CN117925828B - 确定smn基因突变位于smn1基因或smn2基因上的系统及其方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供确定SMN基因突变位于SMN1基因或SMN2基因上的系统及其方法，所述SMN基因突变位于第一外显子和第七外显子之间，所述系统包括第一组成、第二组成和第三组成，所述第三组成用于确定一个或多个待检测突变是位于SMN1基因或SMN2基因上的试剂盒，所述第三组成是多重数字PCR试剂盒。本发明提供一种分别基于qPCR和ddPCR技术的一种分层筛查、检测SMN1基因中微小变异的方法，将筛查到的已知微小变异进行基因连锁定位，双向确定微小变异位于SMN1基因上还是SMN2。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别涉及确定SMN基因突变位于SMN1基因或SMN2基因上的系统及其方法。
背景技术
人基因组有两个高度同源的运动神经元存活基因（survival motor neuron，SMN），包括SMN1和SMN2，两者相邻，位于5q13.2，SMN1在端粒侧，SMN2在着丝粒侧。SMN1和SMN2同源性大于99.9%，仅存在5个碱基差异，其中位于第7外显子第6位c.840的C/T（SMN1为c.840 C，SMN2为c.840 T）导致90%的SMN2 mRNA第7外显子被选择性剪接，仅有10%的SMN2表达全长有功能的SMN蛋白。SMA是由于SMN1发生纯合或复合杂合突变（杂合缺失伴点突变）导致。
SMN1外显子7缺失大部分会合并外显子8共同缺失，少部分仅为外显子7缺失。而SMN1微小变异在不同种族患者中表现出不同的变异谱系，目前国内外已报道的微小变异约90种（http://www.hgmd.cf.ac.uk/），中国患者已报道近30种，其中检测频次≥2，并经美国医学遗传与基因组学学会（ACMG）致病性评估确认的微小变异有7种，见表1。
表1 中国人群常见SMN1微小变异位点
。
SMA作为单基因遗传病，通过对SMN1的基因检测而实施三级预防策略可有效降低SMA的发生率，是防治SMA的最佳选择。但由于SMN1基因的特点，针对SMA携带者筛查、新生儿筛查或是SMA产前诊断，现有的检测技术主要是针对SMN1基因第7外显子的拷贝数检测，不能分析SMN1基因的微小变异，故不能覆盖有所携带者和新生儿。对携带者筛查来说，现有检测方法检出率只有91-94%，遗漏率为2-5%；对新生儿筛查或产前诊断来说，检出率只有95%，遗漏率为5%。
SMN基因的微小变异只有位于SMN1上才有临床意义。目前，国内外均无针对SMN1微小变异检测的有效技术方法，造成这一困局的原因是：SMN1和SMN2基因高度同源，仅有5个碱基的差异；两基因长度均为28kb，常见微小变异位点与差异位点c840C＞T之间的距离远大于常规检测方法如长片段PCR的扩增能力；SMN1基因的外显子和内含子均可发生微小变异，同时SMN1的常见错义突变和移码突变，产生提前终止密码子，导致无义介导的mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay，NMD），因此，基于mRNA逆转录的基因突变检测也受限。可以说，常规的检测方法无法避免SMN2基因的干扰，即无法确定检测到的微小变异是位于SMN1基因上，还是位于SMN2基因上。
目前尝试检测SMN1微小变异常采用3种策略：（1）SMN1特异性长片段PCR结合巢式PCR：如发明CN107058575A 提供的，根据SMN1和SMN2差异碱基，设计等位基因特异性引物用以特异性扩增整个SMN1基因组DNA序列，再以长片段扩增产物作为模板通过巢式PCR扩增每个外显子区域，通过Sanger测序检测SMN1序列是否存在基因变异；（2）RT-克隆测序方法：如发明CN107881214A提供的，由于SMN1微小变异会导致无义介导的mRNA降解机制，使SMN1mRNA的丰度低，通过用shRNA处理患者的细胞抑制该降解机制，然后提取总RNA，通过逆转录qPCR方法对目标突变进行检测，或是根据SMN1和SMN2差异碱基挑选SMN1单克隆，通过Sanger测序方法检测来源于SMN1的cDNA基因变异。（3）长读长三代测序：如CN114317728A提供的一种基于长片段PCR扩增，结合读长测长的三代纳米孔测序平台，检测SMA相关2种基因中的多种突变。前两种方法，样本处理的工作量巨大、时间长，程序复杂，耗费大量人力，成本高昂，效率低下；第一、三种方法需要通过ARMS-PCR长片段扩增SMN1，以区别于SMN2，而SMN1基因长度为28kb，现有的长片段结合c.840C差异位点的ARMS-PCR，对扩增超过5kb的片段，扩增技术和操作难度非常大，扩增效率低。而且第三种方法的成本极高，检测时间长。故这三种方法均不适合基于规模人群的携带者筛查和新生儿筛查，多用于科研，无法应用到临床。
发明内容
为了克服上述问题， 本发明提供一种确定SMN基因突变位于SMN1基因或SMN2基因上的系统，所述SMN基因突变位于第一外显子和第七外显子之间，所述系统包括以下组成：
第一组成，所述第一组成用于检测SMN基因第一外显子和第七外显子之间一个或多个待检测突变是否存在的试剂盒；
第二组成，人基因组DNA提取试剂盒，所述DNA提取试剂盒提取的人基因组DNA片段长度不小于50kb；
第三组成，所述第三组成用于确定一个或多个待检测突变是位于SMN1基因或SMN2基因上的试剂盒，所述第三组成是多重数字PCR试剂盒，所述多重数字PCR试剂盒包括：检测SMN1上第7外显子上第6位的差异位点c.840 C的数字PCR引物和探针，SMN1上第7外显子上第6位的差异位点c.840 C作为第一锚定位点，和第二组成提取的人基因组DNA，其作为数字PCR检测中使用的模板；
检测SMN2上第7外显子上第6位的差异位点c.840 T的数字PCR引物和探针，SMN2上第7外显子上第6位的差异位点c.840 T作为第二锚定位点；
检测所述一个或多个待检测突变的数字PCR引物和探针；
检测第一锚定位点、第二锚定位点和一个或多个待检测突变的探针标记不同的荧光，在检测结果中，若第一锚定位点与一个待检测突变双阳性液滴与总阳性液滴比值比第二锚定位点与所述待检测突变双阳性液滴与总阳性液滴比值高，则该待检测突变位于SMN1基因上；若第二锚定位点与一个待检测突变双阳性液滴与总阳性液滴比值比第一锚定位点与所述待检测突变双阳性液滴与总阳性液滴比值高，则该待检测突变位于SMN2基因上。
在一种实施方式中，第一组成是用于检测SMN基因第一外显子和第七外显子之间一个或多个待检测突变荧光定量PCR试剂盒。
在一种实施方式中，所述DNA提取试剂盒提取的人基因组DNA片段长度在50-250kb之间。
在一种实施方式中，所述第一组成是用于检测SMN基因上c.22dupA、c.400G>A、c.463_464delAA、c.683T>A、c.689C>T、c.835-5T>G、c.863G>T中一个或多个突变是否存在的试剂盒。
在一种实施方式中，所述试剂盒是熔解曲线法qPCR检测试剂盒，所述试剂盒包括以下引物和探针：
。
在一种实施方式中，所述第三组成包括以下引物和探针，
。
在一种实施方式中，本发明提供一种确定SMN基因突变位于SMN1基因或SMN2基因上的方法，所述SMN基因突变位于第一外显子和第七外显子之间，所述方法包括以下步骤：
步骤1，检测SMN基因第一外显子和第七外显子之间是否存在一个或多个待检测突变；
步骤2，若存在一个或多个待检测突变，通过多重数字PCR试剂盒确定一个或多个待检测突变是位于SMN1基因或SMN2基因上，所述多重数字PCR试剂盒包括：检测SMN1上第7外显子上第6位的差异位点c.840 C的数字PCR引物和探针，SMN1上第7外显子上第6位的差异位点c.840 C作为第一锚定位点；片段长度不小于50kb的人基因组DNA，其作为数字PCR检测中使用的模板；
检测SMN2上第7外显子上第6位的差异位点c.840 T的数字PCR引物和探针，SMN2上第7外显子上第6位的差异位点c.840 T作为第二锚定位点；
检测所述一个或多个待检测突变的数字PCR引物和探针；
检测第一锚定位点、第二锚定位点和一个或多个待检测突变的探针标记不同的荧光，在检测结果中，若第一锚定位点与一个待检测突变双阳性液滴与总阳性液滴比值比第二锚定位点与所述待检测突变双阳性液滴与总阳性液滴比值高，则该待检测突变位于SMN1基因上；若第二锚定位点与一个待检测突变双阳性液滴与总阳性液滴比值比第一锚定位点与所述待检测突变双阳性液滴与总阳性液滴比值高，则该待检测突变位于SMN2基因上。
在一种实施方式中，步骤1中通过熔解曲线法qPCR方法检测SMN基因第一外显子和第七外显子之间是否存在一个或多个待检测突变。
在一种实施方式中，所述一个或多个待检测突变是c.22dupA、c.400G>A、c.463_464delAA、c.683T>A、c.689C>T、c.835-5T>G、c.863G>T中一个或多个突变。
本发明的SMN基因突变，包括SMN1和SMN2基因突变，依据突变的DNA序列长度，包括点突变（point mutation）和片段突变（fragment mutation），依据突变类型，包括：替换（substitutions）、缺失（deletion）、插入（insertions）和倒位（inversion），所述的微小致病性变异类型包括点突变（无义突变、移码突变、错义突变、剪切位点突变）及插入突变和缺失突变；本发明SMN基因突变定位，包括SMN1和SMN2全基因序列，所述的微小变异位置为SMN1和SMN2基因第一外显子和第七外显子之间的基因序列。
本发明针对上述SMN1微小变异检测的难点，创造性的提供了基于常规检测平台-荧光定量PCR和ddPCR技术的分层检测策略。首先是qPCR多重熔解曲线法分析受检样本中是否存在SMN基因（包括SMN1和SMN2）上的已知常见微小变异；其次是利用多重ddPCR技术将检测到的微小变异通过基因连锁分析，定位该突变是位于SMN1基因上还是SMN2基因上。本发明尤其针对变异位点距离c.840C＞T差异位点距离较远（＞5kb）的微小变异位点，从根本上解决了检测的可操作性问题，具有检测结果准确可靠、时间短、成本低、易操作、平台普适、适合大规模筛查等优势，从而避免了由于仅检测SMN1拷贝数导致的部分由于微小变异形成的携带者或患者的漏筛。
本发明提供一种分别基于qPCR和ddPCR技术的一种分层筛查、检测SMN1基因中微小变异的方法：首先通过qPCR进行SMN基因（包括SMN1和SMN2）常见微小变异的筛查；再基于ddPCR技术结合分别位于SMN1和SMN2上双锚定位点，将筛查到的已知微小变异进行基因连锁定位，双向确定微小变异位于SMN1基因上还是SMN2，方法简单、可靠。
本发明提供一种基于qPCR技术，采用Taqman探针多重熔解曲线法筛查SMN基因（包括SMN1或SMN2）中的微小变异位点的方法和检测系统，包括但不限于中国人群中常见的7种微小变异：c.22dupA、c.683T>A、c.689C>T、c.863G>T、c.400G>A、c.463_464delAA、c.835-5T>G。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是本发明 SMN基因微小变异位点检测原理图；
图2是SMN基因结构及中国人群常见微小变异位点的分布示意图；
图3 是本发明c.22dupA变异位点检测的特异性熔解曲线图；
图4 是本发明c.463，464delAA变异位点检测的特异性熔解曲线图；
图5 是本发明c.683T>A/689C>T变异位点检测的特异性熔解曲线图；
图6是本发明c.400G>A变异位点检测的特异性熔解曲线图；
图7是本发c.835-5T>G变异位点检测的特异性熔解曲线图;
图8是本发c.863G>T变异位点检测的特异性熔解曲线图；
图9是短片段核酸模板琼脂糖电泳图。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。以下实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种化学试剂，均为市售产品。
实施例一 荧光定量PCR进行SMN（包括SMN1或SMN2）常见微小变异的筛查
本发明 SMN基因微小变异位点检测原理图如图1所示，SMN基因结构及中国人群常见微小变异位点的分布示意图如图2所示。
一. 引物探针设计
根据Genebank中的SMN1基因序列及表1中SMN1常见微小变异位点进行设计，其中：1号外显子的c.22dupA位点，通用引物1能扩增含该突变的基因序列，通过c22P探针检测c.22dupA突变是否存在；外显子5上的c.683T>A和c.689C>T位点接近，通过通用引物2扩增含2个突变位点的序列，分别通过c683P和c689P两个探针，检测是否存在c.683T>A和c.689C>T两个突变位点；c.835-5T>G和c.863G>T分别位于Exon7和内含子6，位置接近，通过通用引物c835F和c835R扩增含两个突变点的序列，然后通过c835-5P和c863P两个探针分别检测是否存在两个突变位点的存在；外显子3上c.400G>A和c.463_464delAA两个突变位点，位置接近，通过c400F和c463R通用引物扩增含2个突变位点的序列，分别通过c400P和c463P两个荧光探针鉴定是否存在两个突变位点的存在。具体各位点引物和探针如表2。
表2 熔解曲线法qPCR检测常见微小变异位点的引物和探针
。
二. 反应体系构建
所述方法包括：构建的多重PCR反应体系体系，包括1×PCR buffer、50nM-500nM的各微小变异位点引物，50nM-500nM各突变位点的荧光探针、0.5-2U Taq DNA聚合酶、100µM-800µM dNTP、1.5mM-6mM MgCl2，通过大量试验对比，对各引物和探针浓度、反应体系中各个组分浓度进行调整优化，以获得最佳的扩增效率组合，PCR反应体系组成见表3；针对上述反应体系组成，逐步对反应条件进行优化，经过大量实验对比优化，最终确定的最佳反应扩增体系如表4。
表3 PCR反应体系组成
表4 PCR扩增体系组成
。
三. 检测程序构建
1. 50℃ 2min，95℃ 10min；
2. 95℃ 15s-65℃-56℃-76℃20s，10个循环，其中65℃-56℃ 15s每个循环下降1℃；
3. 95℃ 15s-55℃ 15s-76℃ 20s，50个循环，在55℃退火阶段采集FAM、HEX、ROX和CY5荧光信号；
4. 95℃ 1min-35℃ 3min-40℃-85℃，其中40℃-85℃以0.4℃/5s的升温速率进行熔解曲线分析，且在此阶段采集FAM、VIC、ROX和CY5荧光信号。
四．SMN基因（包括SMN1和SMN2）中微小变异的筛查验证
1. 在宏石SLAN 96S仪器上，通过上述的扩增体系分别对SMN上的常见7个微小变异的位点，以此获得7个突变序列，将所得的7个突变序列的PCR产物分别插入pUCm-18T质粒载体中，以此获得7个突变的阳性标准品；
2. 将获得的7个突变阳性标准品、SMN野生型（Wt）序列和阴性对照（NTC）分别加入到上述的检测体系中，并按上述的荧光PCR熔解曲线检测程序进行检测，每个样本的检测体系加入的模板量为5微升，每微升3×103拷贝；阴性对照为10mM Tris-EDTA缓冲液，pH 8.0，加入量为5微升；
3. 结果判读：步骤（2）中每种SMN基因型的样品在不同的荧光检测通道都有其特征Tm值（阴性对照中无熔解曲线检测信号），计算野生型对照在各个通道的Tm值与7个突变阳性标准品在各个通道的Tm值的差异，即ΔTm值，将所得ΔTm值与各荧光探针和检测通道得关系归纳为表5。
表5 SMN各微小变异位点的ΔTm值
。
如图3-8所示，本发明提供的SMN微小变异的qPCR筛查方法对SMN的7种突变类型都能检出特异的熔解曲线检测信号，而且各个基因型间不存在交叉检出的现象，因此在检测实际样品时可对照上表中的ΔTm值判读待检样品的基因型，也即判断该样品有无微小突变以及微小突变的位点。
实施例二 通过ddPCR对微小变异进行定位
在中国人群中，经ACMG确认有致病性的SMN1常见微小变异有7种，其突变位置、突变位点、突变频率以及与差异位点c.840 C的距离见表6，其在SMN1或SMN2基因上的分布见图2。鉴于本发明通过ddPCR鉴定SMN1微小变异的优势主要体现在距离差异位点（c.840 C＞T）较远（＞5kb）的微小变异上，如中国人群中的c.22dupA、c.683T>A、c.689C>T、c.400G>A、c.463_464delAA的5种微小变异，其中位点c.835-5T>G和c.863G>T分别位于Exon7和内含子6，距差异位点c.840 C位置较近，可用其他检测方法进行验证。
表6 SMN1基因常见突变位点名称、位置及与c.840 C差异位点的距离
。
一．基于ddPCR的双锚定位点鉴定微小变异位置的设计
多重液滴式数字PCR（Droplet Digital PCR，ddPCR）技术是通过油包水，在传统的PCR 扩增步骤之前将一个大的反应体系分散成成千上万个独立的小液滴，每个微滴中不含或者含有一个待测核酸序列，经过多重PCR 扩增后, 检测每个液滴每个通道的荧光信号的有无，再根据泊松分布原理，计算每个通道阳性微滴的个数与比例，从而得出靶分子的拷贝数。如图1所示，当两个基因片段位于1条染色体上，且两者间隔的核苷酸较短时，呈物理连接，它们就会同时分散到同一个液滴中，由于核酸提取过程种基因组会随机断裂，分散到相同液滴中的概率和两个基因片段间的距离相关，距离越短，断裂的概率就越小，物理连接概率越高，分散到同一液滴的概率越高，相反，距离越远，断裂的概率就越高，物理连接的概率就越低，分散到同一液滴的概率越低。从多重ddPCR的检测结果中，分析代表两个基因位点的荧光通道的双阳性液滴百分比，百分比越高，意味着两个片段的距离越近，百分比越小，意味着两个片段的距离越远，甚至不在同一条染色体上。
如图2所示，同一染色体上的SMN1和SMN2之间有484kb的核苷酸序列，SMN1和SMN2基因的长度为28kb，本发明巧妙利用SMN1和SMN2之间的差异位点c.840 C和c.840 T，分别将其设计为2个锚定位点，将SMN1上第7外显子上第6位的差异位点c.840 C作为第一锚定位点，将SMN2上第7外显子上第6位的差异位点c.840 T作为第二锚定位点，为连锁分析的一个基因片段；5种待鉴定的微小变异位点作为另一个连锁分析的基因片段。通过比较ddPCR扩增结果中，不同荧光通道组合的双阳性液滴百分比，双向确定微小变异的位置。可以看出，如果微小变异发生在SMN1上，则其与第一锚定位点c.840 C距离在5kb与28kb之间，与第二锚定位点c.840 T的距离则大于480kb；如果微小变异发生在SMN2上，则其与第一锚定位点c.840C的距离要大于480kb，与第二锚定位点c.840 T的距离在5kb与28kb之间。这样可基于双阳性液滴百分比与两基因片段长短之间的关系，根据ddPCR检测结果中不同荧光通道组合的双阳性液滴百分比，从而双向推断出锚定位点与微小变异位点的位置关系，确定该微小变异定位在SMN1上还是SMN2上。
二．ddPCR检测体系
本发明构建一个用于鉴定SMN1微小变异的ddPCR检测体系，包括：双锚定位点的引物探针、5种待检微小变异位点的引物探针、4×ddPCR Mastermix（含有热启动DNA聚合酶、UDG酶、dNTP、扩增缓冲液）为新羿制造科技（北京）有限公司产品。
1. ddPCR引物探针的设计
根据Genebank中的SMN1基因序列及其上游启动子区的序列，针对SMN1基因上的第一锚定位点c.840 C设计能同时扩增SMN1和SMN2基因片段的上游通用引物c.835F（SEQ IDNo.7），下游通用引物c.863R（SEQ ID No.8），使扩增片段覆盖c.840 C或c.840 T位点，c.840C位点在Taqman荧光探针c.840CP（SEQ ID No.18）序列的中间位置；针对SMN2基因上的第二锚定位点c.840 T设计荧光探针，c.840 T位点在Taqman荧光探针c.840TP（SEQ IDNo.19）序列的中间位置；RPP30基因与SMN基因不在同一条染色体上，它们之间不存在连锁关系，可作为超远距离或非连锁关系的对照，针对RPP30基因设计上游引物RP F（SEQ IDNo.20），下游引物RP R（SEQ ID No.21），Taqman荧光探针RP P（SEQ ID No.22）序列的中间位置；针对微小变异c.22dupA位点，引物为实施例一中的SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，探针为FAM标记的c22PF（SEQ ID No.23）；针对微小变异c.683T>A和c.689C>T两个突变位点，引物为实施例一中SEQ ID No.4和SEQ ID No.5通用引物，探针为FAM标记的c683/9PF（SEQ IDNo.24）；针对微小变异c.400G>A和c.463_464delAA两个突变位点，引物为实施例一中c400F（SEQ ID No.11）和c400R（SEQ ID No.12）通用引物，c.400G>A的探针为FAM标记的c400PF（SEQ ID No.25），其中c.463_464delAA探针为实施例一中的c463P（SEQ ID No.14）。由于微小变异距离锚定位点的最远距离＞26kb，且属于罕见位点，没有临床标本验证，本发明选择邻近SMN1启动子区的一个位点TestS，见图2，作为一个模拟微小变异位点，与第一锚定位点c.480 C之间的距离为33kb，用于验证短距离的微小变异位点；TestS与第二锚定位点c.480T之间的距离大于480kb，用于验证长距离的微小变异位点，针对TestS位点设计上游引物TestS F（SEQ ID No.15），下游引物TestS R（SEQ ID No.16），使扩增片段覆盖TestS验证位点，TestS位点在Taqman荧光探针TestS P SEQ （ID No.17）序列的中间位置。ddPCR检测体系中的引物和探针序列见表7。
表7 设计的用于ddPCR验证SMN1和SMN2位置的引物和探针
。
2. 多重数字PCR扩增技术的构建
1）建立ddPCR扩增体系
根据表8配制PCR反应体系（总体积30µl），4×ddPCR Mastermix为新羿制造科技（北京）有限公司产品。
表8 多重ddPCR检测体系
。
液滴制备：使用液滴生成芯片（新羿制造科技（北京）有限公司）和样本制备仪，在液滴生成芯片样品孔中加入30µl PCR反应体系，油孔中加入180µl液滴生成油，将芯片和8联排管放入制备仪，盖上胶垫，进行液滴制备。
2）PCR扩增：将含有微液滴的8联排管放到PCR仪上进行扩增，扩增程序设定如表9所示：
表9 ddPCR扩增程序
。
3）微液滴检测：PCR结束后，将8联排管和液滴检测芯片（新羿制造科技（北京）有限公司）放入卡具中，在油孔分别加入430µl和500µl检测油，盖上胶垫，将芯片放入芯片分析仪进行液滴检测。该芯片分析仪包含5个荧光通道（FAM/VIC/ROX/Cy5/Cy5.5），通过荧光检测光路采集微液滴内被激发出的荧光信号。
三．ddPCR检测体系用于鉴定SMN1微小变异位点的验证
本发明依据ddPCR检测结果中不同荧光通道组合的双阳性液滴百分比，推测微小变异位点与锚定位点的距离，从而鉴定SMN1的微小变异。而基于液滴式ddPCR检测原理，含两基因片段的核酸模板分散到相同液滴中的概率与片段的长短相关，模板片段越短，两位点失去物理连接，两片段分散到同一液滴的概率越低，双阳性液滴的百分比越低；相反，片段越长，两基因片段物理连接的概率越高，两片段分散到同一液滴的概率越高，双阳性液滴的百分比越高。而核酸模板片段大小与核酸制备的方法密切相关，因为基因组在提取过程中会不同程度随机断裂，产生不同长度的基因片段。因此可以通过比较不同的基因组制备方法，产生不同片段大小的核酸模板，即高分子量核酸模板和低分子量核酸模板，对含锚定位点和待检微小变异位点的相同的基因片段检测到的双阳性液滴的百分比进行分析，从而验证本发明构建的ddPCR检测体系用于鉴定SMN1微小变异位点的可行性。
1. 高分子量核酸模板用于ddPCR检测体系鉴定SMN1微小变异位点
1）高分子量（HMW）DNA提取方法制备完整核酸模板
通过NEB公司的Monarch® 高分子量DNA提取试剂盒（细胞和血液），从用SMN1拷贝数检测试剂盒鉴定SMN1为2个拷贝，SMN2为2个拷贝的正常EDTA抗凝的外周血样本中，提取核酸，实验流程包括：将细胞温和裂解、根据需要提取长度不同的DNA片段、以及将DNA附着于大玻璃珠表面。根据标准流程提取的DNA在50-250 kb之间，如果将离心速度降到最低，提取的DNA可达Mb范围。纯化后的DNA产量和纯度极高，且几乎完全不含RNA。细胞样品的提取时间仅为30分钟，血液样本需要红细胞裂解，可在60分钟内提取完成。A260/A280检测纯度为1.80-1.90，A260/A230检测纯度为2.2-2.5，提取的模板作为ddPCR的模板。
2）微小变异距双锚定位点距离的判断方法
液滴检测完成后，获得各个荧光通道的阳性液滴数，统计总阳性液滴数和各荧光通道组合的双阳性液滴数，以RQ值=双阳性/总阳性液滴数*100%，计算各微小变异位点，如TestS位点与锚定位点c.840 C和c.840 T的RQ值；c.840 C和c.840 T之间距离大于480kb，可作为超长距离的对照；RPP30作为非连锁分析的阴性对照。表10是ddPCR检测的各荧光通道双阳性液滴的百分比。
表10 针对TestS位点的完整DNA模板双锚定位点的双向验证结果
从上述结果可以看出，构建的多重ddPCR扩增体系检测SMN1和SMN2均为2拷贝的正常标本，通过高分子量DNA提取方法，获得长片段DNA模板，以模拟位点TestS为例，计算不同荧光通道双阳性液滴的百分比RQ值，TestS位点与第一锚定点c.840 C对应双阳性（FAM:CY5）液滴百分比RQ值为49.14%；TestS位点与第二锚定点c.840 T（FAM:ROX）的RQ值为6.98%，前者比后者的RQ值显著增大，按照检测原理推测，TestS与c.840 C位置近，与c.840T位置远，这和TestS位点在设计时，距c.840 C为33kb，距c.840 T位点＞480kb结果完全一致。两锚定位点（c.840 C和c.840 T）对应的CY5:ROX的双阳性百分比RQ值为6.89%，接近TestS-c.840 T的片段，而它们之间的距离也＞480kb，进一步证明了两位点之间的距离越远，RQ值越小。RPP30与两锚点位点（c.840 C和c.840 T）不在同一染色体上，两位点间的距离无限大，c.840 C/RPP30或c.840 T/RPP30对应的CY5:VIC和ROX:VIC双阳性液滴的比例分别为5.78%和5.56%，再次证明了距离越远甚至不在同一染色体上，RQ值越小，同时RPP30可作为本发明检测方法的背景值。
2. 低分子量模板用于ddPCR检测体系鉴定SMN1微小变异
1）低分子量核酸模板制备
为进一步验证本发明提供的检测方法用于SMN1微小变异位点定位的可行性，鉴于本检测方法的前提是保证提取的核酸模板有足够的完整性，以保证待检位点和锚定位点能够通过核苷酸物理连接，这一点可通过制备低分子量的基因组模板来验证。采用天根生化科技（北京）有限公司的血液基因组DNA提取试剂盒(DP348)，提取上述样本中的基因组DNA。纯化后的DNA经高温振荡处理，如恒温金属浴中95℃下、1500rpm、振荡30min，将核酸模板碎片化，获得的短片段模板经琼脂糖电泳，见图9。
2）微小变异距双锚定位点距离的判断方法
液滴检测完成后，获得各个荧光通道的阳性液滴数，统计总阳性液滴数和各荧光通道组合的双阳性液滴数，计算RQ值。表11是针对TestS位点低分子量模板ddPCR检测的各荧光通道双阳性液滴的百分比。
表11 低分子量核酸模板双锚定位点的双向验证结果
从上述结果可以看出，经过碎片化的DNA片段绝大部分分布在15000bp以下。通过ddPCR对碎片化的DNA进行检测，计算不同荧光通道双阳性液滴的比例，两位点距离33kb的TestS-c.840 C位点的RQ值为8.29%，两位点距离＞480kb的TestS-c.840 T位点的RQ值为7.93%，RQ值比较接近，说明在该模板制备过过程中，TestS位点与c.840 C、c.840 T的片段均被打断，形成分离的DNA片段，随机分散到液滴中；c.840 C和c.840 T两锚定位点之间距离＞480kb，RPP30与TestS位点与不同染色体上，它们的RQ值分别为CY5:ROX 5.41%、CYT:VIC 5.14%、ROX:VIC 5.35%，它们的RQ值均较为接近，均接近随机分散到液滴中的背景值，表明在低分子量核酸模板中，各个位点单独存在，无核苷酸连接的连锁关系，各片段RQ值与其理论片段大小无关。相较于高分子量的DNA核酸模板的检测结果来说，一方面间接证明了本发明检测体系用于通过双锚定位点双向验证微小变异的可行性，另一方面则表明本发明的检测中对ddPCR的模板要求较高，需要有高分子量完整性的DNA模板，要求样本制备时需要使用高分子量DNA提取试剂盒。
实施例三 一例SMN1 c.463_464delAA微小变异样本中突变位置的验证
由于SMN1基因中微小变异的发病率较低，本发明提供的SMN1微小变异鉴定方法无法全部使用临床标本来验证。本发明针对一例通过家系分析、长片段DNA扩增后一代测序验证的SMN1 c.463_464delAA微小变异的临床，用本检测体系进行该微小变异的位置确认。
1. 样本处理和检测
通过实施例二中使用的NEB公司的Monarch® 高分子量DNA提取试剂盒（细胞和血液），按照试剂盒说明书进行完整基因组DNA模板的制备，测定浓度后用作ddPCR的模板。按实施例二提供的试剂盒组分构建c.463-464delAA微小变异位点的ddPCR扩增体系，见表12，扩增体系包括4×ddPCR Mastermix、双锚定位点c.840 C和c.840 T的引物探针，c.463-464delAA位点的引物探针，构建好的扩增体系按实施例二的条件进行检测。
表12 c.463-464delAA微小变异位点的ddPCR扩增体系
2. 结果分析
用提取的高分子量的DNA模板和构建好的扩增体系，经液滴生成，进行PCR扩增，再经液滴检测后，获得各个荧光通道的阳性液滴数，统计总阳性液滴数和各荧光通道组合的双阳性液滴数，计算各组合双阳性液滴的RQ值，c.463-464delAA位点与锚定位点c.840 C和c.840 T的RQ值；可作为超长距离的对照的c.840 C和c.840 T位点的RQ值。表13是ddPCR检测的各荧光通道双阳性液滴的百分比。
表13 ddPCR检测SMN1 c.463-464delAA微小变异样本的结果
从表13结果可以看出，提取高分子量核酸模后，ddPCR不同通道的双阳性RQ值，c.463-464delAA位点（FAM）与锚定位点c.840 C（CY5）和c.840 T（ROX）的RQ值分别为78.36%、7.01%，前者远大于后者，按照本发明的检测原理，从两个方向验证了c.463-464delAA位点与c.840 C的距离较近，与c.840 T的位置要远，这与理论上的c.463-464delAA与SMN1上的锚定位点c.840 C的距离为9.4kb，而与SMN2上的c.840 T的距离大于480kb的结果一致，同时c.840 C和c.840 T双阳性液滴的RQ值为5.81%，和c.463-464delAA-c.840 T的RQ值接近，进一步证明c.463-464delAA距离SMN2较远，表明c.463-464delAA位点定位于SMN1上，与临床结果完全一致。这一结果证明了本发明检测体系可用于验证样本中SMN微小变异位点定位于SMN1基因上的可行性。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
Claims (5)
1.确定SMN基因突变位于SMN1基因或SMN2基因上的系统，所述SMN基因突变位于第一外显子和第七外显子之间，其特征在于，所述系统包括以下组成：
第一组成，所述第一组成用于检测SMN基因第一外显子和第七外显子之间一个或多个待检测突变是否存在的试剂盒；所述第一组成是用于检测SMN基因第一外显子和第七外显子之间一个或多个待检测突变荧光定量PCR试剂盒；
第二组成，人基因组DNA提取试剂盒，所述DNA提取试剂盒提取的人基因组DNA片段长度不小于50kb；
第三组成，所述第三组成用于确定一个或多个待检测突变是位于SMN1基因或SMN2基因上的试剂盒，所述第三组成是多重数字PCR试剂盒，所述多重数字PCR试剂盒包括：检测SMN1上第7外显子上第6位的差异位点c.840 C的数字PCR引物和探针，SMN1上第7外显子上第6位的差异位点c.840 C作为第一锚定位点，和第二组成提取的人基因组DNA，其作为数字PCR检测中使用的模板；
检测SMN2上第7外显子上第6位的差异位点c.840 T的数字PCR引物和探针，SMN2上第7外显子上第6位的差异位点c.840 T作为第二锚定位点；
检测所述一个或多个待检测突变的数字PCR引物和探针；
检测第一锚定位点、第二锚定位点和一个或多个待检测突变的探针标记不同的荧光，在检测结果中，若第一锚定位点与一个待检测突变双阳性液滴与总阳性液滴比值比第二锚定位点与所述待检测突变双阳性液滴与总阳性液滴比值高，则该待检测突变位于SMN1基因上；若第二锚定位点与一个待检测突变双阳性液滴与总阳性液滴比值比第一锚定位点与所述待检测突变双阳性液滴与总阳性液滴比值高，则该待检测突变位于SMN2基因上。
2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述DNA提取试剂盒提取的人基因组DNA片段长度在50-250 kb之间。
3.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述第一组成是用于检测SMN基因上c.22dupA、c.400G>A、c.463_464delAA、c.683T>A、c.689C>T、c.835-5T>G、c.863G>T中一个或多个突变是否存在的试剂盒。
4.根据权利要求3所述的系统，其特征在于，所述试剂盒是熔解曲线法qPCR检测试剂盒，所述试剂盒包括以下引物和探针：
。
5.根据权利要求4所述的系统，其特征在于，所述第三组成包括以下引物和探针，
。
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Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111172254A (zh) * | 2020-03-19 | 2020-05-19 | 浙江中创生物医药有限公司 | 一种smn1基因突变的检测方法及试剂盒 |
| CN112522389A (zh) * | 2020-12-21 | 2021-03-19 | 清华大学 | 一种检测脊髓性肌萎缩症数字pcr试剂盒及其应用 |
| CN114317727A (zh) * | 2022-03-03 | 2022-04-12 | 上海恩元生物科技有限公司 | 用于smn基因拷贝数分析的荧光定量检测试剂及应用 |
| CN114736958A (zh) * | 2022-04-29 | 2022-07-12 | 苏州天隆生物科技有限公司 | 检测人运动神经元存活基因smn1拷贝数的试剂盒及分析方法 |
| CN115948532A (zh) * | 2022-08-17 | 2023-04-11 | 湖南圣洲生物科技有限公司 | 基于数字pcr技术的sma检测试剂盒 |
| CN116144750A (zh) * | 2022-11-10 | 2023-05-23 | 合肥行知生物技术有限公司 | 一种引物探针组、数字pcr试剂盒及应用 |
| CN116287192A (zh) * | 2023-01-18 | 2023-06-23 | 浙江大学 | 一种整合smn1与smn2拷贝数、微小变异与家系连锁分析的试剂盒及其应用 |
| CN117305437A (zh) * | 2023-09-26 | 2023-12-29 | 四川省亚中基因科技有限责任公司 | 一种人运动神经元存活基因的检测引物探针组合、试剂盒及检测方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20200299772A1 (en) * | 2019-03-21 | 2020-09-24 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Assessing and treating spinal muscular atrophy |
| CN112048548B (zh) * | 2019-06-06 | 2022-07-05 | 北京阅微基因技术股份有限公司 | 以smnp作为对照检测smn基因拷贝数的方法 |
-
2024
- 2024-03-20 CN CN202410319830.4A patent/CN117925828B/zh active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111172254A (zh) * | 2020-03-19 | 2020-05-19 | 浙江中创生物医药有限公司 | 一种smn1基因突变的检测方法及试剂盒 |
| CN112522389A (zh) * | 2020-12-21 | 2021-03-19 | 清华大学 | 一种检测脊髓性肌萎缩症数字pcr试剂盒及其应用 |
| CN114317727A (zh) * | 2022-03-03 | 2022-04-12 | 上海恩元生物科技有限公司 | 用于smn基因拷贝数分析的荧光定量检测试剂及应用 |
| CN114736958A (zh) * | 2022-04-29 | 2022-07-12 | 苏州天隆生物科技有限公司 | 检测人运动神经元存活基因smn1拷贝数的试剂盒及分析方法 |
| CN115948532A (zh) * | 2022-08-17 | 2023-04-11 | 湖南圣洲生物科技有限公司 | 基于数字pcr技术的sma检测试剂盒 |
| CN116144750A (zh) * | 2022-11-10 | 2023-05-23 | 合肥行知生物技术有限公司 | 一种引物探针组、数字pcr试剂盒及应用 |
| CN116287192A (zh) * | 2023-01-18 | 2023-06-23 | 浙江大学 | 一种整合smn1与smn2拷贝数、微小变异与家系连锁分析的试剂盒及其应用 |
| CN117305437A (zh) * | 2023-09-26 | 2023-12-29 | 四川省亚中基因科技有限责任公司 | 一种人运动神经元存活基因的检测引物探针组合、试剂盒及检测方法 |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| Evaluating the performance of four assays for carrier screening of spinal muscular atrophy;Tan Jianxin等;《Clinica Chimica Acta》;20230801;第548卷;文献号：117496 * |
| Presymptomatic Diagnosis of Spinal Muscular Atrophy Through Newborn Screening;Yin-Hsiu Chien MD, PhD等;《The Journal of Pediatrics》;20171130;第190卷;摘要部分、第125页左栏第35行至第126页右栏第14行 * |
| Yin-Hsiu Chien MD, PhD等.Presymptomatic Diagnosis of Spinal Muscular Atrophy Through Newborn Screening.《The Journal of Pediatrics》.2017,第190卷摘要部分、第125页左栏第35行至第126页右栏第14行. * |
| 单妍等主编.《分子生物学》.中国协和医科大学出版社,2021,(第2021年1月第1版),第174-176页. * |
| 数字PCR技术检测脊髓性肌萎缩症携带者的应用评估;闫有圣等;《中华医学遗传学杂志》;20240110;第41卷(第01期);第20-24页 * |
| 脊髓性肌萎缩症新生儿筛查研究进展;钟玉杭等;《罕少疾病杂志》;20230725;第30卷(第07期);第3-5页 * |
| 荧光探针熔解曲线分析法快速检测SMN1基因纯合性缺失;孙曼娜等;《广东医学》;20190610;第40卷(第11期);第1546-1550页 * |
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