CN103667470A - 一种中枢神经型肥胖基因体质评估的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种中枢神经型肥胖基因体质评估方法，其特征在于，通过同时检测分析个体的MTHFR基因、TPH1基因、DBH基因SNPs位点基因携带型为所有的受检者提供中枢神经型肥胖体质评估，可以让受检者在考虑以饮食和运动方式进行瘦身之前，先了解自身基因体质情况，了解个人的肥胖潜能成因，选择最适合的个体化营养及运动瘦身方式，将各种肥胖基因表现的型态一一击破，达到最有效健康的减重效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种中枢神经型肥胖基因体质评估方法，可用于评估中枢神经型肥胖基因体质情况，针对性的提示受检者根据遗传体质选择不同的减肥策略，属于分子生物学技术领域。
背景技术
肥胖症是一种热量代谢障碍，摄入热量超过消耗的热量，引起体内脂肪积聚过多所致。一般认为超过按身高所测标准体重20%即可成为肥胖。肥胖症是一种与遗传因素及生活方式密切相关的慢性疾病，它会引发血脂升高，容易造成脂肪肝、动脉血管病变、心脏病、糖尿病，肥胖的儿童还会引发性功能发育不良并导致成人期各种疾病发病率和死亡率上升。因此，若通过有效的方法来预防，就能避免过早地出现高血压、冠心病、糖尿病、脑血管病等疾患，从而提高人们的生存质量。
由于至少有40%躯体脂肪量的差异是由遗传因素引起的，所以很容易明确遗传对肥胖有很大影响。遗传体质不同的人在患肥胖症时应采取不同的减肥策略，利用现代科学研究成果，开发一项基于分子遗传基础的体重管理分子检测产品会对减肥者的减肥计划提供基因减肥概念的个性化体重管理建议，具有较强的社会意义和市场前景。目前肥胖症的临床治疗方法主要是饮食和运动疗法，但存在着碳水化合物、脂肪以及蛋白质摄入量控制“一刀切” 和盲目采用减肥药物的非个体化治疗方式。原因主要在于无法明确地将患者区分成为不同的减重体质，从而对不同患者是否需要严格控制碳水化合物的摄入，是否需要控制脂肪的摄入，是否需要使用减肥药物，以及应该使用哪类减肥药物的治疗措施选择上没有明确指导。
中枢神经型肥胖可说是最难控制的一群。从轻微的为缓解压力去吃东西，到严重的暴食症都属于此类基因表现。焦虑，悲伤和愤怒都能导致压力荷尔蒙皮质醇的急剧上升。对于中枢神经型肥胖的人来说，产生神经传导素的基因过于不活跃了，大脑就会发出信号，让你大吃大喝以便获得足够的能激活神经传导素生产的营养，体重也因此增加了，同时压力荷尔蒙刺激了大吃大喝的基因，可能需要每天吃6餐来平衡血糖水平。
压力情境会点燃人们对富含碳水化合物的快餐的激情，这些食品能平静你的应激激素，应激激素还能增加脂肪储量。现代生活方式的改变，我们是坐在那里感受我们的压力，热量自然会堆积在我们的腹部，造成腹部甚至全身肥胖。具有此种类型临床表征的肥胖患者，大多是因为本身遗传基因或外在压力因素，引起中枢神经内分泌物质失调所造成，例如：Serotonin的分泌减少，因头部外伤所造成的饱食中枢功能丧失，或是因快速减重、过度节食而使得摄食中枢反跳型功能旺盛，亦或是一般女性在月经周期前所产生的经前症候群等。
中枢神经型肥胖基因变异者，着重脂肪分解燃烧，缩腹减腰，修饰大腿内外侧，此外除了经常运动外，您还要抽时间舒缓释放压力，进而放松紧绷的肌肉。戒掉吃零食的习惯或尽量选择低卡的零食。
研究发现MTHFR，TPH1，DBH基因与中枢神经型肥胖体质有关。
MTHFR为5，10-methylenetetrahydrofolate reductase (NADPH)（亚甲基四氢叶酸还原酶）蛋白编码基因，主要作用是在叶酸代谢通路中将5，10-亚甲基四氢叶酸转化为具有生物学功能的5-甲基四氢叶酸盐。5-甲基四氢叶酸盐可以进一步进入甲基传递通路，通过同型半胱氨酸的重新甲基化过程间接得为DNA甲基化和蛋白质甲基化提供甲基并且使血液中的同型半胱氨酸量保持在一个较低的水平。此外叶酸的中间代谢产物在核苷酸合成过程中也有重要的作用，通过单碳代谢为嘌呤环形成提供碳原子。MTHFR基因的缺陷可以导致多个机体必须生化途径的紊乱，包括细胞周期调控、DNA复制、DNA以及蛋白质甲基化修饰等，并进而引发神经管缺陷、癌症、心脑血管等多种疾病。该基因编码的蛋白是重要的同型半胱氨酸代谢酶，高浓度的同型半胱氨酸作用与神经细胞会引起一系列不良反应，因而该基因上的多态现象与个体抑郁等精神特质具有显著相关性。
色氨酸羟化酶(tryptophan hydroxylase1, TPH1)是5-HT合成的限速酶,催化色氨酸生成5-羟色氨酸。由444个氨基酸组成,它主要分布于大脑和肠嗜铬细胞。此酶特异性高,含量少,活性低,TPH1的生理活性和表达水平的正常与否影响着5-HT的合成量,增强或减弱5-HT及其代谢物的作用强度,进而影响它在中枢神经系统的功能。该基因编码的蛋白会影响脑组织5-羟色胺正常含量，而5-羟色胺对于机体的精神健康至关重要：其含量的下降意味着脑神经细胞之间的相互联系出现异常，而这在临床上早已被证实与抑郁症和其他精神性病变密切相关。该基因上的变异会导5-羟色胺合成及分泌的明显减少，因而与抑郁症具有显著相关性。
多巴胺β羟化酶(DBH)是多巴胺系统的一种代谢酶，催化多巴胺脱羧生成去甲肾上腺素（NE），是NE生物合成的限速酶。已有研究显示，DBH基因多态性被证明与血浆中多巴胺β羟化酶的活性显著相关。该基因编码的酶在人体内起到将多巴胺转化为去甲肾上腺素的作用。研究证实该基因上的多态现象与抑郁具有显著相关性。
目前的基础研究已能从理论上证明基因分型检测可以用于判断肥胖体质的类型，而且检测方法简便、检测成本在可接受程度中、检测结果可信。因此，基因分型检测用于评估肥胖体质的可行性是明确的。根据基因检测结果结合体重管理测评系统建立个性化体重健康评估报告，有针对的解决体重控制问题，提高人们生活质量。因此利用现有科学、技术研究成果来开发这样一个产品，时机是成熟的。
本发明的目的是提供一种中枢神经型肥胖基因体质评估方法，可以让受检者在考虑以饮食和运动方式进行瘦身之前，先了解自身基因体质情况，了解个人的肥胖潜能成因，选择最适合的个体化营养及运动瘦身方式，将各种肥胖基因表现的型态一一击破，达到最有效健康的减重效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种中枢神经型肥胖基因体质评估方法，可以让受检者在考虑以饮食和运动方式进行瘦身之前，先了解自身基因体质情况，了解个人的肥胖潜能成因，选择最适合的个体化营养及运动瘦身方式，将各种肥胖基因表现的型态一一击破，达到最有效健康的减重效果。
为实现以上目的，本发明提供一种中枢神经型肥胖基因体质评估方法。其具体步骤为：
步骤1：检测的样品类型与采样方法
用采样拭在口腔中分别左右两腮至少需要各上下刮40次以上，以保证采集到足量的细胞样本；
步骤2：基因组DNA的抽提方法
采用硅胶吸附法抽提每一个口腔上皮细胞样本的基因组DNA，时间为2小时－2.5小时，经电泳检测后，用肉眼可见清晰白色条带即可判断获得的DNA能进入下一步检测；
步骤3：荧光定量PCR反应
将每一个被测者样本分别放入3个反应孔，同时检测3个位点，即亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）rs1801133；色氨酸羟化酶（TPH1）rs1800532；多巴胺β羟化酶（DBH）rs1108580，另外根据实验需要增设不含DNA模版的NTC空白对照孔；
每一个反应孔的基因分型可以根据下表的引物和探针设计，采用TaqMan?-MGB技术，进行检测试剂合成；
在每一个反应孔中加入试剂为荧光定量PCR反应体系，总体积为10μl，即浓度为20ng/μl 的DNA模板2μl 、1μl 10X荧光定量PCR反应缓冲液ABI Taqman ? MGB、0.1μl 25mM d NTP合成DNA的四种脱氧核苷酸底物、0.5μl 25mM MgCl2溶液、0.02μl（5units/μl）Taq DNA聚合酶、去离子水4.98μl、3个位点分别采用不同的正向引物（20μM，0.225μl）、反向引物（20μM，0.225μl）、VIC荧光探针（10μM，0.25μl）和FAM荧光探针（10μM，0.25μl）工具进行检测，基因序列及其引物探针如下；
亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）rs1801133
ttcagtgtta cattaaaaac aatgtttaat ccggtgccta gagaaaagtc aagcttacta
ccccagatgc tgcccagcca gtgctaactg tagcattttc tcttttctat ggccaccaag
tgcaggcctg atttgcttgg ctgctcaagg caggacagtg tgggagtttg gagcaatcca
cccccactct tggaactggg ctctgagcca cctcccctga gagtcatctc tggggtcaga
agcatatcag tcatgagccc agccactcac tgttttagtt caggctgtgc tgtgctgttg
gaaggtgcaa gatcagagcc cccaaagcag aggactctct ctgcccagtc cctgtggtct
cttcatccct cgccttgaac aggtggaggc cagcctctcc tgactgtcat ccctattggc
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ggagaaggtg tctgcgggag ncgatttcat catcacgcag cttttctttg aggctgacac
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gatctttccc atccaggtga gggcccagga gagcccataa gctccctcca ccccactctc
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tcccagatct cctctcaggt ccagaacttg cacagcgttg cttggccacc ccattttggt
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ccaggtccca cccctggagg ttctcactca gtaaatctga
带VIC荧光A型探针 GAGaCGATTTCAT
带FAM荧光G型探针 GAGgCGATTTCAT
正向引物 GCCTCTCCTGACTGTCATCC
反向引物 TCACAAAGCGGAAGAATGTG
色氨酸羟化酶（TPH1）rs1800532
agttcccctt aatatgcata tgataaatta tagtttccat gccttccatc aacgtgttac
ttggtgccac tagcagaact aaaatgctgc agtcaggggt ctattctggt aaagattttc
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aattgacaac ctattaggtg ntagctgcta ttctgagcat agggaatgta acactgaaaa
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tatcacccga tcattagaat aaaatattgg atttcgattt
带VIC荧光A型探针 GTGaTAGCTGCTA
带FAM荧光C型探针 GTGcTAGCTGCTA
正向引物 TTTGGTGTGCGAGGATTAAA
反向引物 TTTCCCCCACTGGAATACAA
多巴胺β羟化酶（DBH）rs1108580
agcctcaggc atcttcttaa gaagctcagt gtcccgcccg ccaggcccgg gaatgcccat
ggctaacaga acctgtgacc tgctggcaag tgacagccct ggttcctggc tgcagaggag
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ggagatggga actagatgat ctgtatggcc tgaccaactc
带VIC荧光A型探针 TAGaGTAAGGGGT
带FAM荧光G型探针 TAGgGTAAGGGGT
正向引物 AGTGACCAGAAGGGGCAGAT
反向引物 CCCCAGACTTATCAGGGACA
将反应孔和空白对照在PCR扩增仪上进行反应，先进行预热：50℃、2分钟，95℃、10分钟，然后再进行60个循环的95℃、30秒，60℃、1分钟、反应结束后取出后再放入荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，得到亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）rs1801133；色氨酸羟化酶（TPH1）rs1800532；多巴胺β羟化酶（DBH）rs1108580三张图。
步骤4：SNP基因型分析
将荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号的3个图和一个NTC空白对照进行比较，每个位点理论上存在三种不同的信号，纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧光信号，分别代表该位点三种不同的基因型；
（1）、亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）rs1801133
在检测结果图中，坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为AA基因型、坐标轴右上区域为AG基因型、坐标轴右下区域为GG基因型，
（2）、色氨酸羟化酶（TPH1）rs1800532
在检测结果图中，坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为AA基因型、坐标轴右上区域为AC基因型、坐标轴右下区域为CC基因型，
（3）、多巴胺β羟化酶（DBH）rs1108580
在检测结果图中，坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为AA基因型、坐标轴中间区域为AG基因型、坐标轴右下区域为GG基因型，
本发明3个位点的基因分型可以采用TaqMan?-MGB技术对这些位点进行基因分型。经重复实验验证，基因分型的准确率达到了99％以上，重复性达到了100％。除此之外，基因测序等技术也可以作为备选的基因分型手段。
本发明的优点是：检测准确率高，可重复性强。
附图说明
图1为亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）rs1801133示意图；
图2为色氨酸羟化酶（TPH1）rs1800532示意图；
图3为多巴胺β羟化酶（DBH）rs11085803示意图；
具体实施方式
本发明的目的是提供一种中枢神经型肥胖基因体质评估方法，可以让受检者在考虑以饮食和运动方式进行瘦身之前，先了解自身基因体质情况，了解个人的肥胖潜能成因，选择最适合的个体化营养及运动瘦身方式，将各种肥胖基因表现的型态一一击破，达到最有效健康的减重效果。
为实现以上目的，本发明提供一种中枢神经型肥胖基因体质评估方法。其具体步骤为：
步骤1：检测的样品类型与采样方法
用采样拭在口腔中分别左右两腮至少需要各上下刮40次以上，以保证采集到足量的细胞样本；
步骤2：基因组DNA的抽提方法
采用硅胶吸附法抽提每一个口腔上皮细胞样本的基因组DNA，时间为2小时－2.5小时，经电泳检测后，用肉眼可见清晰白色条带即可判断获得的DNA能进入下一步检测；
步骤3：荧光定量PCR反应
将每一个被测者样本分别放入3个反应孔，同时检测3个位点，即亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）rs1801133；色氨酸羟化酶（TPH1）rs1800532；多巴胺β羟化酶（DBH）rs1108580，另外根据实验需要增设不含DNA模版的NTC空白对照孔；
每一个反应孔的基因分型可以根据下表的引物和探针设计，采用TaqMan?-MGB技术，进行检测试剂合成；
在每一个反应孔中加入试剂为荧光定量PCR反应体系，总体积为10μl，即浓度为20ng/μl 的DNA模板2μl 、1μl 10X荧光定量PCR反应缓冲液ABI Taqman ? MGB、0.1μl 25mM d NTP合成DNA的四种脱氧核苷酸底物、0.5μl 25mM MgCl2溶液、0.02μl（5units/μl）Taq DNA聚合酶、去离子水4.98μl、3个位点分别采用不同的正向引物（20μM，0.225μl）、反向引物（20μM，0.225μl）、VIC荧光探针（10μM，0.25μl）和FAM荧光探针（10μM，0.25μl）工具进行检测，基因序列及其引物探针如下；
亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）rs1801133
ttcagtgtta cattaaaaac aatgtttaat ccggtgccta gagaaaagtc aagcttacta
ccccagatgc tgcccagcca gtgctaactg tagcattttc tcttttctat ggccaccaag
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带VIC荧光A型探针 GAGaCGATTTCAT
带FAM荧光G型探针 GAGgCGATTTCAT
正向引物 GCCTCTCCTGACTGTCATCC
反向引物 TCACAAAGCGGAAGAATGTG
色氨酸羟化酶（TPH1）rs1800532
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带VIC荧光A型探针 GTGaTAGCTGCTA
带FAM荧光C型探针 GTGcTAGCTGCTA
正向引物 TTTGGTGTGCGAGGATTAAA
反向引物 TTTCCCCCACTGGAATACAA
多巴胺β羟化酶（DBH）rs1108580
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带FAM荧光G型探针 TAGgGTAAGGGGT
正向引物 AGTGACCAGAAGGGGCAGAT
反向引物 CCCCAGACTTATCAGGGACA
将反应孔和空白对照在PCR扩增仪上进行反应，先进行预热：50℃、2分钟，95℃、10分钟，然后再进行60个循环的95℃、30秒，60℃、1分钟、反应结束后取出后再放入荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，得到亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）rs1801133；色氨酸羟化酶（TPH1）rs1800532；多巴胺β羟化酶（DBH）rs1108580三张图。
步骤4：SNP基因型分析
将荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号的3个图和一个NTC空白对照进行比较，每个位点理论上存在三种不同的信号，纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧光信号，分别代表该位点三种不同的基因型；
（1）、亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）rs1801133
在检测结果图中，坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为AA基因型、坐标轴右上区域为AG基因型、坐标轴右下区域为GG基因型，
（2）、色氨酸羟化酶（TPH1）rs1800532
在检测结果图中，坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为AA基因型、坐标轴右上区域为AC基因型、坐标轴右下区域为CC基因型，
（3）、多巴胺β羟化酶（DBH）rs1108580
在检测结果图中，坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为AA基因型、坐标轴中间区域为AG基因型、坐标轴右下区域为GG基因型，
步骤5：检测报告表
<110> 上海中优医药高科技有限公司
<120>一种中枢神经型肥胖基因体质评估的方法
<160>15
<210> 1
<211> 1000
<212> DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221> mutation
<222> (501)
<223> n =a或g
<400> 1
ttcagtgtta cattaaaaac aatgtttaat ccggtgccta gagaaaagtc aagcttacta 60
ccccagatgc tgcccagcca gtgctaactg tagcattttc tcttttctat ggccaccaag 120
tgcaggcctg atttgcttgg ctgctcaagg caggacagtg tgggagtttg gagcaatcca 180
cccccactct tggaactggg ctctgagcca cctcccctga gagtcatctc tggggtcaga 240
agcatatcag tcatgagccc agccactcac tgttttagtt caggctgtgc tgtgctgttg 300
gaaggtgcaa gatcagagcc cccaaagcag aggactctct ctgcccagtc cctgtggtct 360
cttcatccct cgccttgaac aggtggaggc cagcctctcc tgactgtcat ccctattggc 420
aggttacccc aaaggccacc ccgaagcagg gagctttgag gctgacctga agcacttgaa 480
ggagaaggtg tctgcgggag ncgatttcat catcacgcag cttttctttg aggctgacac 540
attcttccgc tttgtgaagg catgcaccga catgggcatc acttgcccca tcgtccccgg 600
gatctttccc atccaggtga gggcccagga gagcccataa gctccctcca ccccactctc 660
accgcaccgt cctcgcacag gctgggggct ctgggtggag tgctgagttc gctgagttct 720
tcccagatct cctctcaggt ccagaacttg cacagcgttg cttggccacc ccattttggt 780
tacctctaat tttcccccca aaacccagca acagtgtctg ttgaggggtt tgttgtactt 840
tggccaacaa gcatcaccaa aagggattct aattctcatt acaaatcctg cttaaatcag 900
tgtttcccaa aggtggctgt catcagaacc acttgataag ctttttcaaa aagtggatct 960
ccaggtccca cccctggagg ttctcactca gtaaatctga 1000
<210> 2
<211> 1000
<212> DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221> mutation
<222> (501)
<223> n =a或c
<400> 2
agttcccctt aatatgcata tgataaatta tagtttccat gccttccatc aacgtgttac 60
ttggtgccac tagcagaact aaaatgctgc agtcaggggt ctattctggt aaagattttc 120
tttgttttct cctttgcttt gcagagcgta caggtttttc catccgtcct gtggctggtt 180
acttatcacc aagagatttc ttatcaggtt tagcctttcg agtttttcac tgcactcaat 240
atgtgagaca cagttcagat cccttctata ccccagagcc gtaagtactt ctatttcagc 300
caggaattca tcaaatggtt atttataata atggcatcta ccttatgggt tctttttttt 360
tttttttttt ttttttggtg tgcgaggatt aaataaatta gcacatgtga agcatttaga 420
atggtacctg gcatgaaata catgttccat gctctatatg tgttagccat tatgattatt 480
aattgacaac ctattaggtg ntagctgcta ttctgagcat agggaatgta acactgaaaa 540
aatcagacac aaatttctgc ctgcataaag cttgtattcc agtgggggaa acagataata 600
aacaaacaag taaatgtatg caaatgttgc atcgagtggt gttgagtccc atggagaaaa 660
ataaagctga gaaaggggga tggaggaaag tgtaggtggg tgggagtgtg tgtgtgtgtt 720
gctgttttga aaagggtgat cagggaaggc cttgctgaga aggtgatatc tgagcagaga 780
tctgatttgg gtgtgtatgt ggtggggttg ggtgttgggg gttgtggttt tgggagtggc 840
atgtggatgt ccataggtat ctgatgtgca cttatatgtg tgagtctgag tggccaaggt 900
tttgaaccaa aattgtttctttatttgatt agtgtccttt gtgatccatt actaaagtat 960
tatcacccga tcattagaat aaaatattgg atttcgattt 1000
<210>3
<211> 1000
<212> DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221> mutation
<222> (501)
<223> n =a或g
<400> 3
agcctcaggc atcttcttaa gaagctcagt gtcccgcccg ccaggcccgg gaatgcccat 60
ggctaacaga acctgtgacc tgctggcaag tgacagccct ggttcctggc tgcagaggag 120
gaaccaactc cactgtcggg gctcatctcc actgtctcca ggcagaaatg gagatagaag 180
gtgtgagtga agccacagcc ccaggcagaa ccctcagatc cacagggact gaggcccagc 240
atccccagat cagctggcaa tgaatgcgga gctctgccgg ggaatgccct cttcccctgt 300
ggattggccc ggcttggctc cttcatgcct ggagcccagt gcttgtctct gcaggacgcc 360
tggagtgacc agaaggggca gatccacctg gatccccagc aggactacca gctgctgcag 420
gtgcagagga ccccagaagg cctgaccctg cttttcaaga ggccctttgg cacctgcgac 480
cccaaggatt acctcattga ngtaaggggt ggccgcgagt acccaggagg gcgtgggctg 540
cgtgtatcat gctgccatcc tgtgccaatg tcatagtacc tttcctgtcc ctgataagtc 600
tggggcctgg gcctggccag ctatgacaga gagaaagcca aggaggatgg ccagaggcag 660
tggtggggcc aaagcactta gatggtccag ctctgctatt gcccctgagc cctcaaagac 720
gcagctcttt gccaacacgt agctgacatg gtttctagat gcggggcttg tgctgaagcc 780
tctcccattg gactagacct tgcttctgga tgtctctctc ctcctggtcc tgttaaccat 840
caggtgggat tctggagccc aggcgacctg gctttccatc ccggccctgt tgccagctcg 900
ctgtgaggct cgggacaact gcccccctcc tctggacctc actttgccca tctgtaaaat 960
ggagatggga actagatgat ctgtatggcc tgaccaactc 1000
<210> 4
<211>13
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>带VIC荧光A型探针，与MTHFR rs1801133 SNP位点结合。
<400>4
gagacgattt cat 13
<210>5
<211>13
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>带FAM荧光G型探针，与MTHFR rs1801133 SNP位点结合。
<400>5
gaggcgattt cat 13
<210>6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于MTHFR rs1801133 SNP序列扩增的正向引物。
<400> 6
gcctctcctg actgtcatcc 20
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 用于MTHFR rs1801133 SNP序列扩增的反向引物。
<400>7
tcacaaagcg gaagaatgtg 20
<210> 8
<211>13
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>带VIC荧光A型探针，与TPH1 rs1800532 SNP位点结合。
<400>8
gtgatagctg cta 13
<210>9
<211>13
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>带FAM荧光C型探针，与TPH1 rs1800532 SNP位点结合。
<400>9
gtgctagctg cta 13
<210>10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于TPH1 rs1800532 SNP序列扩增的正向引物。
<400> 10
tttggtgtgc gaggattaaa 20
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 用于TPH1 rs1800532 SNP序列扩增的反向引物。
<400>11
tttcccccac tggaatacaa 20
<210> 12
<211>13
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>带VIC荧光A型探针，与DBH rs1108580 SNP位点结合。
<400>12
tagagtaagg ggt 13
<210>13
<211>13
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>带FAM荧光G型探针，与DBH rs1108580 SNP位点结合。
<400>13
tagggtaagg ggt 13
<210>14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于DBH rs1108580 SNP序列扩增的正向引物。
<400> 14
agtgaccaga aggggcagat 20
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 用于DBH rs1108580 SNP序列扩增的反向引物。
<400>15
ccccagactt atcagggaca 20
Claims (2)
1.一种中枢神经型肥胖基因体质评估方法，其特征在于，具体步骤为：
步骤1：检测的样品类型与采样方法
用采样拭在口腔中分别左右两腮至少需要各上下刮40次以上，以保证采集到足量的细胞样本；
步骤2：基因组DNA的抽提方法
采用硅胶吸附法抽提每一个口腔上皮细胞样本的基因组DNA，时间为2小时－2.5小时，经电泳检测后，用肉眼可见清晰白色条带即可判断获得的DNA能进入下一步检测；
步骤3：荧光定量PCR反应
将每一个被测者样本分别放入3个反应孔，同时检测3个位点，即亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）rs1801133；色氨酸羟化酶（TPH1）rs1800532；多巴胺β羟化酶（DBH）rs1108580，另外根据实验需要增设不含DNA模版的NTC空白对照孔；
每一个反应孔的基因分型可以根据下表的引物和探针设计，采用TaqMan?-MGB技术，进行检测试剂合成；
在每一个反应孔中加入试剂为荧光定量PCR反应体系，总体积为10μl，即浓度为20ng/μl 的DNA模板2μl 、1μl 10X荧光定量PCR反应缓冲液ABI Taqman ? MGB、0.1μl 25mM d NTP合成DNA的四种脱氧核苷酸底物、0.5μl 25mM MgCl2溶液、0.02μl（5units/μl）Taq DNA聚合酶、去离子水4.98μl、3个位点分别采用不同的正向引物（20μM，0.225μl）、反向引物（20μM，0.225μl）、VIC荧光探针（10μM，0.25μl）和FAM荧光探针（10μM，0.25μl）工具进行检测，其引物探针如下；
亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）rs1801133
带VIC荧光A型探针 GAGaCGATTTCAT
带FAM荧光G型探针 GAGgCGATTTCAT
正向引物 GCCTCTCCTGACTGTCATCC
反向引物 TCACAAAGCGGAAGAATGTG
色氨酸羟化酶（TPH1）rs1800532
带VIC荧光A型探针 GTGaTAGCTGCTA
带FAM荧光C型探针 GTGcTAGCTGCTA
正向引物 TTTGGTGTGCGAGGATTAAA
反向引物 TTTCCCCCACTGGAATACAA
多巴胺β羟化酶（DBH）rs1108580
带VIC荧光A型探针 TAGaGTAAGGGGT
带FAM荧光G型探针 TAGgGTAAGGGGT
正向引物 AGTGACCAGAAGGGGCAGAT
反向引物 CCCCAGACTTATCAGGGACA
将反应孔和空白对照在PCR扩增仪上进行反应，先进行预热：50℃、2分钟，95℃、10分钟，然后再进行60个循环的95℃、30秒，60℃、1分钟、反应结束后取出后再放入荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，得到亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）rs1801133；色氨酸羟化酶（TPH1）rs1800532；多巴胺β羟化酶（DBH）rs1108580三张图；
步骤4：SNP基因型分析
将荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号的3个图和一个NTC空白对照进行比较，每个位点理论上存在三种不同的信号，纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧光信号，分别代表该位点三种不同的基因型；
（1）、亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）rs1801133
在检测结果图中，坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为AA基因型、坐标轴右上区域为AG基因型、坐标轴右下区域为GG基因型，
（2）、色氨酸羟化酶（TPH1）rs1800532
在检测结果图中，坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为AA基因型、坐标轴右上区域为AC基因型、坐标轴右下区域为CC基因型，
（3）、多巴胺β羟化酶（DBH）rs1108580
在检测结果图中，坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为AA基因型、坐标轴中间区域为AG基因型、坐标轴右下区域为GG基因型。
2.权利要求书1中的所述的亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）rs1801133、色氨酸羟化酶（TPH1）rs1800532、多巴胺β羟化酶（DBH）rs1108580基因的组合检测方法。
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|---|---|---|---|
| CN201310638458.5A CN103667470A (zh) | 2013-12-03 | 2013-12-03 | 一种中枢神经型肥胖基因体质评估的方法 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310638458.5A CN103667470A (zh) | 2013-12-03 | 2013-12-03 | 一种中枢神经型肥胖基因体质评估的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103667470A true CN103667470A (zh) | 2014-03-26 |
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| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103667470A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105154552A (zh) * | 2015-09-21 | 2015-12-16 | 上海中优生物高科技有限责任公司 | 中枢神经型肥胖基因个体化干预饮品的制备方法及其系统 |
| CN105400896A (zh) * | 2015-12-26 | 2016-03-16 | 上海中优生物高科技有限责任公司 | 中枢神经型肥胖基因个体化干预组合物制备方法及其系统 |
| CN109554465A (zh) * | 2018-12-30 | 2019-04-02 | 济南齐鲁医学检验有限公司 | 无创rs1801133基因型快速分型检测试剂盒 |
-
2013
- 2013-12-03 CN CN201310638458.5A patent/CN103667470A/zh active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CN109554465A (zh) * | 2018-12-30 | 2019-04-02 | 济南齐鲁医学检验有限公司 | 无创rs1801133基因型快速分型检测试剂盒 |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
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