CN1384206A - 通用模板核酸检测方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种通过使用通用模板检测和/或定量核酸的方法。本发明的通用模板引物对包括特异性结合于模板并引发聚合酶链反应的二个引物,其中至少一个引物是通用模板引物,该通用模板引物包括:(a)特异结合区;(b)通用区,该通用区具有报告分子结合区。本发明还提供了相应的通用模板核酸检测方法。本发明可易用、灵敏、准确的检测和/或定量样品中病原体和基因表达。

Description

通用模板核酸检测方法和试剂盒

本发明涉及核酸检测领域，更具体地，涉及一种通过使用通用模板检测和/或定量核酸的方法。

近来，为了满足快速准确地检测和/或定量感染物(如病毒、细菌、真菌)中，以及正常和不正常基因中的特异性核酸序列，已有开发了大量技术。这些技术在检测和定量食品、环境样品、种畜和其他类型物质中微生物方面有着广阔的用途，在这些场合下需要监测某种推定微生物是否存在。其他应用包括用于法医学、分子病理学、人类学、考古学和生物学等方面。

实现这类任务的一种常见做法是核酸杂交。该方法基于两条核酸链在合适条件下形成双链结构的能力，其中这两条核酸链含有互补或基本互补的序列从而能够特异性地结合。为了检测和/或定量特定的核酸序列(称为“靶序列”)，需制备标记的寡核苷酸(“探针”)，该探针含有与靶序列互补的序列。为了灵敏地检测和/或定量微量的遗传物质，已经开发了许多更成熟的技术，它们通常涉及在测试样品中扩增靶核酸(DNA或RNA)并随后进行检测，其中包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、链置换扩增(SDA)、转录介导扩增(transcriptionmediated amplication，TMA)和自动维持合成反应(3SR)。

尽管所有这些技术都是检测和鉴别样品中微量靶核酸的有利工具，但是它们有各种不同的问题，这些问题限制了它们在临床实验室环境下用于常规操作时的应用性。最困难的问题之一是，在每种测试中扩增靶核酸以便随后进行检测和定量分析的条件是不同的。换言之，没有利于测试标准化的恒定条件。

目前靶序列扩增方法另一种常见问题是扩增子的污染。

此外，对于目前的基于靶序列扩增的核酸检测和/或定量方法而言，不偏不倚地检测和/或定量具有不同基因型或突变(如导致抗药性的突变)的病原体一直是众所周知的挑战。

分支DNA(bDNA)法是一种新兴的信号扩增技术，它可提供高重复性和准确度。然而，该方法本身的灵敏度有限，且难以为常规实验室所广泛采用。

因此，本领域迫切需要开发易用、灵敏、准确的检测和/或定量样品中病原体和基因表达的分析技术。

本发明的目的就是提供一种可用于检测和/或定量样品中病原体和基因表达的易用、灵敏、准确的分析技术。本发明的新技术可以克服现有技术中的许多局限。

在本发明的第一方面，提供了一种核酸检测方法，它包括步骤：

(1)在含有报告分子的PCR反应体系中，用通用模板引物对待测样品进行PCR反应，其中所述引物对包括特异性结合于模板并引发的二个引物，且至少一个引物是通用模板引物，该通用模板引物包括：

(a)特异结合区，该特异结合区位于通用模板引物3＇端，用于与编码特异性结合；

(b)通用区，该通用区位于通用模板引物的5＇端并且具有报告分子结合区，报告分子可特异性结合于该报告分子结合区，且所述的报告分子在下列两种情况下的状态不同，从而产生可检测的信号：(i)结合于报告分子结合区，和(ii)报告分子被切断，

并且所述报告分子的数量大于或等于通用模板引物的数量；

检测报告分子所产生的可检测信号。

在本发明的一实例中，使用两种或两种以上不同的通用模板引物对，这些通用模板引物对分别特异性地结合于不同病原体的靶序列、同一病原体的不同靶序列、同一病原体的相同靶序列的不同区域、或其组合，并且这些通用模板引物对的报告分子结合区分别与相同或不同的报告分子发生特异性结合。

在本发明的第二方面，提供了一种通用模板引物对，所述引物对包括特异性结合于模板并引发PCR的二个引物，其中至少一个引物是通用模板引物，该通用模板引物包括：

(a)特异结合区，该特异结合区位于通用模板引物3＇端，用于与编码特异性结合；

(b)通用区，该通用区位于通用模板引物的5＇端并且具有报告分子结合区，报告分子可特异性结合于该报告分子结合区，且所述的报告分子在下列两种情况下的状态不同，从而产生可检测的信号：(i)结合于报告分子结合区，和(ii)报告分子被切断。

在本发明的一个实例中，所述的报告分子包括Taqman探针。

在本发明的第三方面，提供了一种核酸检测试剂盒，它含有本发明所述的通用模板引物对。

图1显示了本发明的通用模板引物的结构示意图。

图2显示了本发明通用模板引物对的各种组合形式。

图3是本发明一种核酸检测方法的示意图，其中使用的通用模板引物对含有一个通用模板引物。

图4是本发明一种核酸检测方法的示意图，其中使用的通用模板引物对含有二个通用模板引物。

如本文所用，下列词语/术语具有下列含义，除非另外说明。

“核酸”：核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、RNA或DNA的多核苷酸类似物、RNA或DNA的寡核苷酸类似物。

“靶”：待直接或间接检测的分析物，主要的靶是核酸等遗传物质。

“模板”：能够被核酸聚合酶扩增的核酸分子的全长或部分序列。模板抗原是RNA或DNA、或其类似物，并且可以是单链、双链或部分双链的。

“通用模板(UT)引物”：通用模板引物是合成的寡核苷酸序列。其3＇端有特异结合区，该特异结合区互补于靶序列并作为引物在扩增反应中延伸。此外，通用模板引物还含有通用区(也称为通用模板区或UT区)，该通用区位于通用模板引物的5＇端并且具有报告分子结合区。报告分子可特异性结合于该报告分子结合区。通用模板引物可以用本领域技术人员已知的各种方法合成(图1)。

“报告分子”是一种用于产生可检测信号的分子。所述的报告分子在下列两种情况下的状态不同，从而产生可检测的信号：(i)结合于报告分子结合区，和(ii)报告分子被切断。合适的报告分子例子包括(但并不限于)：Taqman探针、含稀土金属的寡核苷酸链等。

“Taqman探针”是一种在其5＇端带有报告基团并且在3＇端带有猝灭基团的寡核苷酸，所述的猝灭基团会抑制报告基团产生可检测的信号(例如荧光)。Taqman探针设计是现有技术，并且可以从公开途径获得有关信息(Heid CA，Stevens J，Livak KJ，Williams PM；Real Time Quantitaive PCR，Genome Res.1996Oct.；6(10)：986-94)。

“通用模板”指在本发明的PCR过程中，扩增出的掺入了通用模板引物的核酸序列，或其反义核酸序列。这些通用模板既具有对应于靶序列的核苷酸序列，又具有对应于通用模板引物通用区(含报告分子结合区)的核苷酸序列。在随后的PCR扩增循环中，这些通用模板作为模板起作用。

本发明所公开的方法原则上归为信号扩增法。其关键是使用了通用适应的核酸序列作为信号扩增的模板(在此称为“通用模板”)，因此相应的方法被称为“通用模板介导的扩增分析”(UT分析)。UT分析可灵敏、准确和标准化地检测和/或定量靶核酸分子。

在本发明中，对于待测样品没有限制，只要其中含有遗传物质即可。代表性的待测样品包括(但并不限于)：DNA样品、RNA样品、和从RNA经逆转录得到的cDNA样品，以及其他形式的修饰过的多聚核苷酸。

在本发明的通用模板引物中，对所述的特异结合区的长度没有特别限制，通常其长度为8-30bp，较佳地为15-25bp。对于所述通用区的也没有特别限制，通常其长度为15-100bp，较佳地为20-40bp，更佳地约为25-35bp。

通用模板引物中含有的核苷酸通常选自A、T、C、G。然而，在所述的通用模板引物中含有其他一些核苷酸以增加与模板的结合，例如选自下组的核苷酸：isoG、isoC、2＇-O-甲基-G、2＇-O-甲基-C、及其组合。

在本发明的反应体系中，报告分子与通用模板引物的数量关系没有特别限制。然而，较佳地，所述报告分子的数量大于或等于通用模板引物的数量，通常报告分子与通用模板引物之比大于1∶1-10∶1，更佳地为1.5∶1-5∶1。这样，在反应体系中，通用模板引物便基本上都处于与报告分子结合的状态。

当报告分子是Taqman探针时，Taqman探针与通用模板引物报告分子结合区的Tm，宜高于通用模板引物特异结合区与模板的Tm。通常，高出2-15℃，较佳地高出5-12℃。

在本发明中，如图2所示，通用模板引物对有3种组合形式：(1)上游为通用模板引物，下游为常规引物；(2)上游为通用模板引物，下游为通用模板引物；(3)上游为常规引物，下游为通用模板引物。

此外，对于与通用模板引物结合的报告分子，不同的通用模板可结合相同的报告分子，也可结合不同的报告分子(例如带有发不同荧光的报告基团和相应猝灭基团的报告分子)。

对于通用模板引物对扩增出的通用模板的长度没有特别限制。按通用模板引物对的两个引物的特异结合区的3＇端在模板上相距的距离表示，通常为1bp-10kb，较佳地为1-2kb，更佳地为1-500b，最佳地为1-100bp。尤其是是当间距小于100bp时，可设计针对例如病原体高保守区的引物对，从而降低假阴性率。此外，间距越短，越可发挥通用模板的通用性。

下面结合附图进一步说明本发明。

一、使用含通用模板引物和常规引物的引物对进行UT分析

现参见图3。在该例子中，使用一对通用模板引物对，该引物对由一个通用模板引物1和一个常规引物2构成。在该例子中，待检测的样品是RNA或DNA。

步骤1：将引物对和待测样品置于反应体系中，然后，在合适的条件下，发生退火(或杂交)，即通用模板引物1的3＇端的特异结合区结合于靶RNA或DNA序列。

步骤2：在逆向转录酶(对于RNA靶序列)或DNA聚合酶(对于DNA靶序列)，通用模板引物的3＇端向靶序列5＇端延伸，形成RNA/DNA或DNA/DNA双链。

步骤3：形成的双链核酸在合适的条件下变性，形成单链靶序列和新合成的DNA序列(即通用模板)。或者用RNase水解RNA链，形成新合成的DNA序列(即通用模板)。

步骤4(任选的)：必要时，在合适的条件下重复步骤1，2，和3。

步骤5：在合适条件下，常规引物2结合于新合成的DNA序列的互补区域。

步骤6：在DNA聚合酶存在下，常规引物2的3＇端向通用模板序列5＇端延伸，双链DNA(该双链中新合成的DNA序列也是通用模板)。当常规引物2的3＇端延伸到结合于报告分子结合区的报告分子处时，会发生以下3种情况：

(1)延伸停止；

(2)继续延伸，将报告分子从通用模板上置换下来；

(3)继续延伸，并切断或破坏报告分子。

在第一和第二种情况下，报告分子仍是完整的，因此不会产生可检测信号。而在第三种情况下，由于报告分子(如Taqman探针)5＇端上的猝灭基团被DNA聚合酶(如Taq聚合酶)的5＇核酸酶活性所水解，因此在Taqman探针3＇端处的报告基团就不再被猝灭，从而导致产生可检测信号(如荧光信号)。

步骤7：在下一循环中，通用模板引物1结合于含常规引物2序列的新合成的DNA序列。同时，常规引物2也结合含通用引物1序列的通用模板。

步骤8：通用模板引物1向靶序列5＇端延伸，形成DNA双链。这些DNA双链就是新的通用模板。同时，与步骤6中相同，当常规引物2的3＇端延伸到结合于报告分子结合区的报告分子处时，会发生以下3种情况：

(1)延伸停止；

(2)继续延伸，将报告分子从通用模板上置换下来；

(3)继续延伸，并切断或破坏报告分子。

在第一和第二种情况下，报告分子仍是完整的，因此不会产生可检测信号。而在第三种情况下，由于报告分子(如Taqman探针)5＇端上的猝灭基团被DNA聚合酶(如Taq聚合酶)的5＇核酸酶活性所水解，因此在Taqman探针3＇端处的报告基团就不再被猝灭，从而导致产生可检测信号(如荧光信号)。

步骤9：重复步骤7和8。

在经过若干循环后，与PCR原理相同，因报告分子被切断而产生的可检测信号也是成指数级(或近似于指数关系)增加的。在可检测信号是荧光的情况下，这些信号可用荧光阅读仪，如Roche＇s LightCycler，或着ABI GeneAmp 5700进行测定。

二、使用含二个通用模板引物的引物对进行UT分析

现参见图4。在该例子中，使用一对通用模板引物对，该引物对由二个通用模板引物1和2构成，通用模板引物2的3＇端延伸到结合于报告分子结合区的报告分子处时。在该例子中，待检测的样品是DNA或RNA。

步骤1：将引物对和待测样品置于反应体系中，然后，在合适的条件下，发生退火(或杂交)，即通用模板引物1的3＇端的特异结合区结合于靶RNA或DNA序列。

步骤2：在逆向转录酶(对于RNA靶序列)或DNA聚合酶(对于DNA靶序列)，通用模板引物的3＇端向靶序列5＇端延伸，形成RNA/DNA或DNA/DNA双链。

步骤3：形成的双链核酸在合适的条件下变性，形成单链靶序列和新合成的DNA序列(即通用模板)。或者用RNase水解RNA链，形成新合成的DNA序列(即通用模板)。

步骤4(任选的)：必要时，在合适的条件下重复步骤1，2，和3。

步骤5：在合适条件下，通用模板引物2结合于新合成的DNA序列的互补区域。

步骤6：在DNA聚合酶存在下，通用模板引物2的3＇端向通用模板序列5＇端延伸，双链DNA(该双链中新合成的DNA序列也是通用模板)。当通用模板引物2的3＇端延伸到结合于报告分子结合区的报告分子处时，会发生以下3种情况：

(1)延伸停止；

(2)继续延伸，将报告分子从通用模板上置换下来；

(3)继续延伸，并切断或破坏报告分子。

在第一和第二种情况下，报告分子仍是完整的，因此不会产生可检测信号。而在第三种情况下，由于报告分子(如Taqman探针)5＇端上的猝灭基团被DNA聚合酶(如Taq聚合酶)的5＇核酸酶活性所水解，因此在Taqman探针3＇端处的报告基团就不再被猝灭，从而导致产生可检测信号(如荧光信号)。

步骤7：在下一循环中，通用模板引物1结合于含通用模板引物2序列的新合成的DNA序列。同时，通用模板引物2也结合含通用引物1序列的通用模板。

步骤8：通用模板引物1向靶序列5＇端延伸，形成DNA双链。与步骤6中相同，当通用模板引物1的3＇端延伸到结合于报告分子结合区的报告分子处时以及通用模板引物2的3＇端延伸到结合于报告分子结合区的报告分子处时，都会发生以下3种情况：

(1)延伸停止；

(2)继续延伸，将报告分子从通用模板上置换下来；

(3)继续延伸，并切断或破坏报告分子。

在第一和第二种情况下，报告分子仍是完整的，因此不会产生可检测信号。而在第三种情况下，由于报告分子(如Taqman探针)5＇端上的猝灭基团被DNA聚合酶(如Taq聚合酶)的5＇核酸酶活性所水解，因此在Taqman探针3＇端处的报告基团就不再被猝灭，从而导致产生可检测信号(如荧光信号)。

步骤9：重复步骤7和8。

在经过若干循环后，与PCR原理相同，因报告分子被切断而产生的可检测信号也是成指数级(或近似于指数关系)增加的。在可检测信号是荧光的情况下，这些信号可用荧光阅读仪，如Roche＇s LightCycler，或着ABI GeneAmp 5700进行测定。

本发明具有明显优于现有技术的优点，其主要优点包括：

(1)易于复合式检测

掺入该UT区序列可在新合成的DNA序列中引入不属于靶序列的一段序列。而新合成的DNA序列可作为进一步DNA扩增的模板。与不同靶序列的数目无关，新合成的DNA序列是大部分是相同的-UT区序列，这使得各不同的靶序列被转变成具有共同特性的序列。因此，可以在相同或基本相同的条件下对该DNA序列继续处理或操作，易于实现例如多管同一条件、或一管多种靶序列等复合式检测。

(2)更高的分析灵敏度

通过使用一对含两个通用模板引物的引物对，或者对单个靶序列的不同位点设计多个通用模板引物对，可以产生现有技术中单探针模式更高水平的信噪比。

(3)高准确性

本发明的通用模板引物和UT核酸检测方法，可减少由下列因素导致的假阴性概率：

(a)在靶序列的探针(或引物)结合位点处的二级结构，这些二级结构可能会有效地影响探针(或引物)的结合；

(b)在靶序列的探针(或引物)结合位点处序列的改变，这些变化可以是由于不同的亚型或突变引起的。例如在HCV中，由于使用了各种药物，会导致HIV发生突变或变异。如用常规核酸检测方法，常会导致假阴性。而在各种生物(包括病原体)的遗传物质中找出高保守的短区域(如100bp或更短)是很方便的。利用本发明，可以设计针对这些短的、高保守区域(如40-50bp)的通用模板引物对，从而减少假阴性。根据，本发明人用多对通用模板引物对HIV突变株的检测，发现假阴性率减少50％。

(c)在样品加工或处理过程中长片段靶序列的断裂，而这种断裂发生在长片段的扩增的中间区域，会导致互补DNA序列复制的停止。

(4)简化或消除多重检测

在需要检测多种病原体时，目前常需要对某种病原体进行单独的检测。这是因为不同检测反应的最佳反应条件各不相同，因此，在同一反应管中进行PCR反应时，各扩增反应的效率难以接近一致，从而难以在同一反应管内同时检测多种病原体。

使用本发明的技术，因为通用模板的大部分是相同的，即UT区，因此便于在使检测各病原体的PCR的反应条件标准化，从而在一管中实现对多种病原体的检测。这使得本发明技术特别适用于献血样品检验等场合。

(5)降低使用UT荧光标记技术的多倍分析成本

在现有技术中，对于多个待测的靶核酸序列，需要相同数目的Taqman探针。与此相反，在本发明中，对于检测多个靶序列仅需一种UT荧光探针，因此可大大降低成本。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

UT分析检测HCV病毒(RNA病毒)

在该实施例中，设计了包括一个通用模板引物和一个常规引物的通用模板引物对，反应过程如图3所示。

在PCR方案是：从RNA逆转录成DNA：RT(50℃，20分钟，95℃，5分钟)；PCR：50℃，2分钟，94℃ 5分钟；94℃ 20秒；和61℃ 40秒，共40个循环。

通用模板引物为：

5-AAGGAACAGG  CGGCGACGAA  TCAACGACAG  AACGCAACCCAACGCTACTC-3＇(SEQ ID NO：1)

常规引物：

5＇-GTGCCCCCGC AAGACT-3＇(SEQ ID NO：2)

使用的Taqman探针序列是：

5＇-TCGTCGCCGC CTGTTCCTTA-3＇(SEQ ID NO：3)

其中使用的报告基团是6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein，6-FAM)(位于5＇端的)，猝灭基团是6-羧基-四甲基罗丹明(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine，TAMRA)(位于3＇端的)。

检测时使用的检测仪器为ABI GeneAmp 5700，激发光源为卤素灯，波长为488nm。

用上述引物及相应的Taqman探针在ABI5700基因扩增仪进行扩增。结果，加入不同稀释度阳性样品在不同循环(Ct)出现荧光信号，而阴性样品及其他非特异对照样品(含有其他病原体的样品)在扩增反应结束时(Ct＞40)时均未出现荧光信号。

实施例2

UT分析检测HBV病毒(DNA病毒)

在该实施例中，设计了包括一个通用模板引物和一个常规引物的通用模板引物对，反应过程如图3所示。

在PCR方案是：PCR：50℃，2分钟，94℃ 5分钟；94℃ 20秒；和61℃ 40秒，共40个循环。

通用模板引物分别为：

5-AAGGAACAGG CGGCGACGAA TCAACGACAG AACCAGCGAT AGCCAGGACA-3＇(SEQ ID NO：4)

常规引物：

5＇-CCTCCAATCA CTCACCAACC-3＇(SEQ ID NO：5)

使用的Taqman探针序列是：

5＇-TCGTCGCCGC CTGTTCCTTA-3＇(SEQ ID NO：3)

其中使用的报告基团是6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein，6-FAM)(位于5＇端的)，猝灭基团是6-羧基-四甲基罗丹明(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine，TAMRA)(位于3＇端的)。

检测时使用的检测仪器为ABI GeneAmp 5700，激发光源为卤素灯，波长为488nm。

用上述引物及相应的Taqman探针在ABI5700基因扩增仪进行扩增。结果，加入不同稀释度阳性样品在不同循环(Ct)出现荧光信号，而阴性样品及其他非特异对照样品(含有其他病原体的样品)在扩增反应结束时(Ct＞40)时均未出现荧光信号。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                            序列表<110>曹卫<120>通用模板核酸检测方法和试剂盒<130>012158<160>5<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>50<212>DNA<213>合成的引物<400>1aaggaacagg cggcgacgaa tcaacgacag aacgcaaccc aacgctactc                50<210>2<211>16<212>DNA<213>合成的引物<400>2gtgcccccgc aagact                                                     16<210>3<211>20<212>DNA<213>合成的引物<400>3tcgtcgccgc ctgttcctta                                                 20<210>4<211>50<212>DNA<213>合成的引物<400>4aaggaacagg cggcgacgaa tcaacgacag aaccagcgat agccaggaca                50<210>5<211>20<212>DNA<213>合成的引物<400>5cctccaatca ctcaccaacc                                                  20

Claims (10)

1.一种通用模板引物对，其特征在于，所述引物对包括特异性结合于模板并引发聚合酶链反应的二个引物，其中至少一个引物是通用模板引物，该通用模板引物包括：

(a)特异结合区，该特异结合区位于通用模板引物3＇端，用于与编码特异性结合；

(b)通用区，该通用区位于通用模板引物的5＇端并且具有报告分子结合区，报告分子可特异性结合于该报告分子结合区，且所述的报告分子在下列两种情况下的状态不同，从而产生可检测的信号：(i)结合于报告分子结合区，和(ii)报告分子被切断。

2.如权利要求1所述的通用模板引物对，其特征在于，所述的报告分子包括Taqman探针。

3.如权利要求1所述的通用模板引物对，其特征在于，所述的特异结合区长度为8-30bp，所述通用区的长度为15-100bp。

4.如权利要求1所述的通用模板引物对，其特征在于，所述的特异结合区长度为15-25bp，所述通用区的长度为20-40bp。

5.如权利要求1所述的通用模板引物对，其特征在于，在所述的通用模板引物中含有选自下组的核苷酸：isoG、isoC、2＇-O-甲基-G、2＇-O-甲基-C、及其组合。

6.一种检测试剂盒，其特征在于，它含有权利要求1所述的通用模板引物对。

7.一种检测核酸检测方法，其特征在于，它包括步骤：

(1)在含有报告分子的PCR反应体系中，用通用模板引物对待测样品进行PCR反应，其中所述引物对包括特异性结合于模板并引发的二个引物，且至少一个引物是通用模板引物，该通用模板引物包括：

(a)特异结合区，该特异结合区位于通用模板引物3＇端，用于与编码特异性结合；

(b)通用区，该通用区位于通用模板引物的5＇端并且具有报告分子结合区，报告分子可特异性结合于该报告分子结合区，且所述的报告分子在下列两种情况下的状态不同，从而产生可检测的信号：(i)结合于报告分子结合区，和(ii)报告分子被切断；

(2)检测报告分子所产生的可检测信号。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的报告分子包括Taqman探针。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的待测样品选自下组：DNA样品、RNA样品、和从RNA经逆转录得到的cDNA样品。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，使用两种或两种以上不同的通用模板引物对，这些通用模板引物对分别特异性地结合于不同病原体的靶序列、同一病原体的不同靶序列、同一病原体的相同靶序列的不同区域、或其组合，并且这些通用模板引物对的报告分子结合区分别与相同或不同的报告分子发生特异性结合。

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