CN110205363A - 载脂蛋白e基因kasp分型检测试剂盒及其方法 - Google Patents

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张磊
程小欢
干学东
何思颖
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杨娜
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

本发明公开了一种载脂蛋白E基因KASP分型检测试剂盒及其方法，载脂蛋白E基因KASP分型检测试剂盒包括有用于KASP方法的引物对A和B，Master‑Mix试剂及各基因型的质粒标准品。本发明是基于Bio‑Rad荧光定量PCR平台的KASP技术，用于载脂蛋白E的基因分型方法，采用特定的荧光标记的引物，建立了双荧光定量PCR的基因分型方法。本发明的载脂蛋白E基因分型检测试剂盒可检测DNA浓度低至10ng/μL的样本，灵敏度高，与Sanger测序结果符合度为100％，可靠性佳。

Description

载脂蛋白E基因KASP分型检测试剂盒及其方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体是指一种载脂蛋白E基因KASP分型检测试剂盒及其方法。
背景技术
人类的载脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)基因定位于19q13.2，长度约为3.6Kb，包括4个外显子和3个内含子，在ApoE基因区域内共有1833个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点，编码区内438个，其中以rs429358和rs7412在人群中的频率最高，研究较为广泛和深入，临床价值和意义最大。
rs429358和rs7412的SNP均只存在一个碱基的变化(T/C)，产生了ε2，ε3，ε4三个等位基因型和六种基因型，即ε2/ε2，ε2/ε3，ε3/ε3，ε3/ε4，ε2/ε4和ε4/ε4。ApoE的基因多态性表现为ε2，ε3，ε4三种等位基因型，不同型别的等位基因所编码的氨基酸链也有所差异，主要表现在第112位和第158位氨基酸的不同，具体表现为ε2型在112位和158位编码的氨基酸均为半胱氨酸(Cys)，ε4型在相同的位置编码的则为精氨酸(Arg)，ε3型在112位是半胱氨酸(Cys)，158位是精氨酸(Arg)。人们采用ApoE2代表ε2所编码的氨基酸链，同理ApoE3及ApoE4分别代表ε3和ε4所编码的氨基酸链。
ApoE的基因多态性影响其生物学功能，相较于E4型，E2和E3型与高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)有更高的结合活性，而E4型则与极低密度脂蛋白(verylow density lipoprotein，VLDL)的亲和力更强。导致ApoE4型个体外周血血清总胆固醇(total cholesterol，TC)和低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoproteincholesterol，LDL-C)的较高水平，而ApoE2型则恰恰相反。ε2型等位基因携带者的LDL-C水平显著低于ε3和ε4型携带者。而血脂水平是动脉硬化性心血管疾病(arterioscleroticcardiovascular disease,ASCVD)的风险因素，ApoE4携带者常伴有ASCVD的高风险。然而，ApoE2/2型的纯合子个体由于对LDL的结合力低，容易罹患III型高脂血症。ApoE4携带者还容易罹患阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)，单个ε4等位基因提示存在风险，而ε4/ε4纯合型则提示高危风险，不同ApoE基因型的个体对调脂治疗的反应也有差别。
因此，ApoE基因分型不论是在基础科学研究范畴，还是在临床疾病的预防、诊断和治疗领域，都具有积极的指导意义。
竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR，KASP)分型方法是基于双荧光标记和等位基因特异性引物的方法，针对SNP位点设计特异性引物并添加双荧光标记对突变型和野生型进行分型。
本试剂盒拟建立ApoE基因分型的KASP的方法。该方法操作简便，检测成本价格低廉，检测灵敏度高，适合高通量样本测试，而且准确度高。
发明内容
针对现有技术不足，本发明的目的在于提供一种灵敏度高、特异性良好、经济的载脂蛋白E基因KASP分型检测试剂盒及其方法。
为实现上述目的，本发明提供的一种载脂蛋白E基因KASP分型检测试剂盒，其特征在于：包括检测ApoE基因rs429358和rs7412位点的KASP方法的引物，包含各基因型的质粒标准品和针对KASP实验所需的Master-Mix试剂；应用了KASP技术，所检测的ApoE基因rs429358和rs7412位点的引物如下：
(1)引物：rs429358-primer-FAM；3’-5’引物序列：CGCGGACATGGAGGACGTGT；
(2)引物：rs429358-primer-HEX；3’-5’引物序列：GCGGACATGGAGGACGTGC；
(3)引物：rs429358-primer-Common；3’-5’引物序列：CTCGCCGCGGTACTGCACC；
(4)引物：rs7412-primer-FAM；3’-5’引物序列：GATGCCGATGACCTGCAGAAGT；
(5)引物：rs7412-primer-HEX；3’-5’引物序列：ATGCCGATGACCTGCAGAAGC；
(6)引物：rs7412-primer-Common；3’-5’引物序列：CCCGGCCTGGTACACTGCC。
本发明还提供了一种载脂蛋白E基因KASP分型检测方法，其特征在于：所述检测方法采用ApoE基因rs429358位点的两个荧光标记的引物和一个通用引物，以及rs7412位点的两个荧光标记的引物和通用引物；
应用KASP技术对受检样本DNA的单个位点同时加入进行野生型和突变型的荧光标记引物和通用引物的进行双荧光定量PCR扩增；根据目的片段的荧光类型来进行野生/突变的纯合子、杂合子的分型；根据配套软件对检测结果进行分群标识。
作为优选方案，所述双荧光定量PCR扩增条件包括以下步骤：
(1)预变性由1次循环构成，条件为：温度为94℃，时间为15分钟；
(2)PCR扩增由两个阶段组成：
A阶段一，10个循环；
变性：温度为94℃，时间为20秒；
退火：温度为61℃，时间1分钟，(每个循环下降0.6℃)；
B阶段二，26个循环；
变性：温度为94℃，时间为20秒；
退火：温度为55℃，时间为1分钟；
(3)扩增结束后在37℃1分钟，进行荧光检测。
具体步骤如下：
(1)提取待测样本DNA(灭菌去离子水溶解，浓度均一为10ng/μL)；(2)针对rs429358和rs7412分别使用引物组A和B在Bio-Rad荧光定量PCR平台进行扩增分型；(3)根据标准品比对和等位基因的分群结果来判断SNP位点的分型结果。
其中，引物组A用于rs429358位点的基因分型：
rs429358-primer-FAM CGCGGACATGGAGGACGTGT
rs429358-primer-HEX GCGGACATGGAGGACGTGC
rs429358-primer-Common CTCGCCGCGGTACTGCACC
引物组B用于rs7412位点的基因分型：
rs7412-primer-FAM GATGCCGATGACCTGCAGAAGT
rs7412-primer-HEX ATGCCGATGACCTGCAGAAGC
rs7412-primer-Common CCCGGCCTGGTACACTGCC
上述引物通过如下方法设计得到：从NCBI数据库获得ApoE基因序列，通过分析该序列中含有rs429358和rs7412位点的片段，采用在线引物设计软件primer 3.0(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)设计两位点的等位基因特异性引物，由英国LGC(Laboratory of the Government Chemist政府化学家实验室)有限公司公司合成并添加不同的荧光标记和接头序列。经过反复试验筛选和验证，得到了扩增效率高、特异性好，能够对两位的进行准确分型的引物。
上述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：①提取待测样本DNA(灭菌去离子水溶解，浓度均一为10ng/μL)；②针对rs429358和rs7412分别使用引物组A和B在CFX(Bio-Rad)平台进行扩增分型；③根据质粒标准品比对和等位基因的分群结果来判断SNP位点的分型结果。
上述KASP反应体系优选为：DNA 50ng，Master Mix 5μL，引物0.14μL。
上述PCR扩增条件优选为：94℃15min；94℃20s，61℃1min(-0.6℃/cycle),10cycles；94℃20s，55℃1min，26cycles。在37℃1min检测荧光。
本发明中用于ApoE基因分型的对照方法为普通PCR扩增后Sanger测序，包括如下步骤：①提取待测样本DNA；②使用特异性引物扩增包括rs429358和rs7412两SNP位点的片段；③扩增产物进行Sanger测序，验证KASP分型结果。
其中，引物对C用于Sanger测序方法，验证KASP分型方法结果的准确性。
sequencing primer-Forward AACAACTGACCCCGGTGGCG
sequencing primer-Reverse ATGGCGCTGAGGCCGCGCTCGG
上述引物通过如下方法设计得到：从NCBI数据库获得ApoE基因序列，对含有rs429358和rs7412两位点的片段设计特异性引物，引物设计采用Primer 3.0设计。经过反复试验筛选和验证，得到了扩增效率高、特异性好，能够扩增出单一目的条带的引物。
Sanger测序技术包含上述引物对C及PCR试剂(dNTPs、High-GC DNA聚合酶、DNA聚合酶buffer等)，包括如下步骤：①提取待测样本DNA；②使用特异性引物对目的片段进行扩增；③对扩增产物进行Sanger测序，检测突变位点碱基，验证分型结果。所述的PCR反应体系优选为：Buffer(10×)10μL，dNTPs(10mM)1μL，High G-C DNA聚合酶0.5μL，上游引物(F)0.5μL，下游引物(R)0.5μL，ddH2O 10.5μL，DNA模板1μL，DMSO 1μL。所述的PCR扩增条件优选为：95℃12min，94℃1min，72℃1min；95℃1min，64.8℃1min，72℃1min，30cycles；72℃10min。
本发明的优点及有益效果如下：本发明基于KASP技术来对ApoE进行基因分型检测，分型结果与Sanger测序金标准100％一致，准确性有保障。DNA样本浓度10ng时仍然可以准确分型，灵敏度较高。同时，在高通量样本检测时，单个位点的检测成本较低。本方法利用KASP的技术来进行ApoE基因分型的检测，大大提高了检测效率，降低了检测成本。检测结果简单，直观，而且高通量。
附图说明
图1为rs429358位点KASP分型结果。
图2为rs7412位点KASP分型结果。
图3为rs429358位点测序结果，由上至下分别为TT、TC和CC基因型。
图4为rs7412位点测序结果，由上至下TT、TC和CC基因型。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步地详细描述。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
实施例一KASP分型法检测32例样本。
DNA样本采用手工提取的方法，用灭菌后的去离子水溶解。DNA样本的浓度及纯度采用NanoDrop-2000c进行检测。质粒标准品的制备，采用PCR产物切胶纯化后与pMD18-T载体相连，随后转入DH5α感受态中，Amp(+)平板中过夜培养后挑取10个阳性克隆提取质粒测序。
进行扩增实验前，DNA样本和各基因型的质粒标准品浓度使用灭菌后的去离子水稀释至10ng/μL。
PCR扩增条件优选为：94℃15min；94℃20s，61℃1min(-0.6℃/cycle)，10cycles；94℃20s，26cycles；55℃1min。在37℃1min检测荧光。
引物优选如下：
其中，用于rs429358位点的引物：
rs429358-primer-FAM CGCGGACATGGAGGACGTGT
rs429358-primer-HEX GCGGACATGGAGGACGTGC
rs429358-primer-Common CTCGCCGCGGTACTGCACC
用于rs7412位点的引物：
rs7412-primer-FAM GATGCCGATGACCTGCAGAAGT
rs7412-primer-HEX ATGCCGATGACCTGCAGAAGC
rs7412-primer-Common CCCGGCCTGGTACACTGCC
结果发现各位点的质粒标准品都有明显分群，call rate为100％，DNA测试样本都有与质粒标准品分群一致的表现，表明引物可以起到特异性分型的作用。且经测序验证，分型结果与KASP检测结果100％一致。
实施例二 Sanger测序验证KASP分型结果
DNA样本与KASP实验中使用的DNA样本相同，使用灭菌后的去离子水稀释至10ng/μL。设置空白对照，使用50bp的DNA Marker，预期在250bp-300bp之间出现目的条带(292bp)。
针对目的片段序列设计PCR引物，PCR扩增条件优选为：95℃12min，94℃1min，72℃1min；95℃1min，64.8℃1min，72℃1min，30cycles；72℃10min。
优选的引物为
上游：AACAACTGACCCCGGTGGCG
下游：ATGGCGCTGAGGCCGCGCTCGG
本实施例通过普通PCR扩增的方法，对KASP技术检测的DNA样本进行扩增。取扩增产物2μL混合1μL上样buffer，进行琼脂糖凝胶电泳，紫外线下可观察到均匀单一的目的条带。对所有扩增产物送检测序，比对测序结果和KASP方法分型结果，100％一致。
附申请KASP方法与金标准Sanger测序分型方法的结果比较：
表1.ApoE基因型对应SNP位点的碱基
基因型 ε2/ε2 ε3/ε3 ε4/ε4 ε2/ε3 ε2/ε4 ε3/ε4
rs429358 T/T T/T C/C T/T T/C T/C
rs7412 T/T C/C C/C T/C T/C C/C
表2.两种方法对rs429358位点分型一致性的比较
C/C符合率＝100/％
C/T符合率＝100％
T/T符合率＝100％
C/C+C/T+T/T总符合率＝100％
表3.两种方法对rs7412位点分型一致性的比较
C/C符合率＝100％
C/T符合率＝100％
T/T符合率＝100％
C/C+C/T+T/T总符合率＝100％。
序列表
<110> 武汉大学
<120> 载脂蛋白E基因KASP分型检测试剂盒及其方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
cgcggacatg gaggacgtgt 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
gcggacatgg aggacgtgc 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
ctcgccgcgg tactgcacc 19
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
gatgccgatg acctgcagaa gt 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 5
atgccgatga cctgcagaag c 21
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 6
cccggcctgg tacactgcc 19

Claims (4)

1.一种载脂蛋白E基因KASP分型检测试剂盒，其特征在于：包括检测载脂蛋白E基因rs429358和rs7412位点的KASP方法的引物，包含各基因型的质粒标准品和针对KASP实验所需的Master-Mix试剂；应用了KASP技术，所检测的载脂蛋白E基因rs429358和rs7412位点的引物如下：
(1)引物：rs429358-primer-FAM；3’-5’引物序列：CGCGGACATGGAGGACGTGT；
(2)引物：rs429358-primer-HEX；3’-5’引物序列：GCGGACATGGAGGACGTGC；
(3)引物：rs429358-primer-Common；3’-5’引物序列：CTCGCCGCGGTACTGCACC；
(4)引物：rs7412-primer-FAM；3’-5’引物序列：GATGCCGATGACCTGCAGAAGT；
(5)引物：rs7412-primer-HEX；3’-5’引物序列：ATGCCGATGACCTGCAGAAGC；
(6)引物：rs7412-primer-Common；3’-5’引物序列：CCCGGCCTGGTACACTGCC。
2.一种载脂蛋白E基因KASP分型检测方法，其特征在于：所述检测方法应用如权利要求1所述载脂蛋白E基因KASP分型检测试剂盒中载脂蛋白E基因rs429358位点的两个荧光标记的引物和一个通用引物，以及rs7412位点的两个荧光标记的引物和通用引物；应用KASP技术对受检样本DNA的单个位点同时加入野生型和突变型的荧光标记引物和通用引物，进行双荧光定量PCR扩增；根据目的片段的荧光类型来进行野生/突变的纯合子、杂合子的分型；根据配套软件对检测结果进行分群标识；具体步骤如下：
(1)提取待测样本DNA，灭菌去离子水溶解，浓度为10ng/μL；
(2)针对rs429358和rs7412分别使用引物组A和B在Bio-Rad荧光定量PCR平台进行扩增分型；
(3)根据标准品比对和等位基因的分群结果来判断SNP位点的分型结果；
其中，引物组A用于rs429358位点的基因分型：
rs429358-primer-FAM CGCGGACATGGAGGACGTGT
rs429358-primer-HEX GCGGACATGGAGGACGTGC
rs429358-primer-Common CTCGCCGCGGTACTGCACC
引物组B用于rs7412位点的基因分型：
rs7412-primer-FAM GATGCCGATGACCTGCAGAAGT
rs7412-primer-HEX ATGCCGATGACCTGCAGAAGC
rs7412-primer-Common CCCGGCCTGGTACACTGCC。
3.根据权利要求2所述的载脂蛋白E基因KASP分型检测方法，其特征在于：所述引物通过如下方法设计得到：从NCBI数据库获得载脂蛋白E基因序列，通过分析该序列中含有rs429358和rs7412位点的片段，采用在线引物设计软件primer3.0设计两位点的等位基因特异性引物，并添加荧光标记和接头序列；经过反复试验筛选和验证，得到能对两位点进行准确分型的引物。
4.根据权利要求2或3所述的载脂蛋白E基因KASP分型检测方法，其特征在于：所述双荧光定量PCR扩增条件包括以下步骤：
(1)预变性由1次循环构成，条件为：温度为94℃，时间为15分钟；
(2)PCR扩增由两个阶段组成：
A阶段一，10个循环；
变性：温度为94℃，时间为20秒；
退火：温度为61℃，时间1分钟，(每个循环下降0.6℃)；
B阶段二，26个循环；
变性：温度为94℃，时间为20秒；
退火：温度为55℃，时间为1分钟；
(3)扩增结束后在37℃1分钟，进行荧光检测。
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