiento celular y el metabolismo. El gen IGF2 comprende 10 exones en cerdo (Amarger et al. 2002) y humano (McLaren y Montgomery 1999), mientras el gen IGF2 de oveja tiene 9 exones (Fig. 1) (Ohlsen et al. 1994). No se ha encontrado ningún equivalente al exón 2 humano en la oveja (Ohlsen et al. 1994). El IGF2 de ratón y rata tiene seis exones y dos pseudo o exones no codificantes (Ohlsen et al. 1994) (Fig. 1).

Al principio se pensó que el IGF2 funcionaba principalmente como un factor de crecimiento fetal y neonatal (De Chiara et al. 1990, 1991, Rotwein y Hall 1990, Giannoukakis et al. 1993). No obstante, se ha demostrado recientemente el papel del IGF2 en el desarrollo postnatal del contenido mollar de la carcasa en los cerdos (es decir, tamaño del jamón) (Jeon et al. 1999, Nezer et al. 1999, Amarger et al. 2002).

En varias especies tales como ratones, (De Chiara et al. 1991, Sasaki et al. 1992), ratas (Ohlsson et al. 1993), seres humanos (Kalscheuer et al. 1993, Giannoukakis et al. 1993), cerdos (Nezer et al. 1999, Jeon et al. 1999), y ovejas (McLaren y Montgomery 1999, Feil et al. 1998) se ha demostrado que el gen IGF2 forma una huella genética. En estos animales, el alelo paterno es expresado durante todo el desarrollo y vida del animal.

Bibliografía citada (en los antecedentes)

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Resumen de la invención

Los últimos estudios han revelado que un polimorfismo de nucleótido en simple en el exón 2 de IGF2 (SNP-2) en ganado bovino está asociado a un menor peso al nacer y un mayor tamaño del músculo longissimus dorsi (REA). La huella genética en el IGF2 produce la expresión de sólo el alelo paterno durante la gestación, mientras que ambos alelos materno y paterno son expresados después del nacimiento. Los resultados de estos estudios también muestran que el alelo del SNP-2 del padre afecta al peso de nacimiento, mientras que los alelos materno y paterno del IGF2 afectan al tamaño del músculo longissimus dorsi.

Con este descubrimiento ahora será posible usar ensayos genéticos para determinar un genotipo IGF2 de un animal y luego usar este conocimiento para gestionar programas de gestión y cría para producir animales que den cortes de carne de alto valor en el animal final.

Es bien conocido que las variantes genéticas tienen el potencial de cambiar espectacularmente la expresión y o función de un producto genético. Además los polimorfismos de nucleótido simple (SNPs), ya sean éstos o no la causa inmediata de la expresión o función alterada del producto genético, pueden proporcionar también un marcador genético para la variante. Así, si el SNP puede ser asociado a un fenotipo específico, el SNP proporciona otra ventaja al predecir los resultados fenotípicos en base a una composición genotípica del animal.

La presente invención se refiere a la identificación de un polimorfismo de nucleótido simple en el exón 2 de IGF2 (SNP-2) en ganado bovino y a métodos de selección y gestión de la producción de ganado bovino basados en la presencia o ausencia del polimorfismo. El polimorfismo comprende una transición C a T en la posición 150 de la SEC ID NO: 1.

Identificando animales con un genotipo particular, con respecto a los alelos de SNP descritos aquí, es posible identificar animales que expondrán el fenotipo de una calidad de carcasa superior en comparación con animales carentes del genotipo deseado.

En particular, la presente invención se refiere a métodos para establecer las predisposiciones genéticamente determinadas del individuo bovino dentro de un grupo de tales animales para que se corresponda con las características particulares deseadas respecto al crecimiento, basado en la asociación de los SNPs específicos del gen IGF2 con efectos observables en el fenotipo de crecimiento de los animales.

Beever et al. (1990) expone músculos longissimus dorsi más grandes en piezas de ganado bovino de raza Angus originaria de Escocia que llevan el segmento cromosómico marcado por el alelo BOLA-w2.

Es un objeto de la invención predecir la calidad de una carcasa de carne bovina, específicamente un mayor tamaño del músculo longissimus dorsi, a través de conocimiento del genotipo SNP-2 del individuo animal.

Es otro objeto de la presente invención usar el exón 2 SNP (SNP-2) de IGF2 como un pronosticador de modelos de expresión IGF2 que son conocidos por producir un músculo longissimus dorsis mayor y usar el conocimiento de la expresión de IGF2 y la huella genética en aplicaciones de gestión de la cría y reproducción.

La observación de que el SNP-2 está correlacionado con el mayor tamaño del músculo longissimus dorsi tiene implicaciones para las prácticas tanto de la cría como de la gestión en los distintos segmentos de la cadena de producción de carne bovina o en la industria ganadera. Dependiendo de en qué parte de la cadena esté implicado el productor/compañía, diferentes estrategias de gestión o cría serán más ventajosas en vistas a un genotipo SNP-2 de un animal.

La presencia de un residuo C en la posición 150 es denominada aquí como un alelo C mientras que la presencia de un residuo T en la posición 150 es denominado aquí como un alelo T. Los animales pueden ser homocigotos con respecto al alelo C (bovino C/C ) o el alelo T (bovino T/T) o heterocigoto (bovino C/T ).

El genotipo SNP-2 afecta al tamaño del músculo longissimus dorsi, de manera que los animales con un residuo C en el sitio SNP-2 en ambos alelos de IGF2 (descendencia C/C ) expondrán el mayor aumento en el tamaño del músculo longissimus dorsi. Esta invención, en consecuencia, permite también a los productores tomar decisiones de cría/selección basadas en el conocimiento del genotipo SNP-2 del macho y de la hembra para obtener descendencia C/C, maximizando así el potencial de cortes de carne de alto valor en base al tamaño del músculo longissimus dorsi pronosticado.

La presente invención es también una mejora del método actual de seleccionar ganado bovino según los fenotipos parentales. Como se muestra en los datos experimentales que siguen a continuación, se demuestra que el tamaño del músculo longissimus dorsi es pronosticado por el genotipo SNP-2. Permitiendo a un productor modular inteligentemente la nutrición proporcionada a los animales durante la fase 1 y 2 de su crecimiento, en base a su potencial genético, se maximizará la rentabilidad económica en el potencial genético.

Es de esperar que los animales que poseen varios genotipos SNP de IGF2 tengan diferentes requisitos proteínicos y energéticos. Específicamente cabe esperar que los animales que expresan el genotipo C/C, que está asociado a un mayor tamaño del músculo longissimus dorsi, tengan mayores requisitos proteínicos. Las prácticas de alimentación actuales, en los casos en los que no se distingan los animales en la invención descrita aquí, pueden infraalimentar proteínas a los animales C/C y sobrealimentar proteínas a animales T/T por desconocimiento. En consecuencia, usando el método de la presente invención, los productores podrán maximizar el potencial genético de los animales individuales.

La presente invención también será útil en las estrategias de gestión empleadas en la industria ganadera. En las dos primeras fases de la vida del animal, que incluyen desde el desarrollo esquelético y muscular hasta la madurez fisiológica, los requisitos nutritivos, es decir requisitos de proteína necesarios para cumplir el potencial genético para la acumulación de proteína, se basan generalmente en el grupo, y no en el conocimiento del crecimiento individual o potencial de producción de proteína. Así la variación del potencial animal cambia al hacer la media de la población.

Los métodos actuales de clasificación usan mediciones anecdóticas del cuerpo, clasificando los animales en pequeño, mediano o grande. Una vez clasificados de esta manera, el potencial genético de todos los animales de un corral o grupo es tratado como el mismo. La presente invención demuestra que este método de clasificación es menos preciso que la clasificación por genotipo. Usando el método de la presente invención, la clasificación de animales por su genotipo SNP-2 permite al productor reunir el ganado dentro de un determinado rango esquelético y muscular al conocer su genotipo. En consecuencia, esto también permite preparar a medida los parámetros nutritivos y ambientales para aprovechar completamente el potencial genético de cada animal individual para el desarrollo de tamaño del músculo longissimus dorsi que en última instancia aumentará las eficiencias de producción.

Finalmente, el método de la presente invención permitirá a quienes se dediquen a la industria carnicera satisfacer mejor sus requisitos en cuanto a los productos de carne bovina finales y tasar de forma más precisa el precio de los animales que compran para su tratamiento. Actualmente el tamaño del músculo longissimus dorsi es un pronosticador de cortes finales de alto valor en la carcasa. Cuanto mayor sea el tamaño del músculo longissimus dorsi más valioso es el animal. A través de la aplicación del método de la presente invención, los mataderos conocerán qué "valor" esperar de una carcasa tras su tratamiento, basado en el conocimiento de su genotipo SNP-2. La industria procesadora en consecuencia será capaz de ofrecer animales de forma más precisa que la que es actualmente posible usando métodos de la técnica anterior de clasificación en base al tamaño del cuerpo, pues conocerán si una carcasa tiene un mayor o menor potencial para producir cortes de carne de mayor valor.

Descripción de los dibujos

Aunque la invención es reivindicada en las secciones precedentes, se proveen formas de realización preferidas en la descripción detallada anexa que pueden ser mejor entendidas conjuntamente con los diagramas adjuntos, donde las mismas partes de cada diagrama están marcadas con los mismos números y donde:

Fig. 1: es una comparación de la organización genómica de los genes IGF2 del cerdo, oveja, ser humano, rata, ratón y vaca (Adaptado de Ohlsen et al. 1994, Amarger et al. 2002). Las cajas numeradas representan los exones IGF2. Las cajas abiertas y sólidas indican exones traducidos y sin traducir respectivamente. P1 y P2 son los dos pseudo-exones identificados en el gen IGF2 de ratón (Rotwein y Hall 1990). Los promotores son indicados por P1-P4.

Fig. 2: Fotografía de un gel de agarosa coloreado con bromuro de etidio (3%) de una familia de transferencia embrionaria de un macho Charolais heterocigoto (C/T) y una hembra Limousin homocigota (C/C). Cuatro terneros son heterocigotos por el alelo T y los otros cuatro terneros son homocigotos por el alelo C. El alelo C es de 185 pares de bases y el alelo T es de 118 y 68 pares de bases. No se muestra el producto de 32 pares de bases.

Fig. 3: Fotografía de geles coloreados con bromuro de etidio de experimentos de PCR cuantitativos. El alelo materno es expresado a niveles inferiores que el alelo paterno en un ternero joven (Ternero 1). A los 40 días de edad, hay una pérdida completa de la huella genética en el alelo materno.

Descripción detallada de la invención Definiciones

En la descripción que sigue se utilizan extensivamente varios términos usados en la tecnología de ADN recombinante. Para proporcionar una comprensión clara y consistente de la especificación y reivindicaciones, incluyendo el alcance que se le debe dar a tales términos, se proveen las siguientes definiciones:

Por "amplificar un segmento" como se utiliza aquí, se entiende la producción de suficientes copias múltiples del segmento de ADN para permitir la manipulación relativamente fácil del segmento. Manipulación se refiere tanto a manipulación física como química, es decir, la capacidad de desplazar cantidades en masa del segmento y conducir reacciones químicas con el segmento que generen productos detectables.

Un "segmento" de un polinucleótido se refiere a un oligonucleótido que es una secuencia parcial de toda la secuencia de nucleótidos del polinucleótido.

Un "segmento modificado" se refiere a un segmento donde uno o más nucleótidos naturales han sido sustituidos con uno o más nucleótidos modificados. Un "segmento marcado modificado" se refiere a un segmento modificado que también contiene un nucleótido, que es diferente del nucleótido modificado o de sus nucleótidos y que es marcado de forma que se pueda detectar.

Un "cebador de amplificación" es un oligonucleótido que es capaz de enlazarse de forma contigua a una secuencia objetivo y servir de punto de inicio para la síntesis de ADN cuando es colocado bajo condiciones en las que se inicia la síntesis de un producto de extensión del cebador que es complementario a una cadena de ácido nucleico.

Por "análisis" se entiende bien la detección de variaciones en la secuencia de nucleótidos entre dos o más polinucleótidos relacionados o, alternativamente, la determinación de toda la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido. Por "analizar" fragmentos hibridizados para un marcador incorporado detectable que identifique el polimorfismo sospechado se entiende que, en algún estadio de la secuencia de eventos que conduce a los fragmentos hibridizados, se incorpora un marcador. El marcador puede ser incorporado en prácticamente cualquier estadio de la secuencia de eventos incluyendo los procedimientos de amplificación, división o hibridación. El marcador puede además ser introducido en la secuencia de eventos después de la división y antes o después de la hibridación. El marcador así incorporado es luego observado visualmente o por medios instrumentales. La presencia del marcador identifica el polimorfismo debido al hecho de que los fragmentos obtenidos durante la división son específicos al (a los) nucleótido(s) modificado(s) usado(s) en la amplificación y al menos uno de los nucleótidos modificados es seleccionado para reemplazar un nucleótido implicado en el polimorfismo.

El término "animal" se utiliza en este caso para incluir todos los animales vertebrados, incluyendo seres humanos. También incluye un animal individual en todos los estadios de desarrollo, incluyendo los estadios embrionario y fetal. Como se utiliza en este caso, el término "animales de producción" se usa de forma intercambiable con "ganado" y se refiere generalmente a animales criados principalmente para obtener alimentos de ellos. Por ejemplo, tales animales incluyen, pero no se limitan a, ganado bovino (bovino), ovejas (ovino), cerdos (porcino o puerco), aves de corral (aviar), y similares. Como se utiliza en este caso, el término "vaca" o "bovino" se usa generalmente para referirse a un animal de origen bovino de cualquier edad. Términos intercambiables incluyen "bovino", "ternero", "novillo" "toro", "becerro" y similares. Como se utiliza en este caso, el término "cerdo" se usa generalmente para referirse a un animal de origen porcino de cualquier edad. Términos intercambiables incluyen, "cochinillo" "cerda" y similares.

Por término "antisentido" se entiende moléculas de polinucleótidos complementarias a una parte de un marcador de ARN de un gen, tal y como se define aquí. Polinucleótidos "complementarios" son aquellos que son capaces de formar pares de bases según las reglas de complementariedad estándares de Watson-Crick, donde las purinas forman pares de bases con pirimidinas para formar combinaciones de guanina emparejada con citosina (G:C) y adenina emparejada con bien timina (A:T) en el caso de ADN, o adenina emparejada con uracilo (A:U) en el caso de ARN. La inclusión de menos bases comunes como inosina, 5-metilcitosina, 6-metiladenina, hipoxantina y otros en secuencias de hibridación no interfiere en la formación de pares.

Mediante el término "complementariedad" o "complementario" se entiende, para los objetivos de la especificación o reivindicaciones, un número suficiente en el oligonucleótido de pares de bases complementarios en su secuencia para interactuar específicamente (hibridizar) con la secuencia de ácidos nucléicos objetivo del polimorfismo genético que debe ser amplificado o detectado. Como saben los expertos en la técnica, es necesario un grado altísimo de complementariedad para una hibridación que implique especificidad y sensibilidad aunque no es necesario que sea del 100%. Así, por ejemplo, un oligonucleótido que sea idéntico en secuencia de nucleótidos a un oligonucleótido descrito aquí, salvo por un cambio o sustitución de base, puede funcionar de forma equivalente a los oligonucleótidos descritos. Un gen de "ADN complementario" o "ADNc" incluye genes recombinantes sintetizados por transcripción inversa de ARN mensajero ("ARNm").

Mediante el término "composición" se entiende, para los objetivos de la especificación o reivindicaciones, una combinación de elementos que pueden incluir uno o más de lo siguiente: el tampón de reacción para el método respectivo de amplificación enzimática más uno o más oligonucleótidos específicos para los polimorfismos del gen IGF2, donde dicho oligonucleótido es marcado con una fracción detectable.

Una "reacción cíclica de polimerasa" se refiere a una reacción bioquímica donde una molécula molde o una población de moléculas molde es periódica y reiteradamente copiada para crear una molécula molde complementaria o moléculas molde complementarias, aumentando de ese modo el número de moléculas molde con el tiempo. Los productos de tal reacción son comúnmente llamados productos de amplificación.

La "desnaturalización" de una molécula molde se refiere al despliegue u otra alteración de la estructura de un molde para hacer el molde accesible para la duplicación o hibridación. En el caso de "desnaturalización" de ADN, se refiere a la separación de las dos hebras complementarias de la doble hélice, creando de ese modo dos moléculas molde monocatenarias complementarias. La "desnaturalización" puede ser realizada en cualquier variedad de formas bien conocidas por los expertos en la técnica, incluyendo calor o por tratamiento del ADN con una base u otro desnaturalizante químico.

Una "cantidad detectable de producto" se refiere a una cantidad de ácido nucleico amplificado que puede ser detectada usando herramientas de laboratorio estándares. Un "marcador detectable" se refiere a un análogo de nucleótido que permite la detección usando medios visuales u otros medios. Por ejemplo, se pueden incorporar nucleótidos fluorescentemente marcados en un ácido nucleico durante una o más fases de una reacción cíclica de polimerasa, permitiendo de ese modo la detección del producto de la reacción usando, p. ej. microscopía de fluorescencia u otra instrumentación de detección de fluorescencia.

Mediante el término "fracción detectable" se entiende, para los objetivos de la especificación o reivindicaciones, una molécula marcadora (isotópica o no isotópica) que es incorporada indirecta o directamente en un oligonucleótido, donde la molécula marcadora facilita la detección del oligonucleótido donde es incorporada cuando el oligonucleótido es hibridizado a secuencias de polimorfismo de gen amplificado. Así, "fracción detectable" se usa como sinónimo de "molécula marcadora". La síntesis de oligonucleótidos puede ser realizada por cualquiera de varios métodos conocidos por los expertos en la materia. Las moléculas marcadoras, conocidas por los expertos en la materia como útiles para la detección, incluyen moléculas quimioluminiscentes o fluorescentes. En la técnica se conocen varias moléculas fluorescentes que son adecuadas para el uso para marcar un sustrato de ácido nucleico para el método de la presente invención. El protocolo para este tipo de incorporación puede variar dependiendo de la molécula fluorescente usada. Tales protocolos son conocidos en la técnica para la respectiva molécula fluorescente.

Por "detectablemente marcada" se entiende que un fragmento o un oligonucleótido contiene un nucleótido que es radiactivo, que es sustituido con un fluoróforo o alguna otra especie molecular que suscite una respuesta física o química que pueda ser observada a simple vista o mediante instrumentación tal como, sin limitación, contadores de centelleo, colorímetros, espectrofotómetros de UV y similares. Como se utiliza en este caso, un "marcador" o "etiqueta" se refiere a una molécula que, cuando es añadida mediante, por ejemplo, sin limitación, unión covalente o hibridación, a otra molécula, por ejemplo, también sin limitación, un polinucleótido o fragmento polinucleótido, proporciona o mejora un medio para detectar la otra molécula. Una fluorescencia o marcador o etiqueta fluorescente emite luz detectable a una longitud de onda particular cuando es excitado a una longitud de onda diferente. Una etiqueta radiomarcada o radiactiva emite partículas radiactivas detectables con un instrumento tal como, sin limitación, un contador de centelleo. Otros métodos de detección de generación de señales incluyen: quimioluminiscencia, electroquimioluminiscencia, ramanespectroscopia, colorimetría, ensayo de protección de hibridación, y espectrometría de masas. La "amplificación de ADN" como se utiliza aquí se refiere a cualquier proceso que aumente el número de copias de una secuencia de ADN específica amplificando enzimáticamente la secuencia de ácidos nucléicos. Se conoce una variedad de procesos. Uno de los más comúnmente usados es el proceso de Mullis de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) como se describe en las patentes U.S. Nos. 4,683,195 y 4,683,202. La PCR implica el uso de una ADN polimerasa termoestable, secuencias conocidas como cebadores, y ciclos de calentamiento que separan las hebras de replicación del ácido desoxirribonucleico (ADN) y amplifican exponencialmente un gen de interés. Se puede usar cualquier tipo de PCR, tal como PCR cuantitativa, RT-PCR, PCR hot-start, LA-PCR, PCR multiplex, PCR touchdown, etc. Preferiblemente, se usa la PCR en tiempo real. En general, el proceso de amplificación de PCR implica una reacción en cadena enzimática para preparar cantidades exponenciales de una secuencia de ácidos nucléicos específica. Requiere una pequeña cantidad de una secuencia para iniciar la reacción en cadena y cebadores oligonucleótidos que hibridizarán a la secuencia. En la PCR los cebadores son hibridizados al ácido nucleico desnaturalizado seguido de extensión con un agente de inducción (enzima) y nucleótidos. Esto produce productos de extensión nuevamente sintetizados. Puesto que estos productos nuevamente sintetizados se hacen moldes para los cebadores, los ciclos repetidos de desnaturalización, hibridación del cebador, y extensión generan la acumulación exponencial de la secuencia específica que está siendo amplificada. El producto de extensión de la reacción en cadena será un ácido nucleico dúplex discreto con unos terminales correspondientes a los extremos de los cebadores específicos empleados.

"ADN" se refiere a la forma polimérica de deoxirribonucleótidos (adenina, guanina, timina, o citosina) bien en su forma monocatenaria o una hélice bicatenaria.

Este término se refiere sólo a la estructura primaria y secundaria de la molécula, y no la limita a ninguna forma terciaria particular. Así, este término incluye ADN bicatenario encontrado en moléculas de ADN lineales y circulares incluyendo, pero sin limitarse a fragmentos de restricción, viruses, plásmidos, cósmidos, y cromosomas de origen natural y artificial. Al analizar la estructura de las moléculas de ADN bicatenario particulares, las secuencias pueden ser descritas aquí según la práctica normal de dar sólo la secuencia en la dirección 5' a 3' a lo largo de la cadena no transcrita de ADN (es decir, la cadena que tiene un homólogo de secuencia para el ARNm).

Por los términos "amplificar enzimáticamente" o "amplificar" se entiende, para los objetivos de la especificación o reivindicaciones, la amplificación de ADN por cualquier proceso por el que las secuencias de ácidos nucleicos son amplificadas en número. Hay diferentes medios para amplificar enzimáticamente secuencias de ácidos nucleicos conocidas en el estado de la técnica. Habitualmente el método más frecuentemente usado es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Otros métodos de amplificación incluyen LCR (reacción en cadena de la ligasa) que utiliza ADN ligasa y una sonda que consiste en dos mitades de un segmento de ADN que es complementario a la secuencia del ADN que debe ser amplificado, enzima Q\beta replicasa y un molde de secuencia de ácido ribonucleico (ARN) fijado a una sonda complementaria al ADN que debe ser copiado que se utiliza para hacer un molde de ADN para la producción exponencial de ARN complementario; amplificación por desplazamiento de cadena (SDA); amplificación de Q\beta replicasa (Q\betara); replicación autosostenida (3SR); y NASBA (amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico), que puede ser realizada en ARN o ADN como la secuencia de ácidos nucléicos que debe ser amplificada. La metodología particular usada para amplificar secuencias de ADN no está destinada a ser limitadora, entendiéndose que el ámbito de la invención incluye todos los métodos de amplificación de ADN conocidos en la técnica.

La "extensión de los cebadores" se refiere a la adición de nucleótidos a una molécula cebadora para sintetizar un ácido nucleico complementario a una molécula molde. La "extensión de los cebadares" no implica necesariamente que la molécula cebadora sea extendida para sintetizar una molécula molde complementaria completa. Aunque sólo una fracción de la molécula molde haya sido copiada el cebador sigue siendo considerado extendido.

Un "fragmento" de una molécula tal como una proteína o ácido nucleico se entiende que se refiere a cualquier parte de la secuencia genética de aminoácidos o nucleótidos.

Por "heterocigoto" o "polimorfismo heterocigoto" se entiende que los dos alelos de una célula u organismo diploide en un lugar dado son diferentes, es decir, que tienen un nucleótido diferente cambiado para el mismo nucleótido en la misma posición en sus secuencias.

Por "homocigoto" se entiende que los dos alelos de una célula u organismo diploide en un lugar dado son idénticos, es decir, que tienen el mismo nucleótido para el cambio de nucleótidos en la misma posición en sus secuencias.

Por "hibridización" o "hibridizar" como se usa aquí, se entiende la formación de pares de bases A-T y C-G entre la secuencia de nucleótidos de un fragmento de un segmento de un polinucleótido y una secuencia de nucleótidos complementaria de un oligonucleótido. Por complementario se entiende que en el lugar de cada A, C, G o T (o U en el caso de una molécula de ARN) en la secuencia del fragmento, el oligonucleótido secuenciado tiene un T, G, C o A, respectivamente. El fragmento/oligonucleótido hibridizado es llamado "duplex".En el caso de un híbrido ADN-ARN, la molécula es llamada "heteroduplex".

Un "complejo de hibridización", significa un complejo de moléculas de ácido nucléico que incluye al menos el ácido nucleico objetivo y la sonda sensora. También puede incluir una sonda de anclaje.

Por "inmovilizado en un soporte sólido" se entiende que un fragmento, cebador u oligonucleótido es fijado a una sustancia en una ubicación particular de manera que el sistema que contiene el fragmento, cebador u oligonucleótido inmovilizado puede ser sometido a lavado u otra manipulación física o química sin ser desplazado de esa ubicación. En el estado de la técnica se conocen varios soportes y medios sólidos para inmovilizar en ellos moléculas conteniendo nucleótidos; cualquiera de estos soportes y medios pueden ser usados en los métodos de esta invención.

Como se utiliza en este caso, el término "molécula de ácido nucleico" se destina a incluir moléculas de ADN (p. ej., ADNc o ADN genómico), moléculas de ARN (p. ej., ARNm), análogos del ADN o ARN generado usando análogos de nucleótidos y derivados, fragmentos y homólogos de los mismos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferiblemente es ADN bicatenario. Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una que es separada de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Un "nucleósido" se refiere a una base enlazada a un azúcar. La base puede ser adenina (A), guanina (G) (o su sustituto, inosina (I)), citosina (C), o timina (T) (o su sustituto, uracilo (U)). El azúcar puede ser ribosa (el azúcar de un nucleótido natural en ARN) o 2- deoxirribosa (el azúcar de un nucleótido natural en ADN). Un "nucleótido" se refiere a un nucleósido enlazado a un único grupo fosfato.

Como se utiliza en este caso, el término "oligonucleótido" se refiere a una serie de residuos nucleótidos enlazados, cuyo oligonucleótido tiene un número suficiente de bases de nucleótidos para usar en una reacción PCR. Una secuencia oligonucleótida corta puede basarse en, o ser diseñada a partir de una secuencia de ADNc o genómica y se usa para amplificar, confirmar o revelar la presencia de un ADN o ARN idéntico, similar o complementario en una célula o tejido particular. Los oligonucleótidos pueden ser químicamente sintetizados y pueden ser usados como cebadores o sondas. Oligonucleótidos significa cualquier nucleótido superior a 3 bases de longitud usado para facilitar la detección o identificación de un ácido nucleico objetivo, incluyendo sondas y cebadores.

La "reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR" se refiere a una reacción de amplificación de ADN termocíclica mediada por polimerasa. Una PCR normalmente incluye moléculas molde, cebadores oligonucleótidos complementarios a cada cadena de las moléculas molde, una ADN polimerasa termoestable, y deoxirribonucleótidos, e implica tres procesos diferentes que son repetidos varias veces para efectuar la amplificación del ácido nucleico original. Los tres procesos (desnaturalización, hibridación y prolongación del cebador) son generalmente realizados a temperaturas diferentes y en distintos tiempos. En muchas formas de realización, no obstante, los procesos de hibridación y prolongación del cebador pueden ser realizados al mismo tiempo. La muestra de nucleótidos que debe ser analizada puede ser de productos de amplificación PCR proporcionados usando las técnicas de oscilación rápida descritas en la patente U.S. Nº. 5,455,175. Otros métodos de amplificación incluyen, sin limitación, NASBR, SDA, 3SR, TSA y replicación de círculo rodante. Se entiende que, en cualquier método para la producción de un polinucleótido conteniendo determinados nucleótidos modificados, se pueden usar uno o diferentes métodos de amplificación o polimerasas. La selección de las condiciones óptimas de polimerización depende de la aplicación.

Una "polimerasa" es una enzima que cataliza la adición secuencial de unidades monoméricas a una cadena polimérica, o enlaza dos o más unidades monoméricas para iniciar una cadena polimérica. En formas de realización preferidas de esta invención, la "polimerasa" trabajará añadiendo unidades monoméricas cuya identidad es determinada por y es complementaria a una molécula molde de una secuencia específica. Por ejemplo, las ADN polimerasas tales como ADN polimerasa Pol I y Taq añaden deoxirribonucleótidos al extremo 3' de una cadena de polinucleótidos de una manera dependiente del molde, sintetizando de ese modo un ácido nucleico que es complementario a la molécula molde. Las polimerasas pueden ser usadas bien para extender un cebador una vez o repetidamente o para amplificar un. polinucleótido por cebado repetitivo de dos hebras complementarias usando dos cebadores.

Un "polinucleótido" se refiere a una cadena lineal de nucleótidos conectados por un enlace fosfodiéster entre el grupo 3'-hidróxilo de un nucleósido y el grupo 5'-hidróxilo de un segundo nucleósido, que a su vez es enlazado a través de su grupo 3'-hidróxilo al grupo 5'-hidróxilo de un tercer nucleósido, etcétera, para formar un polímero compuesto por nucleósidos enlazados por un esqueleto de fosfodiéster. Un "polinucleótido modificado" se refiere a un polinucleótido donde uno o más nucleótidos naturales han sido parcial o sustancialmente sustituidos completamente con nucleótidos modificados.

Un "cebador" es un oligonucleótido corto cuya secuencia es complementaria a un segmento del molde que está siendo replicado y que usa la polimerasa como el punto de partida para el proceso de replicación. Por "complementario" se entiende que la secuencia de nucleótidos de un cebador es tal que el cebador puede formar un enlace de hidrógeno estable complejo con el molde; es decir, el cebador puede hibridizar al molde en virtud de la formación de pares de base sobre una longitud de al menos diez pares de bases consecutivos.

Los cebadores aquí son seleccionados para que sean "substancialmente" complementarios a diferentes hebras de una secuencia de ADN objetivo particular. Esto significa que los cebadores deben ser suficientemente complementarios para hibridizar con sus hebras respectivas. En consecuencia, la secuencia del cebador no necesita reflejar la secuencia exacta del molde. Por ejemplo, un fragmento nucleótido no complementario puede ser fijado en el extremo 5' del cebador, con el resto de la secuencia del cebador siendo complementario a la cadena. De forma alternativa se pueden intercalar bases o secuencias más largas no complementarias en el cebador, siempre que la secuencia del cebador tenga complementariedad suficiente con la secuencia de la cadena para hibridizarla y de ese modo formar el molde para la síntesis del producto de extensión.

Una "enzima de restricción" se refiere a una endonucleasa (una enzima que divide enlaces de fosfodiéster dentro de una cadena de polinucleótidos) que divide el ADN en respuesta a un sitio de reconocimiento en el ADN. El sitio de reconocimiento (sitio de restricción) consiste en una secuencia específica de nucleótidos normalmente de aproximadamente 4 - 8 nucleótidos de larga.

Un "polimorfismo de nucleótido simple" o "SNP" se refiere a un polinucleótido que difiere de otro polinucleótido por un único intercambio de nucleótidos. Por ejemplo, sin limitación, el cambio de un A por un C, G o T en la secuencia entera de polinucleótidos constituye un SNP. Por supuesto, es posible tener más de un SNP en un polinucleótido particular. Por ejemplo, en un lugar de un polinucleótido un C puede ser cambiado por un T, en otro lugar un G puede ser cambiado por un A, etcétera. Cuando se hace referencia a los SNPs, el polinucleótido suele ser ADN y el SNP es uno que normalmente produzca un cambio en el genotipo que está asociado a un cambio correspondiente en el fenotipo del organismo donde el SNP ocurre.

Como se utiliza en este caso, un "molde" se refiere a una cadena de polinucleótidos objetivo, por ejemplo, sin limitación, una cadena de ADN no modificado de origen natural, que usa una polimerasa como medio para reconocer qué nucleótido debería ser incorporado a continuación en una cadena de crecimiento para polimerizar el complemento de la cadena de origen natural. Tal cadena de ADN puede ser monocatenaria o puede ser parte de un molde de ADN bicatenario. En las aplicaciones de la presente invención que requiere ciclos repetidos de polimerización, p. ej., la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la propia cadena del molde puede ser modificada por incorporación de nucleótidos modificados, pudiendo seguir sirviendo de molde para una polimerasa para sintetizar polinucleótidos adicionales.

Una "reacción termocíclica" es una reacción multifase donde al menos dos fases son realizadas cambiando la temperatura de la reacción.

Un "polimerasa termoestable" se refiere a una enzima ADN o ARN polimerasa que puede resistir temperaturas extremadamente altas, tal como aquellas que se aproximan a 100ºC.

Las polimerasas termoestables son normalmente aisladas de organismos que habitan a temperaturas extremas, tales como el Thermus aquaticus. Ejemplos de polimerasas termoestables incluyen Taq, Tth, Pfu, Vent, UITma, y sus variaciones y derivados.

Una "variante" es una diferencia en la secuencia de nucleótidos entre polinucleótidos relacionados. La diferencia puede ser la deleción de uno o más nucleótidos de la secuencia de un polinucleótido en comparación con la secuencia de un polinucleótido relacionado, la adición de uno o más nucleótidos o la sustitución de un nucleótido por otro. Los términos "mutación", "polimorfismo" y "variante" son usados de forma intercambiable aquí para describir tales variantes. Como se utiliza en este caso, el término "variante" en singular debe ser interpretado como que incluye múltiples variaciones; es decir, dos o más adiciones de nucleótidos, deleciones y/o sustituciones en el mismo polinucleótido. Una "mutación puntual" se refiere a una única sustitución de un nucleótido por otro.

La presente invención también hace uso de varias secuencias oligonucleótidas como se describe en este caso como cebadores para el uso en la reacción de amplificación de ADN o como sondas de hibridación. Los expertos en la técnica saben muy bien que tales oligonucleótidos pueden ser modificados en cuanto a longitud e incluso especificidad, y éstos seguirán siendo muy adecuados para la práctica de la invención. Como tal, la invención no se limita a los oligonucleótidos precisos descritos sino que se entiende que incluye todos aquellos oligonucleótidos que permiten que el método de la invención se realice como se describe aquí.

Ejemplos experimentales Materiales y métodos Animales

Se usaron varias familias bovinas Holstein compuestas por sementales y hembras para estudiar la huella genética. Se usaron 17 familias del ganado bovino de referencia canadiense para estudiar los efectos de las mutaciones del IGF2 en la huella genética.

PCR

Se diseñaron cebadores para el exón 2 en base a la secuencia Bos taurus de un buey novillo cruzado y obtenido en nuestro laboratorio (GenBank #AY237543).

SNPs

Condiciones de la reacción en cadena de la polimerasa: Las reacciones PCR de 15 \mul contenían 1 \mul de molde de ADN (50-100 ng), 1,5 pl de 10X tampón PCR (Invitrogen), 0,45 \mul de 50 mM de MgCl_{2}, 0,3 \mul de 10 mM de dNTPs, 0,1 \mul polimerasa Taq (5 U \mul^{-1}: Invitrogen), 1 \mul de cada cebador (10 pM \mul^{-1}) y 9,6 \mul de dd H_{2}O). La reacción empezó con una fase de 4 min a 94ºC, seguida de 34 ciclos de 50 segundos a 94ºC, 50 segundos a 64ºC, y 50 segundos a 72ºC. La digestión de 8 pl de cada producto PCR fue realizada con 1 \mul de Bsrl (5 U \mul^{-1}) durante 3 horas a
65ºC.

Secuencias del cebador

Directa:	5'-CCTCAGCCTCATCCCCTCCTTTGC-3'	(SEC ID NO 2)
Inversa:	5'-CTGTGCTCTATTTGCTGTGTTGTCT-3'	(SEC ID NO 3)

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Resultados y Explicación Secuenciación

Se obtuvo la secuencia genómica usando las 17 familias del ganado bovino de referencia canadiense de 5 sementales de las familias CBRH y dos terneros Holstein, así como el buey novillo cruzado original. Una parte de la secuencia del gen IGF2 es mostrada como SEC ID NO: 1. Dos polimorfismos de nucleótido simple (SNPs) fueron descubiertos en el gen IGF2. Un SNP fue localizado en el extremo 3' de 8 intrones, y un segundo en la parte central del exón 2 (SNP-2).

Se encontró que un fragmento de 217bp de PCR del gen IGF2 (SEC ID NO: 1) contenía un sitio de restricción Bsrl interno en la posición 32. La presencia de SNP-2 (una transición C - T) en el nucleótido 150 dio como resultado la creación de un sitio de restricción Bsrl adicional. Así, después de la digestión con Bsrl el ADN derivado del alelo C dió fragmentos Bsrl de 32 y 185 pares de bases, mientras que el ADN derivado del alelo T dio fragmentos Bsrl de 32, 67 y 118 pares de bases. Se disolvieron de nuevo los alelos en un 3% de gel de agarosa (figs. 2).

Huella genética

Se usó el SNP-2 para determinar si IGF2 era paternalmente expresado en ganado bovino. Para probar la huella genética se recogieron tejidos de varios terneros heterocigotos Holstein para SNP-2. Los terneros variaban de 1 a 560 días de edad. También se elaboró el genotipo de la madre y del padre del ternero para asignar un progenitor de origen para cada alelo en una familia informativa. Se extrajo el ARN mensajero y se analizó su expresión de alelo parental. En el día 1 de edad los terneros expresaban sólo el alelo paterno. Sobre los 11 días de edad se podía detectar la expresión del ANRm del IGF2 del alelo materno pero era a niveles inferiores a los observados para el alelo paterno. No obstante, sobre las 4 semanas de edad, todos los terneros expresaban el ARNm de ambos alelos materno y paternos igualmente (Fig. 3).

Se ha encontrado una pérdida de la huella de IGF2 en seres humanos y ovejas según va envejeciendo el animal. En ovejas, sobre los 6 meses de edad el hígado ha perdido su huella y el IGF2 era expresado de forma similar de ambos alelos materno y paterno. Por el contrario, la expresión en el riñón seguía mostrando los efectos de la huella (McLaren y Montgomery 1999). Tal pérdida de la huella no ha sido demostrada en roedores, probablemente debido a la falta de un equivalente funcional al promotor P1 humano (Ohlsen et al. 1994).

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Efectos

Como en la mayoría de los tejidos examinados el exón 2 no es transcrito, no sería de esperar que el SNP-2 tuviera ningún efecto directo en bien la estructura o niveles de la proteína IGF2. No obstante, en el hígado, el exón 2 es transcrito. Así, las mutaciones en el exón 2 podrían afectar la expresión de gen IGF2, bien a través de cambios en la estabilidad o eficiencia traduccional del ARNm del IGF2, aunque las secuencias del exón 2 no codifican parte del final de la proteína IGF2. SNP-2 puede causar también cambios en la eficiencia transcripcional.

Los análisis preliminares que examinaban los efectos del SNP-2 sugirieron una correlación con el mayor tamaño del músculo longissimus dorsis (REA). El tamaño del músculo longissimus dorsi fue corregido según el sexo de la descendencia; 108 de la descendencia fueron bien C/C o C/T. En animales de 19 - 20 meses de edad la descendencia heterocigota C/T tenía un tamaño del músculo longissimus dorsi significativamente más pequeño que la descendencia homocigota C/C (T = 3,625, P = 0,0004). El músculo longissimus dorsi medio en animales C/C fue 109,8 cm^{2} (N = 93) en comparación con 100,4 cm^{2} (N = 29) en los animales C/T. En las 125 piezas de ganado bovino estudiadas, el tamaño del músculo longissimus dorsi fue significativamente correlacionado con el número de alelos C presentes en la población (R = 0,39, P =0,0001).

El análisis de un segundo grupo de datos proporcionó un soporte adicional para una correlación entre el SNP-2 y el músculo longissimus dorsi mayor. En el segundo estudio de 167 toros, el músculo longissimus dorsi fue positivamente correlacionado con el número de alelos C en la población (R = 0,155, P = 0,0459). Las piezas de ganado bovino con un genotipo C/C tenían un músculo longissimus dorssi significativamente más grande que las piezas de ganado bovino con genotipo C/T o T/T (t= 2,057, P = 0,0413). Aunque el tamaño del músculo longissimus dorsi fue también correlacionado con el peso de la carcasa (R = 0,382, P = 0,0001), no hubo ninguna correlación significante entre el SNP-2 y el peso de la carcasa corregida según el sexo (R = 0,096, P = 0,2855). Esto sugiere que el IGF2 afecta al crecimiento muscular pero no al crecimiento global (peso total de la carcasa del animal).

Cuando se examinó el efecto del SNP-2 en el tamaño del músculo longissimus dorsi y en la grasa, también se descubrió que el alelo C está asociado al mayor tamaño del músculo longissimus dorsi y menor grasa mientras que el alelo T está asociado a un menor tamaño del músculo longissimus dorsi y mayor grasa. El efecto neto es que no hay ningún efecto en el peso global de la carcasa. Consistente con esta interpretación, otros estudios revelan que el SNP-2 tiene un efecto significante en la grasa corregido según el sexo (T = - 1,881, P = 0,0624) y veteado corregido según el sexo (T = -1,874, P = 0,0633) en las piezas de ganado bovino C/C. Los animales C/C tenían una grasa media de 9,07 y un veteado medio de 457,7 (N = 93) mientras que los animales C/T tenían una grasa media de 10,68 y un veteado medio de 485,0 (N = 29). Estos resultados indican que el IGF2 afecta a la grasa y puede también funcionar como un agente distribuidor. Estos resultados además demuestran que el SNP-2 afecta al tamaño muscular pero no al peso global. El efecto en el músculo longissimus dorsi está significativamente correlacionado con el número de alelos C sugiriendo un patrón hereditario codominante.

El tamaño del músculo longissimus dorsi fue correlacionado con el peso bruto al nacer (R = 0,188, P = 0,0001). Los análisis preliminares que examinaron los efectos del SNP-2 sugirieron una correlación con el peso al nacer dependiendo del alelo heredado del padre. El peso de nacimiento fue corregido según el sexo de la descendencia: 108 animales tenían un alelo C y 14 tenían un alelo T paterno. La descendencia que tenía un alelo C paterno tuvo un peso al nacer significativamente inferior que la descendencia que heredó un alelo T paterno (T = 2,516, P = 0,0132). El peso medio al nacer corregido según el sexo para la descendencia con alelo C paterno fue de 112,9 lbs (N = 108) en comparación con 123,3 lbs (N = 14) en la descendencia con el alelo T paterno. No se observó este efecto cuando se consideró el alelo materno (T = 0,992, P = 0,3234).

El resultado de los presentes estudios es que el SNP-2 del IGF2 puede utilizarse para predecir el tamaño del músculo longissimus dorsi en la descendencia bovina en base al conocimiento del genotipo del animal. La invención proporciona así un método más preciso para predecir el tamaño del músculo longissimus dorsi y supone una mejora al método previo de clasificación fenotípica de animales basado en el tamaño del cuerpo, que por lo que sabemos no está bien correlacionado con el tamaño del músculo longissimus dorsi.

Además, el genotipo SNP-2 del padre puede utilizarse para predecir el peso de nacimiento de los terneros. Como el alelo del IGF2 materno no es expresado durante la gestación no influye en el peso de nacimiento del ternero. En consecuencia los machos C/C que pasarán el alelo C del IGF2 a su descendencia y así producirán sólo terneros de "bajo peso al nacer" pueden ser seleccionados y comercializados en base a estos resultados. Por el contrario, cuando un productor desee terneros con mayor peso al nacer, la cría de machos T/T producirá terneros con este fenotipo. Cuando se desee un rebaño mixto, la cría de machos C/T generará una descendencia de un peso al nacer alto vs. bajo en un número aproximadamente igual como resultado de la segregación normal Mendeliana de alelos.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante fue recopilada exclusivamente para la información del lector y no forma parte del documento de la patente europea. La misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u omisiones.

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Documentos de patente citados en la descripción

\bullet US 4683195 A [0044]

\bullet US 5455175 A [0057]

\bullet US 4683202 A [0044]

\bullet US 60489026 B, 2003 [0084]

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE:

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Schmutz, Sheila Marie

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RR # 2, Box 123

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Saskatoon, SK, Canadá

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S7K 3J5

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Julie Janine Goodall

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101B-815 Reid Road,

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Saskatoon, SK, Canadá

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S7N 2W8

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Mejora en las Características de producción del ganado bovino

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 3

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(iv)

DIRECCIÓN POSTAL:

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Furman & Kallio

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1400 - 2002 Victoria Avenue

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Regina, SK, Canadá

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S4P 0R7

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(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

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ORDENADOR: servidor Dell

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SISTEMA OPERATIVO: Windows XP Profesional

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SOFTWARE: Microsoft Word - Office Versión 2004

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(vi)

DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:

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NÚMERO DE SOLICITUD:

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FECHA DE SOLICITUD:

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CLASIFICACIÓN:

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(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/489,026

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FECHA DE SOLICITUD: Julio 23, 2003

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CLASIFICACIÓN

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(viii)

INFORMACIÓN DEL AGENTE DE PROPIEDAD INDUSTRIAL:

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a)

NOMBRE:

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Furman & Kallio

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1400 - 2002 Victoria Avenue

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Regina, SK, Canadá

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S4P 0R7

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b)

NÚMERO DE REFERENCIA: 1709-03-00

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 1

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(a)

LONGITUD: 217 pares de bases

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(b)

TIPO: nucleótido

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(c)

TIPO DE CADENA: bicatenario

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(d)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

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(iii)

HIPOTÉTICO: ninguno

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(iv)

ANTISENTIDO: ninguno

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(vi)

FUENTE ORIGINAL: Bos taurus

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(viii)

POSICIÓN EN GENOMA:

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a)

SEGMENTO CROMOSÓMICO: BTA 29

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b)

POSICIÓN MAPA: 0 cM de ILSTS081

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c)

UNIDADES: centiMorgans

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(ix)

CARACTERÍSTICA:

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a)

NOMBRE/CLAVE: SNP-2

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b)

UBICACIÓN: 150 bp

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c)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: secuenciación del ADN de productos PCR

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d)

OTRAS INFORMACIONES: crea un sitio de restricción Bsrl adicional; afecta al peso de nacimiento, tamaño del músculo longissimus dorsi, contenido de grasa y veteado corregidos por sexo,

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(x)

INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN:

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a)

AUTORES: Goodall, J.J. y Schmutz, S.M.

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b)

TÍTULO: Mapeo cte enlace de IGF2 en el cromosoma bovino 29

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c)

REVISTA: Genética animal

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d)

VOLUMEN: 34

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e)

EDICIÓN: 4

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f)

PÁGINAS: 313 - 313

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j)

FECHA DE PUBLICACIÓN: Agosto 2003

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k)

RESIDUOS PERTINENTES EN SECUENCIA ID Nº: 2: residuo C o T en la posición 150

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 1

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1

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 2

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(a)

LONGITUD: 24 nucleótidos

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(b)

TIPO: nucleótido

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(c)

TIPO DE CADENA: monocatenario

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(d)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: (cebador) ADN

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(iii)

HIPOTÉTICO: ninguno

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(iv)

ANTISENTIDO: ninguno

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 2

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctcagcctc atcccctcct ttgc

\hfill

24

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 3

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(a)

LONGITUD: 25 nucleótidos

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(b)

TIPO: nucleótido

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(c)

TIPO DE CADENA: monocatenario

\vskip0.500000\baselineskip

(d)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: (cebador) ADN

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(iii)

HIPOTÉTICO: ninguno

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(iv)

ANTISENTIDO: ninguno

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 3

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgtgctcta tttgctgtgt tgtct

\hfill

25

Claims (15)

1. Método para identificar un fenotipo en ganado bovino, el método comprendiendo:

detectar un polimorfismo presente en el gen IGF2 en la posición 150 de la SEC ID NO: 1; y

donde la presencia de un residuo C (un alelo C) está asociada al fenotipo de mayor tamaño del músculo longissimus dorsi en comparación con el bovino con un residuo T (alelo T) en la posición 150 de la SEC ID NO: 1.

2. Método según la reivindicación 1 donde la detección del polimorfismo comprende:

aislar una muestra de ADN genómico de bovino;

amplificar una región del gen IGF2 bovino usando un par de oligonucleótidos para formar productos de amplificación de ácido nucleico comprendiendo secuencias de polimorfismo del gen IGF2 amplificado;

analizar los productos de amplificación para determinar la presencia o ausencia de al menos un alelo C.

3. Método según la reivindicación 2 donde el par de oligonucleótidos comprende la SEC ID NO: 2 y la SEC ID NO: 3.

4. Método según la reivindicación 3 donde el polimorfismo detectado es un polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP).

5. Método según la reivindicación 4 donde el RFLP es la presencia o ausencia de un sitio de restricción Bsrl en el nucleótido 150 en un producto de amplificación de ácido nucleico producido por amplificación de una porción del gen IGF2 usando la SEC ID NO 2 y la SEC ID NO: 3 del par de oligonucleótidos.

6. Método según la reivindicación 2 comprendiendo además la inclusión de una fracción detectable de manera que el producto de amplificación comprenda un producto de amplificación marcado.

7. Método según la reivindicación 6 donde la fracción detectable es seleccionada del grupo que consiste en fracciones fluorescentes, bioluminescentes, quimioluminiscentes, radiactivas y colorigénicas.

8. Método según la reivindicación 1 comprendiendo además:

poner en contacto los productos de amplificación del ácido nucleico con una sonda de hibridación;

donde las sondas de hibridación comprenden al menos un oligonucleótido marcado con una fracción detectable;

bajo condiciones adecuadas que permitan la hibridación del al menos un oligonucleótido para el producto de amplificación para formar un complejo de hibridación; y

donde la presencia de la fracción detectable en el complejo de hibridación indica la presencia de un polimorfismo de IGF2.

9. Método según la reivindicación 1 donde el producto de amplificación del ácido nucleico es producido por un método de amplificación seleccionado del grupo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación de desplazamiento de cadena (SDA), amplificación basada en la secuencia de ácidos nucléicos (NASBA), amplificación de círculo rodante, amplificación mediada por polimerasa T7, amplificación mediada por polimerasa T3 y amplificación mediada por polimerasa SP6.

10. Ácido nucleico aislado y purificado que comprende una parte del gen IGF2 bovino, comprendiendo además un polimorfismo en la posición 150 tal y como se define por las posiciones en SEC ID NO: 1, y en el cual hay un residuo C o un residuo T en la posición 150.

11. Método para seleccionar un individuo bovino basado en el conocimiento de un genotipo IGF2 del animal que incluye las etapas de:

determinar los alelos del IGF2 de un animal;

donde los alelos de un animal son uno de C/C, CT, o T/T respecto a la posición 150 de SEC ID NO: 1; y

clasificar los animales en grupos con el mismo genotipo; y

donde un genotipo C/C o C/T está asociado al fenotipo de mayor músculo longissimus dorsi, en comparación con el bovino T/T.

12. Kit de diagnóstico para determinar el genotipo IGF2 de un animal bovino, el kit comprendiendo:

cebadores oligonucleótidos para amplificar una parte del gen IGF2;

los cebadores comprendiendo un cebador directo comprendiendo, en su extremo 3', idéntica secuencia a por lo menos 10 nucleótidos contiguos dentro de la SEC ID NO: 1;

un cebador inverso comprendiendo, en su extremo 3', una secuencia de nucleótidos completamente complementaria a por lo menos 10 nucleótidos contiguos con la SEC ID NO: 1;

y donde los cebadores directo e inverso producirán, en una reacción de amplificación PCR, un producto de amplificación del producto de ácido nucleico conteniendo un residuo correspondiente a la posición 150 de la SEC ID NO: 1.

13. Kit según la reivindicación 12 donde los cebadores comprenden los oligonucleótidos de SEC ID NO: 2 y SEC ID NO: 3.

14. Kit según la reivindicación 12 donde los cebadores son marcados con una fracción detectable.

15. Kit según la reivindicación 12 comprendiendo además al menos un oligonucleótido marcado con una fracción detectable y adecuado para el uso como una sonda de hibridación.