CN112522389A - 一种检测脊髓性肌萎缩症数字pcr试剂盒及其应用 - Google Patents

一种检测脊髓性肌萎缩症数字pcr试剂盒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112522389A
CN112522389A CN202011523363.5A CN202011523363A CN112522389A CN 112522389 A CN112522389 A CN 112522389A CN 202011523363 A CN202011523363 A CN 202011523363A CN 112522389 A CN112522389 A CN 112522389A
Authority
CN
China
Prior art keywords
exon
smn1
smn2
detecting
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202011523363.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112522389B (zh
Inventor
陈芊如
王芳
郭娜
郭永
祝令香
杨文军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xinyi Manufacturing Technology Beijing Co ltd
Tsinghua University
Original Assignee
Xinyi Manufacturing Technology Beijing Co ltd
Tsinghua University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xinyi Manufacturing Technology Beijing Co ltd, Tsinghua University filed Critical Xinyi Manufacturing Technology Beijing Co ltd
Priority to CN202011523363.5A priority Critical patent/CN112522389B/zh
Publication of CN112522389A publication Critical patent/CN112522389A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112522389B publication Critical patent/CN112522389B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种检测脊髓性肌萎缩症数字PCR试剂盒，所述数字PCR试剂盒是在一管数字PCR反应中同时检测待测样中SMN1外显子7、SMN1外显子8和SMN2外显子7以及内参基因的数字PCR试剂盒，在至少四个荧光通道中同时检测SMN1外显子7、SMN1外显子8和SMN2外显子7和内参基因。本发明试剂盒基于数字PCR技术，可以一管完成SMN1外显子7、8和SMN2的拷贝数定量检测，可应用于SMA临床确诊、携带者筛查和疾病分型。

Description

一种检测脊髓性肌萎缩症数字PCR试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测脊髓性肌萎缩症数字PCR试剂盒及其应用。
背景技术
常染色体隐性疾病脊髓性肌肉萎缩症(Spinal Muscular Atrophy，SMA)是一种严重的神经肌肉疾病，其特征是脊髓中α运动神经元的退化，导致近端肌肉逐渐无力和瘫痪。SMA是仅次于囊性纤维化的一种最常见的致命性常染色体隐性疾病，发病率为1/6000-1/10000，携带率为1/40-1/60。
SMA是由SMN1基因突变或缺失引起的。正常人的SMN1基因为2拷贝基因，95％的SMA患者存在着SMN1外显子7的纯合缺失(0个拷贝)，且大部分是外显子7、8同时缺失，只有少部分仅缺失外显子7，也有报道指出存在仅缺失外显子8的患者。其余5％的患者中，其SMN1基因含有其他突变，在中国人群中有两个较常见的突变，分别是外显子1的c.22dupA和外显子5的c.683T>A。
由于SMA是一种常染色体隐性遗传，只拥有1个拷贝的正常SMN1基因即为携带者，虽然不会显示出SMA的病症，但若父母同为携带者，他们每次怀孕，孩子是SMA患者、SMA致病基因携带者和健康的机率分别为25％、50％和25％。此外，也有部分人群2个拷贝的正常SMN1都位于一个等位基因上，另一个等位基因的SMN1外显子7纯合缺失，这部分人也是携带者。SMA一旦发病无经济有效的治疗手段，将给家庭带来心理和经济上的沉重负担，因此现阶段通过产前筛查降低人群中SMA患儿的出生率，是一种符合卫生经济学的筛查策略。
SMN2的数量在决定SMA表型的严重性方面至关重要。根据发病年龄和临床病程，可将SMA分为四个临床类型。I型SMA的特点是出生时或出生3个月内出现严重的全身性肌无力和肌张力低下，因呼吸衰竭而死亡通常发生在出生后两年内，约80％的I型SMA患者拥有1或2个SMN2基因拷贝。II型患儿能坐但不能独立站立或行走，一般可存活4年以上，约82％的II型SMA患者具有3个SMN2基因拷贝。III型SMA在婴儿期或青年时期发病，患者能学习独立行走，存活时间较长，约96％的III型SMA患者拥有3或4个SMN2基因拷贝。在20-30岁出现首发症状的病例，为Ⅳ型SMA，约100％的IV型SMA患者拥有4或6个SMN2基因拷贝。SMN1和SMN2基因只有5个碱基不同，其中SMN2外显子7的一个C>T的变化导致剪接调节剂被破坏，从而使SMN2大多数的转录产物缺乏外显子7。缺乏外显子7的SMN mRNA编码的氨基酸不能有效地低聚且会迅速降解，因此SMN2不能像SMN1那样产生那么多的全长SMN蛋白，SMN2在SMA患者中起着剂量补偿作用。
目前临床上常见的SMA检测方法有限制性片段长度多态性(RFLP)、多重连接探针扩增(MLPA)和荧光定量PCR(qPCR)。RFLP首先利用PCR引物扩增SMN1和SMN2外显子，再用限制性内切酶消化SMN2扩增产物，最终通过凝胶电泳展示结果。RFLP操作简便、对设备要求不高，但它只能检测SMN1外显子7纯合缺失。MLPA是检测SMA的金标准，其首先使用特异探针与目标序列杂交，特异探针包含两个寡核苷酸，仅当两个寡核苷酸成功杂交才能进行连接，连接后进行多重PCR扩增，产生不同长度的产物。然后在毛细管测序仪上分析不同大小的产物，峰高的变化反映了基因的缺失。qPCR利用荧光探针靶向目标序列，并对多重PCR反应进行实时检测，采用标准曲线法或比较阈值法获得基因拷贝数信息。标准曲线法首先基于已知拷贝数的DNA构建一条标准曲线，并以这条曲线作为参考标准，推断基因拷贝数的信息；比较阈值法将样品的Ct值与校准因子的Ct值进行比较，结果必须用内对照基因(管家基因)校正。qPCR操作简便、快速，但其需要依赖标准曲线进行定量，且现有的试剂盒不能同时检测SMN1外显子7、8和SMN2基因。
目前尚无基于数字PCR能够实现一管检测SMN1外显子7、8和SMN2基因的技术方案。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种检测脊髓性肌萎缩症数字PCR试剂盒，其特征在于，所述数字PCR试剂盒是在一管数字PCR反应中同时检测待测样中SMN1外显子7、SMN1外显子8和SMN2外显子7以及内参基因的数字PCR试剂盒；通过在至少四个荧光通道中同时检测SMN1外显子7、SMN1外显子8和SMN2外显子7和内参基因，计算出待测样本中SMN1外显子7、SMN1外显子8和SMN2外显子7与内参基因比值，确定待测样本中SMN1外显子7、SMN1外显子8和SMN2外显子7的绝对拷贝数。
在一种实施方式中，所述试剂盒包括用于扩增SMN1/SMN2外显子7的上游引物SEQID NO：1:AGCTATTTTTTTTAACTTCCTTTATTTTC，和下游引物SEQ ID NO：2:GAGCACCTTCCTTCTTTTTG；以及检测SMN1外显子7探针SEQ ID NO：9:TTGTCTGAAACCC和检测SMN2外显子7探针SEQ ID NO：10：TTTTGTCTAAAACC。
在一种实施方式中，所述试剂盒包括用于扩增SMN1外显子8的上游引物SEQ IDNO：3:GACTCTATTTTGAAAAACCAT，和下游引物SEQ ID NO：4:ATTTTCTCAACTGCCTCAC；以及检测SMN1外显子8探针SEQ ID NO：11:CCCACC+C+CAGTCT，其中‘+’为锁核酸修饰。
在一种实施方式中，所述试剂盒包括用于扩增和检测至少二个内参基因的引物和探针。
在一种实施方式中，所述试剂盒包括用于扩增内参基因RPS27A的上游引物SEQ IDNO：5:GTTTGGGTTCAGGTCTTT，和下游引物SEQ ID NO：6:TACAATGAAAACATTCAGAAGTC，以及检测内参基因RPS27A探针SEQ ID NO：12:TTGTCTACCACTTGCAAAGCTG；和用于扩增内参基因RPP30的上游引物SEQ ID NO：7:GAAGAAACCTCGGCCAT，和下游引物SEQ ID NO：8:CCTCACACTTGGCTTTC以及检测内参基因RPP30探针SEQ ID NO：13：AGATGAAGATTGTCTTCCAGCTTCCA。
在一种实施方式中，检测SMN1外显子7、SMN1外显子8和SMN2外显子7和内参基因的检测探针5’端标记的荧光基团是FAM、FITC、Cy3、VIC、HEX、ROX、TET、NED、Cy5或Cy5.5，3’端的标记是MGB、BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3；每种探针标记不同的荧光。
在一种实施方式中，本发明提供上述试剂盒在检测脊髓性肌萎缩症中的应用。
在一种实施方式中个，本发明提供一种利用数字PCR在一个数字PCR反应中同时确定待测样本中SMN1外显子7、SMN1外显子8和SMN2外显子7的绝对拷贝数的方法，所述方法包括在一管数字PCR反应中同时检测待测样中SMN1外显子7、SMN1外显子8和SMN2外显子7以及内参基因，在至少四个荧光通道中同时检测SMN1外显子7、SMN1外显子8和SMN2外显子7和内参基因；通过计算出待测样本的SMN1外显子7、SMN1外显子8和SMN2外显子7与内参基因比值，确定待测样本中SMN1外显子7、SMN1外显子8和SMN2外显子7的绝对拷贝数。
在一种实施方式中，当所述内参基因是为2拷贝基因时，通过待测基因与内参基因的以下数字PCR比值来确定待测基因的绝对拷贝数
比值 绝对拷贝数
<0.1 0
0.3-0.7 1
0.8-1.2 2
1.3-1.7 3
1.8-2.2 4
2.3-2.7 5
2.8-3.2 6
其他 无法确定
。
本发明提供一种脊髓性肌萎缩症检测试剂盒，该试剂盒基于数字PCR技术，可以一管完成SMN1外显子7、8和SMN2的拷贝数定量检测，可应用于SMA临床确诊、携带者筛查和疾病分型。
本发明的试剂盒中使用二个内参基因来确定待测基因的绝对拷贝数，与现有的单一内参基因方法相比，使用二个内参基因能够弥补单一内参可能导致的实验结果无法确定或错误的不足，使得结果更精确且可信度更高，提升方法的准确性和可靠性。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是SMN1外显子7和SMN2外显子7两组引物探针的数字PCR荧光检测一维图，X轴为液滴编号，Y轴为荧光信号强度，图中标出的1和2分别对应阳性液滴信号和阴性液滴信号；
图2是SMN1外显子8三组引物探针的数字PCR荧光检测一维图，X轴为液滴编号，Y轴为荧光信号强度，图中标出的1和2分别对应阳性液滴信号和阴性液滴信号；
图3是正常人SMA检测结果二维图，其中FAM探针为SMN1外显子7、VIC探针为SMN2外显子7、Cy5探针为SMN1外显子8、ROX探针为内参基因RPS27A、Cy5.5探针为内参基因RPP30；图中标出了12个簇分别对应的靶标，其中1代表不包含SMN1外显子7和SMN2外显子7的阴性液滴、2代表SMN1外显子7阳性液滴、3代表SMN2外显子7阳性液滴、4代表同时包含SMN1和SMN2外显子7的阳性液滴、5代表不包含SMN1外显子8和RPS27A的阴性液滴、6代表SMN1外显子8阳性液滴、7代表RPS27A阳性液滴、8代表同时包含SMN1外显子8和RPS27A的阳性液滴、9代表不包含SMN1外显子7和RPP30的阴性液滴、10代表SMN1外显子7阳性液滴、11代表RPP30阳性液滴、12同时包含SMN1外显子7和RPP30的阳性液滴；
图4是SMA携带者(杂合缺失)SMA检测结果二维图，其中FAM探针为SMN1外显子7、VIC探针为SMN2外显子7、Cy5探针为SMN1外显子8、ROX探针为内参基因RPS27A、Cy5.5探针为内参基因RPP30；图中标出了12个簇分别对应的靶标，其中1代表不包含SMN1外显子7和SMN2外显子7的阴性液滴、2代表SMN1外显子7阳性液滴、3代表SMN2外显子7阳性液滴、4代表同时包含SMN1和SMN2外显子7的阳性液滴、5代表不包含SMN1外显子8和RPS27A的阴性液滴、6代表SMN1外显子8阳性液滴、7代表RPS27A阳性液滴、8代表同时包含SMN1外显子8和RPS27A的阳性液滴、9代表不包含SMN1外显子7和RPP30的阴性液滴、10代表SMN1外显子7阳性液滴、11代表RPP30阳性液滴、12同时包含SMN1外显子7和RPP30的阳性液滴；
图5是SMA患者(纯合缺失)SMA检测结果二维图，其中FAM探针为SMN1外显子7、VIC探针为SMN2外显子7、Cy5探针为SMN1外显子8、ROX探针为内参基因RPS27A、Cy5.5探针为内参基因RPP30；图中标出了6个簇分别对应的靶标，其中1代表不包含SMN1外显子7和SMN2外显子7的阴性液滴、2代表SMN2外显子7阳性液滴、3代表不包含SMN1外显子8和RPS27A的阴性液滴、4代表RPS27A阳性液滴、5代表不包含SMN1外显子8和RPS27A的阴性液滴、6代表RPP30阳性液滴。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述。
实施例一 SMN1外显子7、8和SMN2外显子7引物探针筛选
一.SMN1外显子7和SMN2外显子7引物探针筛选
1.SMN1外显子7和SMN2外显子7引物探针设计
从NCBI上下载SMN1和SMN2基因序列，进行序列分析。由于SMN1外显子7和SMN2外显子7只有一个碱基不同，针对这两个基因不同的碱基分别设计特异靶向SMN1和SMN2外显子7的探针，同时两个基因使用相同的一对引物进行扩增。下表为候选引物探针序列：
Figure BDA0002849975850000061
Figure BDA0002849975850000071
2.质粒参考品合成、酶切与定量
为验证引物探针的扩增效果，由金唯智公司合成包含目标序列的质粒参考品，分别有SMN1外显子7和SMN2外显子7的质粒，插入序列为300bp。质粒参考品使用ScaI-HF限制性内切酶进行酶切，酶切后的线性化质粒参考品使用Qubit 3.0(Thermo Scientific)荧光检测仪进行定量，使用核酸稀释液将线性化后的质粒参考品稀释至10000拷贝/μL并分装保存在-20℃直至使用。
3.PCR反应体系配制
根据下表配制PCR反应体系(总体积30μL)。
成分 体积(μL) 终浓度(nM)
2x ddPCR Mix 15 -
上游引物(20μM) 0.6 400
下游引物(20μM) 0.6 400
探针(20μM) 0.3 200
模板(10000拷贝/uL) 1 -
水 12.5 -
4.数字PCR工作流程
(1)微液滴制备：使用液滴生成芯片(新羿制造科技(北京)有限公司)和样本制备仪(新羿制造科技(北京)有限公司)，在液滴生成芯片样品孔中加入30μL PCR反应体系，油孔中加入180μL液滴生成油，将芯片和8联排管放入制备仪，盖上胶垫，进行微液滴制备。
(2)PCR扩增：将含有微液滴的8联排管放到PCR仪上进行扩增，扩增程序设定如下表所示：
Figure BDA0002849975850000081
(3)微液滴检测：PCR完毕后，将8联排管和液滴检测芯片(新羿制造科技(北京)有限公司)放入卡具中，在油孔分别加入430μL和500μL检测油，盖上胶垫，将芯片放入芯片分析仪(新羿制造科技(北京)有限公司)进行液滴检测。该芯片分析仪包含5个荧光通道(FAM/VIC/ROX/Cy5/Cy5.5)，采用波长分别为473、532、580、640和710nm的5个激光作为激发光源实现对微液滴内荧光染料的激发，最终通过荧光检测光路采集微液滴内被激发出的荧光。
(4)信号处理与数据分析：通过液滴生成芯片和样本制备仪制备的上万个微液滴每个都是一个独立的PCR反应器，大部分微液滴不含待测目标基因或者含有至少一个待测目标基因，经过PCR扩增后，通过芯片分析仪对每个微液滴进行FAM/VIC/ROX/Cy5/Cy5.5荧光信号检测，记录微液滴信号的峰值高度，含有待测目标基因的液滴将被检测出相应的荧光信号。通过荧光分类阈值将微液滴内的荧光强度数字化，具有较强荧光的微液滴判读为“1”(阳性)，具有较弱荧光的微液滴判读为“0”(阴性)，统计“1”和“0”的个数，并通过泊松分布模型校正，可计算出投入模板中FAM/VIC/ROX/Cy5/Cy5.5标记的目标基因的总拷贝数。
5.筛选结果
5.1定量准确性和稳定性评估
本实验中每组引物探针进行3次重复测试，统计拷贝数定量结果，计算平均值、标准差与变异系数，以此评估每组引物探针的定量准确性和稳定性。结果如下表所示，SMN1外显子7的第一组引物探针的定量结果更接近理论拷贝数，变异系数与第二组相当；SMN2外显子7的第一组引物探针的定量结果更接近理论拷贝数，变异系数第二组相当。
Figure BDA0002849975850000091
5.2荧光信号强度与聚集度评估
图1为SMN1外显子7和SMN2外显子7两组引物探针的数字PCR荧光检测一维图，X轴为液滴编号，Y轴为荧光信号强度。如图1和下表所示，第一组引物探针的阳性荧光信号强度更高，且第一组引物探针的阴阳性信号差值更大，即区分度更佳，另外从图1中可以看出第一组聚集程度更佳。
Figure BDA0002849975850000092
综合以上结果，选择SMN1外显子7和SMN2外显子7的第一组引物探针。
二.SMN1外显子8引物探针筛选
1.引物探针序列设计
从NCBI上下载SMN1和SMN2基因序列，进行序列分析。由于SMN1外显子8和SMN2外显子8只有一个碱基不同，针对这两个基因不同的碱基设计特异靶向SMN1外显子8的探针。下表为候选引物探针序列：
Figure BDA0002849975850000101
*‘+’为锁核酸(LNA)修饰
2.质粒参考品合成、酶切与定量
为验证引物探针的扩增效果，由金唯智公司合成包含SMN1外显子8的质粒参考品，插入序列为300bp。质粒参考品使用ScaI-HF限制性内切酶进行酶切，酶切后的线性化质粒参考品使用Qubit 3.0(Thermo Scientific)荧光检测仪进行定量，使用核酸稀释液将线性化后的质粒参考品稀释至10000拷贝/μL并分装保存在-20℃直至使用。
3.PCR反应体系配制
根据下表配制PCR反应体系(总体积30μL)。
Figure BDA0002849975850000102
Figure BDA0002849975850000111
4.数字PCR工作流程
(1)微液滴制备：使用液滴生成芯片(新羿制造科技(北京)有限公司)和样本制备仪(新羿制造科技(北京)有限公司)，在液滴生成芯片样品孔中加入30μL PCR反应体系，油孔中加入180μL液滴生成油，将芯片和8联排管放入制备仪，盖上胶垫，进行微液滴制备。
(2)PCR扩增：将含有微液滴的8联排管放到PCR仪上进行扩增，扩增程序设定如下表所示：
Figure BDA0002849975850000112
(3)微液滴检测：PCR完毕后，将8联排管和液滴检测芯片(新羿制造科技(北京)有限公司)放入卡具中，在油孔分别加入430μL和500μL检测油，盖上胶垫，将芯片放入芯片分析仪(新羿制造科技(北京)有限公司)进行液滴检测。该芯片分析仪包含5个荧光通道(FAM/VIC/ROX/Cy5/Cy5.5)，采用波长分别为473、532、580、640和710nm的5个激光作为激发光源实现对微液滴内荧光染料的激发，最终通过荧光检测光路采集微液滴内被激发出的荧光。
(4)信号处理与数据分析：通过液滴生成芯片和样本制备仪制备的上万个微液滴每个都是一个独立的PCR反应器，大部分微液滴不含待测目标基因或者含有至少一个待测目标基因，经过PCR扩增后，通过芯片分析仪对每个微液滴进行FAM/VIC/ROX/Cy5/Cy5.5荧光信号检测，记录微液滴信号的峰值高度，含有待测目标基因的液滴将被检测出相应的荧光信号。通过荧光分类阈值将微液滴内的荧光强度数字化，具有较强荧光的微液滴判读为“1”(阳性)，具有较弱荧光的微液滴判读为“0”(阴性)，统计“1”和“0”的个数，并通过泊松分布模型校正，可计算出投入模板中FAM/VIC/ROX/Cy5/Cy5.5标记的目标基因的总拷贝数。
5.筛选结果
5.1定量准确性和稳定性评估
本实验中每组引物探针进行3次重复测试，统计拷贝数定量结果，计算平均值、标准差与变异系数，以此评估每组引物探针的定量准确性和稳定性。结果如下表所示，SMN1外显子8的第三组引物探针的定量结果更接近理论拷贝数，变异系数与第一组相当。
Figure BDA0002849975850000121
5.2荧光信号强度与聚集度评估
图2为SMN1外显子8三组引物探针的数字PCR荧光检测一维图，X轴为液滴编号，Y轴为荧光信号强度。如图2和下表所示，第三组引物探针的阳性荧光信号强度更高、引物探针的阴阳性信号差值更大，即区分度更佳，第一组次之，第二组最差。从图2中也可以看出，第三组信号聚焦程度更好。
Figure BDA0002849975850000122
综合以上结果，选择SMN1外显子8的第三组引物探针。
实施例2人血液样本SMA检测
一.血液样本收集和DNA提取
收集正常人、SMA携带者(SMN1杂合缺失)和SMA患者(SMN1纯合缺失)血样，使用DNA提取试剂盒提取血样中DNA，使用Nanodrop 2000分光光度计和Qubit 3.0(ThermoScientific)荧光检测仪测定DNA的量和纯度，将DNA模板稀释至10ng/μL。所有DNA样品均保存在-80℃直至使用。
二.引物与探针
本实验中扩增5段不同基因序列，分别是SMN1外显子7、SMN1外显子8、SMN2外显子7、内参基因RPS27A和内参基因RPP30。探针5’端采用5种不同的荧光基团进行标记，其中每种荧光基团的激发和发射波长是独立的，以避免互相干扰，本实验使用FAM、VIC、ROX、Cy5和Cy5.5荧光基团。探针3’端采用淬灭基团进行标记，本实验使用MGB、BHQ-2和BHQ-3进行标记。使用的特异性引物和探针如下表所示：
Figure BDA0002849975850000131
Figure BDA0002849975850000141
*‘+’为锁核酸(LNA)修饰
三.PCR反应体系配制
根据下表配制PCR反应体系(总体积30μL)。
Figure BDA0002849975850000142
Figure BDA0002849975850000151
四.数字PCR工作流程
(1)微液滴制备：使用液滴生成芯片(新羿制造科技(北京)有限公司)和样本制备仪(新羿制造科技(北京)有限公司)，在液滴生成芯片样品孔中加入30μL PCR反应体系，油孔中加入180μL液滴生成油，将芯片和8联排管放入制备仪，盖上胶垫，进行微液滴制备。
(2)PCR扩增：将含有微液滴的8联排管放到PCR仪上进行扩增，扩增程序设定如下表所示：
Figure BDA0002849975850000152
Figure BDA0002849975850000161
(3)微液滴检测：PCR完毕后，将8联排管和液滴检测芯片(新羿制造科技(北京)有限公司)放入卡具中，在油孔分别加入430μL和500μL检测油，盖上胶垫，将芯片放入芯片分析仪(新羿制造科技(北京)有限公司)进行液滴检测。该芯片分析仪包含5个荧光通道(FAM/VIC/ROX/Cy5/Cy5.5)，采用波长分别为473、532、580、640和710nm的5个激光作为激发光源实现对微液滴内多种荧光染料的激发，最终通过荧光检测光路采集微液滴内被激发出的荧光。
(4)信号处理与数据分析：通过液滴生成芯片和样本制备仪制备的上万个微液滴每个都是一个独立的PCR反应器，大部分微液滴不含待测目标基因或者含有至少一个待测目标基因，经过PCR扩增后，通过芯片分析仪对每个微液滴进行FAM、VIC、ROX、Cy5和Cy5.5荧光信号检测，记录微液滴信号的峰值高度，含有待测目标基因的液滴将被检测出相应的荧光信号。通过荧光分类阈值将微液滴内的荧光强度数字化，具有较强荧光的微液滴判读为“1”(阳性)，具有较弱荧光的微液滴判读为“0”(阴性)，统计“1”和“0”的个数，并通过泊松分布模型校正，可计算出投入模板中FAM、VIC、ROX、Cy5和Cy5.5标记的目标基因总拷贝数。
五.绝对拷贝数计算与结果判读标准
(1)绝对拷贝数计算与确定
本方法设置两个内参基因，以避免因特定内参基因出现异常带来的错误结果，提高检测可靠性。已知内参基因(RPS27A和RPP30)为2拷贝基因，通过计算目标基因(SMN1外显子7、SMN1外显子8、SMN2外显子7)和内参基因的总拷贝数比值，就能得出目标基因的绝对拷贝数，计算公式如下，
Figure BDA0002849975850000162
Figure BDA0002849975850000163
其中x为SMN1外显子7或SMN1外显子8或SMN2外显子7。
比值和其对应的绝对拷贝数见下表。
比值 绝对拷贝数
0-0.1 0
0.3-0.7 1
0.8-1.2 2
1.3-1.7 3
1.8-2.2 4
2.3-2.7 5
2.8-3.2 6
其他 无法确定
根据以上计算公式和对应表，每种目标基因(SMN1外显子7、SMN1外显子8、SMN2外显子7)能够得出两组绝对拷贝数：绝对拷贝数内参基因1和绝对拷贝数内参基因2。
如果A1与A2相等并且在上述表中参考值范围，则以A1或A2中任一个确定目标基因的绝对拷贝数；如果A1或A2不相等，其中A1或A2中的一个在上述表中参考数值范围，则以该值确定目标基因的绝对拷贝数；其它情况则无法确定目标基因的绝对拷贝数。
(2)待测样本结果判读标准
根据SMN1外显子7和SMN1外显子8的最终绝对拷贝数，可协助判断待测样本的SMA患病或携带情况，判读标准见下表。
Figure BDA0002849975850000171
Figure BDA0002849975850000181
而SMN2外显子7的绝对拷贝数可作为判断患者严重程度的参考，约80％的I型SMA患者拥有1或2个SMN2基因拷贝，约82％的II型SMA患者拥有3个SMN2基因拷贝，约96％的III型SMA患者拥有3或4个SMN2基因拷贝，约100％的IV型SMA患者拥有4或6个SMN2基因拷贝。
六.结果与讨论
正常人、SMA携带者和SMA患者的检测结果如下表所示，检测结果的二维图见图3、4和5。结果显示，正常人的SMN1外显子7、SMN1外显子8和SMN2外显子7均为2个拷贝，SMA携带者的SMN1外显子7和SMN1外显子8均为1个拷贝、SMN2外显子7为2个拷贝，SMA患者的SMN1外显子7和SMN1外显子8均为0个拷贝、SMN2外显子7为4个拷贝。
Figure BDA0002849975850000191
在SMA检测中能够同时、一管对SMN1外显子7、SMN2外显子7和SMN1外显子8具有重要意义。其中SMN1外显子7和外显子8的拷贝数检测用于SMA携带者筛查与诊断，SMN2外显子7的拷贝数检测则可协助进行SMA分型和指导用药。一管检测这三个靶标有效缩短检测时间、简化操作步骤，并且基于数字PCR技术使得检测结果更加准确。需要注意的是，待测样品的类型并没有特别的限制，可以是血液、干血斑、其他体液、组织或口腔拭子等，可根据需求进行选择。此外，所用的检测探针5’端标记的荧光基团可以是FAM、FITC、Cy3、VIC、HEX、ROX、TET、NED、Cy5、Cy5.5，3’端的标记可以是MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
序列表
<110> 清华大学
新羿制造科技（北京）有限公司
<120> 一种检测脊髓性肌萎缩症数字PCR试剂盒及其应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agctattttt tttaacttcc tttattttc 29
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gagcaccttc cttctttttg 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gactctattt tgaaaaacca t 21
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
attttctcaa ctgcctcac 19
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtttgggttc aggtcttt 18
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tacaatgaaa acattcagaa gtc 23
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaagaaacct cggccat 17
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cctcacactt ggctttc 17
<210> 9
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttgtctgaaa ccc 13
<210> 10
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttgtctaaaa ccc 13
<210> 11
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cccaccccag tct 13
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ttgtctacca cttgcaaagc tg 22
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agatgaagat tgtcttccag cttcca 26

Claims (9)

1.一种检测脊髓性肌萎缩症数字PCR试剂盒，其特征在于，所述数字PCR试剂盒是在一管数字PCR反应中同时检测待测样中SMN1外显子7、SMN1外显子8和SMN2外显子7以及内参基因的数字PCR试剂盒；通过在至少四个荧光通道中同时检测SMN1外显子7、SMN1外显子8和SMN2外显子7和内参基因，计算出待测样本中SMN1外显子7、SMN1外显子8和SMN2外显子7与内参基因比值，确定待测样本中SMN1外显子7、SMN1外显子8和SMN2外显子7的绝对拷贝数。
2.根据权利要求1所述的PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于扩增SMN1/SMN2外显子7的上游引物SEQ ID NO：1:AGCTATTTTTTTTAACTTCCTTTATTTTC，和下游引物SEQ IDNO：2:GAGCACCTTCCTTCTTTTTG；以及检测SMN1外显子7探针SEQ ID NO：9:TTGTCTGAAACCC和检测SMN2外显子7探针SEQ ID NO：10：TTTTGTCTAAAACC。
3.根据权利要求1所述的PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于扩增SMN1外显子8的上游引物SEQ ID NO：3:GACTCTATTTTGAAAAACCAT，和下游引物SEQ ID NO：4:ATTTTCTCAACTGCCTCAC；以及检测SMN1外显子8探针SEQ ID NO：11:CCCACC+C+CAGTCT，其中‘+’为锁核酸修饰。
4.根据权利要求1所述的PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于扩增和检测至少二个内参基因的引物和探针。
5.根据权利要求4所述的PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于扩增内参基因RPS27A的上游引物SEQ ID NO：5:GTTTGGGTTCAGGTCTTT，和下游引物SEQ ID NO：6:TACAATGAAAACATTCAGAAGTC，以及检测内参基因RPS27A探针SEQ ID NO：12:TTGTCTACCACTTGCAAAGCTG；和用于扩增内参基因RPP30的上游引物SEQ ID NO：7:GAAGAAACCTCGGCCAT，和下游引物SEQ ID NO：8:CCTCACACTTGGCTTTC以及检测内参基因RPP30探针SEQ ID NO：13：AGATGAAGATTGTCTTCCAGCTTCCA。
6.根据权利要求2或3所述的PCR试剂盒，其特征在于，检测SMN1外显子7、SMN1外显子8和SMN2外显子7和内参基因的检测探针5’端标记的荧光基团是FAM、FITC、Cy3、VIC、HEX、ROX、TET、NED、Cy5或Cy5.5，3’端的标记是MGB、BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3；每种探针标记不同的荧光。
7.根据权利要求1-6任一所述的试剂盒在检测脊髓性肌萎缩症中的应用。
8.一种利用数字PCR在一个数字PCR反应中同时确定待测样本中SMN1外显子7、SMN1外显子8和SMN2外显子7的绝对拷贝数的方法，其特征在于，所述方法包括在一管数字PCR反应中同时检测待测样中SMN1外显子7、SMN1外显子8和SMN2外显子7以及内参基因，在至少四个荧光通道中同时检测SMN1外显子7、SMN1外显子8和SMN2外显子7和内参基因；通过计算出待测样本的SMN1外显子7、SMN1外显子8和SMN2外显子7与内参基因比值，确定待测样本中SMN1外显子7、SMN1外显子8和SMN2外显子7的绝对拷贝数。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，当所述内参基因是为2拷贝基因时，通过待测基因与内参基因的以下数字PCR比值来确定待测基因的绝对拷贝数
比值 绝对拷贝数 <0.1 0 0.3-0.7 1 0.8-1.2 2 1.3-1.7 3 1.8-2.2 4 2.3-2.7 5 2.8-3.2 6 其他 无法确定
。
CN202011523363.5A 2020-12-21 2020-12-21 一种检测脊髓性肌萎缩症数字pcr试剂盒及其应用 Active CN112522389B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011523363.5A CN112522389B (zh) 2020-12-21 2020-12-21 一种检测脊髓性肌萎缩症数字pcr试剂盒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011523363.5A CN112522389B (zh) 2020-12-21 2020-12-21 一种检测脊髓性肌萎缩症数字pcr试剂盒及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112522389A true CN112522389A (zh) 2021-03-19
CN112522389B CN112522389B (zh) 2022-09-06

Family

ID=75002432

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011523363.5A Active CN112522389B (zh) 2020-12-21 2020-12-21 一种检测脊髓性肌萎缩症数字pcr试剂盒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112522389B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113913512A (zh) * 2021-12-01 2022-01-11 山东大学 一种用于检测脊髓肌萎缩症相关基因的引物探针组合物及试剂盒
CN114480616A (zh) * 2021-12-30 2022-05-13 广州达安基因股份有限公司 一种smn2基因拷贝数变异检测试剂盒
CN117925828A (zh) * 2024-03-20 2024-04-26 北京致谱医学检验实验室有限公司 确定smn基因突变位于smn1基因或smn2基因上的系统及其方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108384843A (zh) * 2018-04-26 2018-08-10 新羿制造科技（北京）有限公司 一种利用数字pcr鉴定单拷贝基因突变基因型的方法
CN111118151A (zh) * 2020-03-26 2020-05-08 广东永诺医疗科技有限公司 基于数字pcr法的人smn1与smn2基因拷贝数检测试剂盒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108384843A (zh) * 2018-04-26 2018-08-10 新羿制造科技（北京）有限公司 一种利用数字pcr鉴定单拷贝基因突变基因型的方法
CN111118151A (zh) * 2020-03-26 2020-05-08 广东永诺医疗科技有限公司 基于数字pcr法的人smn1与smn2基因拷贝数检测试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JUWON KIM等: "Association between survivor motor neuron 2 (SMN2) gene homozygous deletion and sporadic lower motor neuron disease in a Korean population", 《ANNALS OF CLINICAL AND LABORATORY SCIENCE》 *
孙婧婧等: "儿童脊肌萎缩症的基因诊断", 《海南医学》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113913512A (zh) * 2021-12-01 2022-01-11 山东大学 一种用于检测脊髓肌萎缩症相关基因的引物探针组合物及试剂盒
CN114480616A (zh) * 2021-12-30 2022-05-13 广州达安基因股份有限公司 一种smn2基因拷贝数变异检测试剂盒
CN114480616B (zh) * 2021-12-30 2024-05-31 广州达安基因股份有限公司 一种smn2基因拷贝数变异检测试剂盒
CN117925828A (zh) * 2024-03-20 2024-04-26 北京致谱医学检验实验室有限公司 确定smn基因突变位于smn1基因或smn2基因上的系统及其方法
CN117925828B (zh) * 2024-03-20 2024-06-04 北京致谱医学检验实验室有限公司 确定smn基因突变位于smn1基因或smn2基因上的系统及其方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN112522389B (zh) 2022-09-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112522389B (zh) 一种检测脊髓性肌萎缩症数字pcr试剂盒及其应用
AU2021200925B2 (en) Assays for single molecule detection and use thereof
CN111118151A (zh) 基于数字pcr法的人smn1与smn2基因拷贝数检测试剂盒
CN110541033B (zh) Egfr基因突变检测用组合物及检测方法
CN114085903B (zh) 检测线粒体3243a＞g突变的引物对探针组合产品及其试剂盒与检测方法
CN106939334B (zh) 一种孕妇血浆中胎儿dna含量的检测方法
CN113151419B (zh) 脊髓性肌萎缩症检测方法
WO2012019190A1 (en) Compositions and methods for high-throughput nucleic acid analysis and quality control
US8367814B2 (en) Assay for BCR/ABL gene rearrangement
JP5229895B2 (ja) 核酸標準物質
CN107090508B (zh) 一种检测基因突变的新型试剂盒
EP1092782B1 (en) Genetic screening method and genetic screening apparatus
WO2011145614A1 (ja) 核酸標準物質検出用プローブの設計方法、核酸標準物質検出用プローブ及び当該核酸標準物質検出用プローブを有する核酸検出系
US20220025460A1 (en) Method and kit for determining neuromuscular disease in subject
CN109750098B (zh) Atp7b基因大片段缺失检测试剂盒及检测方法
CN114277110A (zh) 检测fgf19基因拷贝数和/或扩增的试剂盒及检测方法、用途
CN112481379A (zh) 一种检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合与试剂盒
CN114250273A (zh) 用于核酸检测的组合物
CN118291631B (zh) 一种伴bcor遗传学异常肉瘤检测引物组、试剂盒及其应用
KR102720023B1 (ko) 바이설파이트 변환 평가용 키트 및 이를 이용한 평가 방법
JP4972737B2 (ja) Ｔｈ２サイトカイン阻害剤への感受性の検査方法
JP3876301B2 (ja) ２２ｑ１１．２欠損症候群の診断装置、ダウン症候群の診断装置
CN112301096A (zh) 一种新型核酸探针标记方法
CN117512118A (zh) 检测人egfr基因第19外显子缺失突变的引物探针组合物、试剂盒及方法
KR20230040069A (ko) 바이설파이트 변환 평가용 키트 및 이를 이용한 평가 방법

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant