CN103602750A - 一种低肾上腺素型肥胖基因体质评估的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种低肾上腺素型肥胖基因体质评估方法，其特征在于，通过同时检测分析个体的AGT基因、AGTR1基因、NOS3基因SNPs位点基因携带型为所有的受检者提供低肾上腺素型肥胖体质评估，可以让受检者在考虑以饮食和运动方式进行瘦身之前，先了解自身基因体质情况，了解个人的肥胖潜能成因，选择最适合的个体化营养及运动瘦身方式，将各种肥胖基因表现的型态一一击破，达到最有效健康的减重效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种低肾上腺素型肥胖基因体质评估方法，可用于评估低肾上腺素型肥胖基因体质情况，针对性的提示受检者根据遗传体质选择不同的减肥策略，属于分子生物学技术领域。
背景技术
肥胖症是一种热量代谢障碍，摄入热量超过消耗的热量，引起体内脂肪积聚过多所致。一般认为超过按身高所测标准体重20%即可成为肥胖。肥胖症是一种与遗传因素及生活方式密切相关的慢性疾病，它会引发血脂升高，容易造成脂肪肝、动脉血管病变、心脏病、糖尿病，肥胖的儿童还会引发性功能发育不良并导致成人期各种疾病发病率和死亡率上升。因此，若通过有效的方法来预防，就能避免过早地出现高血压、冠心病、糖尿病、脑血管病等疾患，从而提高人们的生存质量。
由于至少有40%躯体脂肪量的差异是由遗传因素引起的，所以很容易明确遗传对肥胖有很大影响。遗传体质不同的人在患肥胖症时应采取不同的减肥策略，利用现代科学研究成果，开发一项基于分子遗传基础的体重管理分子检测产品会对减肥者的减肥计划提供基因减肥概念的个性化体重管理建议，具有较强的社会意义和市场前景。目前肥胖症的临床治疗方法主要是饮食和运动疗法，但存在着碳水化合物、脂肪以及蛋白质摄入量控制“一刀切” 和盲目采用减肥药物的非个体化治疗方式。原因主要在于无法明确地将患者区分成为不同的减重体质，从而对不同患者是否需要严格控制碳水化合物的摄入，是否需要控制脂肪的摄入，是否需要使用减肥药物，以及应该使用哪类减肥药物的治疗措施选择上没有明确指导。
肾上腺主要负责人体对于灾难的反应。当肾上腺素分泌时，人体血压上升、口干舌燥、心跳加快、血管扩张等等，都是为了对抗外界的压力。而这些现象需要消耗大量的热量来维持。当体重增加时，就会激活某些基因，这些基因会导致体内盐分和水分的潴留，升高血压，并引起进一步的增重。
研究发现，低肾上腺素型肥胖相关基因变异因反复节食而造成新陈代谢缓慢，是造成水肿型肥胖的主要凶手。许多人在减重期间的饮食控制以不合理的节食来进行。须知道人体有一定的基础代谢率，热量长期摄取低下的结果，会导致身体的基础代谢率下降，使身体进入类似冬眠状态以减低能量消耗，当减重过后恢复正常饮食，一旦摄取热量增加，便轻易形成脂肪且不易消耗，若是长期如此体重减轻而又回复，会使减重变得更不容易。
研究发现AGT，AGTR1，NOS3基因与低肾上腺素型肥胖体质有关。
AGT为血管紧张素原(angiotensinogen)的编码基因，由该基因编码的蛋白是血管紧张素前体，其作为唯一的肾素作用底物，在肾素—血管紧张素系统(
reninangiotensin system ，RAS) 中，对调节血管张力、心脏和血管重构起到重要作用。肾素血管紧张素系统在血管生长和血管病变的调节中起重要作用，它由一系列激素及相应的酶组成，通过对血容量和外周阻力的控制调节人体血压和水、电解质平衡。AGT基因是此系统一个重要基因，国内外的众多研究表明AGT基因上的多态现象与该系统密切相关。研究表明，该基因与原发性高血压的相关性与体重指数有关，体重正常的男性基因型携带者易患高血压病。
AGTR1为I型血管紧张素II受体（Angiotensin II receptor type 1，AGTR1）的一些多态位点与高血压有关。目前已认识到，AngⅡ不仅是一种血管活性物质，可引起机体血流动力学改变，导致高血压的发生，而且更为重要的是它是一种生长因子，在一些以组织器官进行性纤维化为特征的慢性心血管、肾脏疾病的进展中也起着非常重要的作用。携带风险基因时，机体对血管紧张素敏感性增高，血管壁张力增加、醛固酮释放增多，易造成水钠潴留，引发高血压，并引起体重进一步的增加。
NOS3即nitric oxide synthase 3 (endothelial cell)，中文名称内皮一氧化氮合成酶。内皮型一氧化氮合成酶（NOS3）主要分布于冠状血管及心腔面的内膜，主要功能是参与精氨酸和脯氨酸代谢，并催化生成(NO)。一氧化氮是一种内皮松弛因子，具有舒张血管、调节血流、抑制血管平滑肌细胞增殖、抑制血小板和白细胞粘附等重要功能，参与了多种疾病的病理生理过程。现有的研究表明，NOS3基因的多态，与个体罹患心血管疾病，如高血压、冠心病等疾病的易感性相关。功能受损的NOS3基因将会增加该类疾病患病的风险。基因变异影响了细胞膜内外钠氢离子的交换，进而影响了细胞内的酸碱度，改变血管阻力，增加了高血压的发病风险。
目前的基础研究已能从理论上证明基因分型检测可以用于判断肥胖体质的类型，而且检测方法简便、检测成本在可接受程度中、检测结果可信。因此，基因分型检测用于评估肥胖体质的可行性是明确的。根据基因检测结果结合体重管理测评系统建立个性化体重健康评估报告，有针对的解决体重控制问题，提高人们生活质量。因此利用现有科学、技术研究成果来开发这样一个产品，时机是成熟的。
本发明的目的是提供一种低肾上腺素型肥胖基因体质评估方法，可以让受检者在考虑以饮食和运动方式进行瘦身之前，先了解自身基因体质情况，了解个人的肥胖潜能成因，选择最适合的个体化营养及运动瘦身方式，将各种肥胖基因表现的型态一一击破，达到最有效健康的减重效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种低肾上腺素型肥胖基因体质评估方法，可以让受检者在考虑以饮食和运动方式进行瘦身之前，先了解自身基因体质情况，了解个人的肥胖潜能成因，选择最适合的个体化营养及运动瘦身方式，将各种肥胖基因表现的型态一一击破，达到最有效健康的减重效果。
为实现以上目的，本发明提供一种低肾上腺素型肥胖基因体质评估方法。其具体步骤为：
步骤1：检测的样品类型与采样方法
用采样拭在口腔中分别左右两腮至少需要各上下刮40次以上，以保证采集到足量的细胞样本；
步骤2：基因组DNA的抽提方法
采用硅胶吸附法抽提每一个口腔上皮细胞样本的基因组DNA，时间为2小时－2.5小时，经电泳检测后，用肉眼可见清晰白色条带即可判断获得的DNA能进入下一步检测；
步骤3：荧光定量PCR反应
将每一个被测者样本分别放入3个反应孔，同时检测3个位点，即血管紧张素原基因（AGT）rs5051；血管紧张素Ⅱ 1型受体基因（AGTR1）rs5186；内皮型一氧化氮合成酶基因（NOS3）rs1799983，另外根据实验需要增设不含DNA模版的NTC空白对照孔；
每一个反应孔的基因分型可以根据下表的引物和探针设计，采用TaqMan®-MGB技术，进行检测试剂合成；
在每一个反应孔中加入试剂为荧光定量PCR反应体系，总体积为10µl，即浓度为20ng/µl 的DNA模板2µl 、1µl 10X荧光定量PCR反应缓冲液ABI Taqman ® MGB、0.1µl
25mM d NTP合成DNA的四种脱氧核苷酸底物、0.5µl
25mM MgCl2溶液、0.02µl（5units/µl）Taq DNA聚合酶、去离子水4.98µl、4个位点分别采用不同的正向引物（20µM，0.225µl）、反向引物（20µM，0.225µl）、VIC荧光探针（10µM，0.25µl）和FAM荧光探针（10µM，0.25µl）工具进行检测（详见下表）；
将反应孔和空白对照在PCR扩增仪上进行反应，先进行预热：50℃、2分钟，95℃、10分钟，然后再进行60个循环的95℃、30秒，60℃、1分钟、反应结束后取出后再放入荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，得到血管紧张素原基因（AGT）rs5051；血管紧张素Ⅱ 1型受体基因（AGTR1）rs5186；内皮型一氧化氮合成酶基因（NOS3）rs1799983三张图。
步骤4：SNP基因型分析
将荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号的3个图和一个NTC空白对照进行比较，每个位点理论上存在三种不同的信号，纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧光信号，分别代表该位点三种不同的基因型；
（1）、血管紧张素原基因（AGT）rs5051
在检测结果图中，坐标轴左下区域黑点为空白对照、坐标轴左上区域蓝点为AA基因型、坐标轴右上区域绿点为AG基因型、坐标轴右下区域红点为GG基因型，
（2）、血管紧张素Ⅱ 1型受体基因（AGTR1）rs5186
在检测结果图中，坐标轴左下区域黑点为空白对照、坐标轴左上区域蓝点为AA基因型、坐标轴右上区域绿点为AC基因型、坐标轴右下区域红点为CC基因型，
（3）、内皮型一氧化氮合成酶基因（NOS3）rs1799983
在检测结果图中，坐标轴左下区域黑点为空白对照、坐标轴左上区域蓝点为GG基因型、坐标轴中间区域绿点为GT基因型、坐标轴右下区域红点为TT基因型，
本发明3个位点的基因分型可以采用TaqMan®-MGB技术对这些位点进行基因分型。经重复实验验证，基因分型的准确率达到了99％以上，重复性达到了100％。除此之外，基因测序等技术也可以作为备选的基因分型手段。
本发明的优点是：检测准确率高，可重复性强。
附图说明
图1为血管紧张素原基因（AGT）rs5051示意图；
图2为血管紧张素Ⅱ 1型受体基因（AGTR1）rs5186示意图；
图3为内皮型一氧化氮合成酶基因（NOS3）rs1799983示意图。
具体实施方式
本发明的目的是提供一种低肾上腺素型肥胖基因体质评估方法，可以让受检者在考虑以饮食和运动方式进行瘦身之前，先了解自身基因体质情况，了解个人的肥胖潜能成因，选择最适合的个体化营养及运动瘦身方式，将各种肥胖基因表现的型态一一击破，达到最有效健康的减重效果。
为实现以上目的，本发明提供一种低肾上腺素型肥胖基因体质评估方法。其具体步骤为：
步骤1：检测的样品类型与采样方法
用采样拭在口腔中分别左右两腮至少需要各上下刮40次以上，以保证采集到足量的细胞样本；
步骤2：基因组DNA的抽提方法
采用硅胶吸附法抽提每一个口腔上皮细胞样本的基因组DNA，时间为2小时－2.5小时，经电泳检测后，用肉眼可见清晰白色条带即可判断获得的DNA能进入下一步检测；
步骤3：荧光定量PCR反应
将每一个被测者样本分别放入3个反应孔，同时检测3个位点，即血管紧张素原基因（AGT）rs5051；血管紧张素Ⅱ 1型受体基因（AGTR1）rs5186；内皮型一氧化氮合成酶基因（NOS3）rs1799983，另外根据实验需要增设不含DNA模版的NTC空白对照孔；
每一个反应孔的基因分型可以根据下表的引物和探针设计，采用TaqMan®-MGB技术，进行检测试剂合成；
在每一个反应孔中加入试剂为荧光定量PCR反应体系，总体积为10µl，即浓度为20ng/µl 的DNA模板2µl 、1µl 10X荧光定量PCR反应缓冲液ABI Taqman ® MGB、0.1µl
25mM d NTP合成DNA的四种脱氧核苷酸底物、0.5µl
25mM MgCl2溶液、0.02µl（5units/µl）Taq DNA聚合酶、去离子水4.98µl、4个位点分别采用不同的正向引物（20µM，0.225µl）、反向引物（20µM，0.225µl）、VIC荧光探针（10µM，0.25µl）和FAM荧光探针（10µM，0.25µl）工具进行检测（详见下表）；
将反应孔和空白对照在PCR扩增仪上进行反应，先进行预热：50℃、2分钟，95℃、10分钟，然后再进行60个循环的95℃、30秒，60℃、1分钟、反应结束后取出后再放入荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，得到血管紧张素原基因（AGT）rs5051；血管紧张素Ⅱ 1型受体基因（AGTR1）rs5186；内皮型一氧化氮合成酶基因（NOS3）rs1799983三张图。
步骤4：SNP基因型分析
将荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号的3个图和一个NTC空白对照进行比较，每个位点理论上存在三种不同的信号，纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧光信号，分别代表该位点三种不同的基因型；
（1）、血管紧张素原基因（AGT）rs5051
在检测结果图中，坐标轴左下区域黑点为空白对照、坐标轴左上区域蓝点为AA基因型、坐标轴右上区域绿点为AG基因型、坐标轴右下区域红点为GG基因型，
（2）、血管紧张素Ⅱ 1型受体基因（AGTR1）rs5186
在检测结果图中，坐标轴左下区域黑点为空白对照、坐标轴左上区域蓝点为AA基因型、坐标轴右上区域绿点为AC基因型、坐标轴右下区域红点为CC基因型，
（3）、内皮型一氧化氮合成酶基因（NOS3）rs1799983
在检测结果图中，坐标轴左下区域黑点为空白对照、坐标轴左上区域蓝点为GG基因型、坐标轴中间区域绿点为GT基因型、坐标轴右下区域红点为TT基因型，
步骤5：检测报告表
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gccttttcct cctagcccac agctcagtta catctgagag 120
agacaagacc gagaaggagc
tgagggggcc cccggcttac cttctgctgt agtacccaga 180
acaacggcag cttcttcccc
nggccgggtc acgatgccct atttatagct gaggggtggg 240
gatggagctg ttcccaggct
cctgtgcaca ggctggagag gagggttaca tcacttggcc 300
agaccacagg ctggccagaa
ggacagatgc cagaagcgac actcacgctg ggacctcttc 360
caggaagtct tagtgatcga
tgcagagttt cactgctgaa cagagtgagc cggtgcaggg 420
tcgagttaca catttaccga 420
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acctttcaac aaaaatgagc acgctttcct accgcccctc 60
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ccaagaagcc tgcaccatgt tttgaggttg agtgacatgt 120
tcgaaacctg tccataaagt
aattttgtga aagaaggagc aagagaacat tcctctgcag 180
cacttcacta ccaaatgagc
nttagctact tttcagaatt gaaggagaaa atgcattatg 240
tggactgaac gacttttcta
aagctctgaa caaaagcttt tctttccttt tgcaacaaga 300
caaagcaaag ccacattttg
cattagacag atgacggctg ctcgaagaac aatgtcagaa 360
actcgatgaa tgtgttgatt
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cttttgtcct 430
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<223> 用于AGT rs5051 SNP序列扩增的正向引物。
<400> 6
tcctagccca cagctcagtt 20
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 用于AGT rs5051 SNP序列扩增的反向引物。
<400>7
tggtctggcc aagtgatgta 20
<210> 8
<211>13
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>带VIC荧光A型探针，与AGTR1rs5186 SNP位点结合。
<400>8
agcattagct act 13
<210>9
<211>13
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>带FAM荧光C型探针，与AGTR1rs5186 SNP位点结合。
<400>9
agccttagct act 13
<210>10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于AGTR1rs5186 SNP序列扩增的正向引物。
<400> 10
aagaagcctg caccatgttt 20
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 用于AGTR1rs5186 SNP序列扩增的反向引物。
<400>11
tgtggctttg ctttgtcttg 20
<210>12
<211>13
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>带VIC荧光A型探针，与AGTR1rs5186 SNP位点结合。
<400>12
tgagccccca gaa 13
<210>13
<211>13
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>带FAM荧光C型探针，与AGTR1rs5186 SNP位点结合。
<400>13
tgatccccca gaa 13
<210>14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于AGTR1rs5186 SNP序列扩增的正向引物。
<400> 14
tcagtggctg gtacatgagc 20
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 用于AGTR1rs5186 SNP序列扩增的反向引物。
<400>15
ttttggggat ggagtgagag 20
Claims (2)
1.一种低肾上腺素型肥胖基因体质评估方法，其特征在于，具体步骤为
步骤1：检测的样品类型与采样方法
用采样拭在口腔中分别左右两腮至少需要各上下刮40次以上，以保证采集到足量的细胞样本；
步骤2：基因组DNA的抽提方法
采用硅胶吸附法抽提每一个口腔上皮细胞样本的基因组DNA，时间为2小时－2.5小时，经电泳检测后，用肉眼可见清晰白色条带即可判断获得的DNA能进入下一步检测；
步骤3：荧光定量PCR反应
将每一个被测者样本分别放入3个反应孔，同时检测3个位点，即血管紧张素原基因（AGT）rs5051；血管紧张素Ⅱ 1型受体基因（AGTR1）rs5186；内皮型一氧化氮合成酶基因（NOS3）rs1799983，另外根据实验需要增设不含DNA模版的NTC空白对照孔；
每一个反应孔的基因分型可以根据下表的引物和探针设计，采用TaqMan®-MGB技术，进行检测试剂合成；
在每一个反应孔中加入试剂为荧光定量PCR反应体系，总体积为10µl，即浓度为20ng/µl 的DNA模板2µl 、1µl 10X荧光定量PCR反应缓冲液ABI Taqman ® MGB、0.1µl 25mM d NTP合成DNA的四种脱氧核苷酸底物、0.5µl 25mM MgCl2溶液、0.02µl（5units/µl）Taq DNA聚合酶、去离子水4.98µl、4个位点分别采用不同的正向引物（20µM，0.225µl）、反向引物（20µM，0.225µl）、VIC荧光探针（10µM，0.25µl）和FAM荧光探针（10µM，0.25µl）工具进行检测，引物探针如下：
1.血管紧张素原基因（AGT）rs5051
带VIC荧光A型探针 CCCaGGCCGGGTC
带FAM荧光G型探针 CCCgGGCCGGGTC
正向引物
TCCTAGCCCACAGCTCAGTT
反向引物
TGGTCTGGCCAAGTGATGTA
血管紧张素Ⅱ 1型受体基因（AGTR1）rs5186
带VIC荧光A型探针 AGCaTTAGCTACT
带FAM荧光C型探针 AGCcTTAGCTACT
正向引物
AAGAAGCCTGCACCATGTTT
反向引物
TGTGGCTTTGCTTTGTCTTG
内皮型一氧化氮合成酶基因（NOS3）rs1799983
带VIC荧光G型探针 TGAgCCCCCAGAA
带FAM荧光T型探针 TGAtCCCCCAGAA
正向引物
TCAGTGGCTGGTACATGAGC
反向引物
TTTTGGGGATGGAGTGAGAG
将反应孔和空白对照在PCR扩增仪上进行反应，先进行预热：50℃、2分钟，95℃、10分钟，然后再进行60个循环的95℃、30秒，60℃、1分钟、反应结束后取出后再放入荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，得到血管紧张素原基因（AGT）rs5051；血管紧张素Ⅱ 1型受体基因（AGTR1）rs5186；内皮型一氧化氮合成酶基因（NOS3）rs1799983三张图;
步骤4：SNP基因型分析
将荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号的3个图和一个NTC空白对照进行比较，每个位点理论上存在三种不同的信号，纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧光信号，分别代表该位点三种不同的基因型；
（1）、血管紧张素原基因（AGT）rs5051
在检测结果图中，坐标轴左下区域黑点为空白对照、坐标轴左上区域蓝点为AA基因型、坐标轴右上区域绿点为AG基因型、坐标轴右下区域红点为GG基因型;
（2）、血管紧张素Ⅱ 1型受体基因（AGTR1）rs5186
在检测结果图中，坐标轴左下区域黑点为空白对照、坐标轴左上区域蓝点为AA基因型、坐标轴右上区域绿点为AC基因型、坐标轴右下区域红点为CC基因型;
（3）、内皮型一氧化氮合成酶基因（NOS3）rs1799983
在检测结果图中，坐标轴左下区域黑点为空白对照、坐标轴左上区域蓝点为GG基因型、坐标轴中间区域绿点为GT基因型、坐标轴右下区域红点为TT基因型。
2.权利要求书1中的所述的三个基因的组合检测模式。
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101354344A (zh) * | 2007-07-27 | 2009-01-28 | 上海主健生物工程有限公司 | 遗传信息及健康评估管理 |
| CN101608219A (zh) * | 2008-06-20 | 2009-12-23 | 上海主健生物工程有限公司 | 高血压遗传检测试剂盒 |
| CN102373285A (zh) * | 2011-11-23 | 2012-03-14 | 解码（上海）生物医药科技有限公司 | 女性妊娠期高血压基因无创检测试剂盒 |
| CN202881284U (zh) * | 2012-09-28 | 2013-04-17 | 百岳特生物科技（上海）有限公司 | 肥胖基因检测芯片 |
| CN103074415A (zh) * | 2012-04-27 | 2013-05-01 | 上海金防生物科技有限公司 | 一种肥胖基因易感性和预警检测试剂盒 |
| CN103376325A (zh) * | 2012-04-25 | 2013-10-30 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 血管紧张素原蛋白前体作为肥胖型糖尿病标志物的应用 |
-
2013
- 2013-12-05 CN CN201310645961.3A patent/CN103602750A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101354344A (zh) * | 2007-07-27 | 2009-01-28 | 上海主健生物工程有限公司 | 遗传信息及健康评估管理 |
| CN101608219A (zh) * | 2008-06-20 | 2009-12-23 | 上海主健生物工程有限公司 | 高血压遗传检测试剂盒 |
| CN102373285A (zh) * | 2011-11-23 | 2012-03-14 | 解码（上海）生物医药科技有限公司 | 女性妊娠期高血压基因无创检测试剂盒 |
| CN103376325A (zh) * | 2012-04-25 | 2013-10-30 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 血管紧张素原蛋白前体作为肥胖型糖尿病标志物的应用 |
| CN103074415A (zh) * | 2012-04-27 | 2013-05-01 | 上海金防生物科技有限公司 | 一种肥胖基因易感性和预警检测试剂盒 |
| CN202881284U (zh) * | 2012-09-28 | 2013-04-17 | 百岳特生物科技（上海）有限公司 | 肥胖基因检测芯片 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 刘艳玲等: "体液因子在肥胖相关高血压发病中的应用", 《内蒙古医学院学报》, 31 December 2010 (2010-12-31) * |
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C05 | Deemed withdrawal (patent law before 1993) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
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