CN103667456A - 一种荷尔蒙失衡型肥胖基因体质评估的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种荷尔蒙失衡型肥胖基因体质评估的方法，其特征在于，通过同时检测分析个体的COMT基因、ESR2基因、SHBG基因SNPs位点基因携带型为所有的受检者提供荷尔蒙失衡型肥胖体质评估，可以让受检者在考虑以饮食和运动方式进行瘦身之前，先了解自身基因体质情况，了解个人的肥胖潜能成因，选择最适合的个体化营养及运动瘦身方式，将各种肥胖基因表现的型态一一击破，达到最有效健康的减重效果。

Description

一种荷尔蒙失衡型肥胖基因体质评估的方法
技术领域
本发明涉及一种荷尔蒙失衡型肥胖基因体质评估方法，可用于评估荷尔蒙失衡型肥胖基因体质情况，针对性的提示受检者根据遗传体质选择不同的减肥策略，属于分子生物学技术领域。 
背景技术
肥胖症是一种热量代谢障碍，摄入热量超过消耗的热量，引起体内脂肪积聚过多所致。一般认为超过按身高所测标准体重20%即可成为肥胖。肥胖症是一种与遗传因素及生活方式密切相关的慢性疾病，它会引发血脂升高，容易造成脂肪肝、动脉血管病变、心脏病、糖尿病，肥胖的儿童还会引发性功能发育不良并导致成人期各种疾病发病率和死亡率上升。因此，若通过有效的方法来预防，就能避免过早地出现高血压、冠心病、糖尿病、脑血管病等疾患，从而提高人们的生存质量。 
由于至少有40%躯体脂肪量的差异是由遗传因素引起的，所以很容易明确遗传对肥胖有很大影响。遗传体质不同的人在患肥胖症时应采取不同的减肥策略，利用现代科学研究成果，开发一项基于分子遗传基础的体重管理分子检测产品会对减肥者的减肥计划提供基因减肥概念的个性化体重管理建议，具有较强的社会意义和市场前景。目前肥胖症的临床治疗方法主要是饮食和运动疗法，但存在着碳水化合物、脂肪以及蛋白质摄入量控制“一刀切”和盲目采用减肥药物的非个体化治疗方式。原因主要在于无法明确地将患者区分成为不同的减重体质，从而对不同患者是否需要严格控制碳水化合物的摄入，是否需要控制脂肪的摄入，是否需要使用减肥药物，以及应该使用哪类减肥药物的治疗措施选择上没有明确指导。 
荷尔蒙就是平常所说的“激素”，是人体内分泌系统分泌的能调节生理平衡的激素的总称。在所有的荷尔蒙当中，对于女性影响最大的就是女性荷尔蒙。卵巢分泌的雌性激素及黄体素统称女性荷尔蒙（尤其是黄体素最为重要），它是孕育新生命及维持母体健康不可缺少的一种荷尔蒙。每个月中，所有女人都会经历荷尔蒙的波动，但对于荷尔蒙型的女性来说，这种波动可能会抑制胃口，提升情绪的基因。这就可能导致你情绪化，浮肿，饥饿，甚至于每天可能摄入超过600卡路里的热量。 
研究发现，荷尔蒙失衡型肥胖相关基因变异导致女性出现皮肤暗淡、月经不调、闭经甚至生育障碍、更年期症状、骨质疏松、功能性子宫出血、乳腺增生等。当雌激素和黄体酮水平趋于慢性失调，那么控制胃口的荷尔蒙，例如复合胺的功能也会受到影响，伴随而来的就是体重的增加。 
研究发现COMT，ESR2，SHBG基因与荷尔蒙失衡型肥胖体质有关。 
COMT (Catechol-O-methyltransferase)编码儿茶酚-氧位-甲基转移酶，是重要的儿茶酚胺代谢的主要酶类。儿茶酚-o-甲基转移酶（COMT）是儿茶酚胺的主要降解酶，COMT 是一种在人体内广泛存在的酶，在镁离子存在的条件下催化儿茶酚胺第3位羟基甲基化，而儿茶酚胺被认为在心境障碍的发病机制中有着重要作用。个体基因的突变和心理因素决定了其对精神分裂症的易感程度。COMT能将儿茶酚胺转化为其他物质，当代谢途径受阻时就会聚集，因而影响个体对精神分裂症的易感程度。分子生物学研究表明，COMT158号氨基酸由Val转化为Met，酶的活性将低了大约3~4倍，导致心智障碍相关疾病的发生。国内外研究表明COMT Val158Met等位基因与精神分裂症相关，中国人群的关联分析显示，该位点的多态现象与心智障碍相关疾病的发生相关。儿茶酚胺类递质甲基化能力下降，造成雌激素代谢产物因分解受阻而累积，引起DNA损伤。 
雌激素属类固醇激素，通过细胞内受体发挥作用。雌激素受体是一种核内受体，与其它类固醇激素受体一样，雌激素受体也有雌激素结合域和DNA结合域，雌激素与其受体结合后形成二倍体,经过与包括热休克蛋白等多种核内蛋白质的相互作用，与DNA分子上特定的部位-雌激素应答元件(estrogen responsive element) 结合，使近端基因在转录水平上活化产生基因产物。ESR2雌激素受体是一类有配体激活的核转录因子，介导大部分的雌激素反应。雌激素受体发生变异，影响雌激素生物活性正常发挥，导致细胞增殖、分化异常。 
性激素结合球蛋白（Sex hormone-bindingglobulin,SHBG）基因编码区位于第17 对染色体的短臂(p12-13),由8个外显子和7个内含子组成,长约3kb。性激素结合球蛋白相关的基因存在变异。性激素结合球蛋白调节循环中性激素的生物利用度并控制乳腺组织的信号系统，性激素结合球蛋白基因变异可升高血液性激素结合球蛋白水平异常。血清中的SHBG主要是接管类固醇的运送和减少、调节雄性素的影响。SHBG血清浓度减少会伴随着雄性素升高或是雄性素对其目标器官影响过度的情形。 
目前的基础研究已能从理论上证明基因分型检测可以用于判断肥胖体质的类型，而且检测方法简便、检测成本在可接受程度中、检测结果可信。因此，基因分型检测用于评估肥胖体质的可行性是明确的。根据基因检测结果结合体重管理测评系统建立个性化体重健康评估报告，有针对的解决体重控制问题，提高人们生活质量。因此利用现有科学、技术研究成果来开发这样一个产品，时机是成熟的。 
本发明的目的是提供一种荷尔蒙失衡型肥胖基因体质评估方法，可以让受检者在考虑以饮食和运动方式进行瘦身之前，先了解自身基因体质情况，了解个人的肥胖潜能成因，选择最适合的个体化营养及运动瘦身方式，将各种肥胖基因表现的型态一一击破，达到最有效健康的减重效果。 
发明内容
本发明的目的是提供一种荷尔蒙失衡型肥胖基因体质评估方法，可以让受检者在考虑以饮食和运动方式进行瘦身之前，先了解自身基因体质情况，了解个人的肥胖潜能成因，选择最适合的个体化营养及运动瘦身方式，将各种肥胖基因表现的型态一一击破，达到最有效健康的减重效果。 
为实现以上目的，本发明提供一种荷尔蒙失衡型肥胖基因体质评估方法。其具体步骤为： 
步骤1：检测的样品类型与采样方法
用采样拭在口腔中分别左右两腮至少需要各上下刮40次以上，以保证采集到足量的细胞样本；
步骤2：基因组DNA的抽提方法
采用硅胶吸附法抽提每一个口腔上皮细胞样本的基因组DNA，时间为2小时－2.5小时，经电泳检测后，用肉眼可见清晰白色条带即可判断获得的DNA能进入下一步检测；
步骤3：荧光定量PCR反应
将每一个被测者样本分别放入3个反应孔，同时检测3个位点，即儿茶酚-氧位-甲基转移酶（COMT）rs4680，雌激素受体基因(ESR2) rs1256054，性激素结合球蛋白(SHBG) rs6259，另外根据实验需要增设不含DNA模版的NTC空白对照孔；
每一个反应孔的基因分型可以根据下表的引物和探针设计，采用TaqMan?-MGB技术，进行检测试剂合成；
在每一个反应孔中加入试剂为荧光定量PCR反应体系，总体积为10μl，即浓度为20ng/μl 的DNA模板2μl 、1μl 10X荧光定量PCR反应缓冲液ABI Taqman ? MGB、0.1μl 25mM d NTP合成DNA的四种脱氧核苷酸底物、0.5μl 25mM MgCl2溶液、0.02μl（5units/μl）Taq DNA聚合酶、去离子水4.98μl、3个位点分别采用不同的正向引物（20μM，0.225μl）、反向引物（20μM，0.225μl）、VIC荧光探针（10μM，0.25μl）和FAM荧光探针（10μM，0.25μl）工具进行检测（详见下表）；
Figure 122398DEST_PATH_IMAGE001
将反应孔和空白对照在PCR扩增仪上进行反应，先进行预热：50℃、2分钟，95℃、10分钟，然后再进行60个循环的95℃、30秒，60℃、1分钟、反应结束后取出后再放入荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，得到儿茶酚-氧位-甲基转移酶（COMT）rs4680，雌激素受体基因(ESR2) rs1256054，性激素结合球蛋白(SHBG) rs6259三张图。
步骤4：SNP基因型分析 
将荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号的3个图和一个NTC空白对照进行比较，每个位点理论上存在三种不同的信号，纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧光信号，分别代表该位点三种不同的基因型；
（1）、儿茶酚-氧位-甲基转移酶（COMT）rs4680
在检测结果图中，坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为GG基因型、坐标轴右上区域为AG基因型、坐标轴右下区域为AA基因型， 
（2）、雌激素受体基因(ESR2) rs1256054
在检测结果图中，坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为CC基因型、坐标轴右上区域为GC基因型、坐标轴右下区域为GG基因型， 
（3）、性激素结合球蛋白(SHBG) rs6259
在检测结果图中，坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为AA基因型、坐标轴中间区域为AG基因型、坐标轴右下区域为GG基因型， 
本发明3个位点的基因分型可以采用TaqMan?-MGB技术对这些位点进行基因分型。经重复实验验证，基因分型的准确率达到了99％以上，重复性达到了100％。除此之外，基因测序等技术也可以作为备选的基因分型手段。
本发明的优点是：检测准确率高，可重复性强。 
附图说明
图1为儿茶酚-氧位-甲基转移酶（COMT）rs4680示意图；
图2为雌激素受体基因(ESR2) rs1256054示意图；
图3为性激素结合球蛋白(SHBG) rs6259示意图。
具体实施方式
本发明的目的是提供一种荷尔蒙失衡型肥胖基因体质评估方法，可以让受检者在考虑以饮食和运动方式进行瘦身之前，先了解自身基因体质情况，了解个人的肥胖潜能成因，选择最适合的个体化营养及运动瘦身方式，将各种肥胖基因表现的型态一一击破，达到最有效健康的减重效果。 
为实现以上目的，本发明提供一种荷尔蒙失衡型肥胖基因体质评估方法。其具体步骤为： 
步骤1：检测的样品类型与采样方法
用采样拭在口腔中分别左右两腮至少需要各上下刮40次以上，以保证采集到足量的细胞样本；
步骤2：基因组DNA的抽提方法
采用硅胶吸附法抽提每一个口腔上皮细胞样本的基因组DNA，时间为2小时－2.5小时，经电泳检测后，用肉眼可见清晰白色条带即可判断获得的DNA能进入下一步检测；
步骤3：荧光定量PCR反应
将每一个被测者样本分别放入3个反应孔，同时检测3个位点，即儿茶酚-氧位-甲基转移酶（COMT）rs4680，雌激素受体基因(ESR2) rs1256054，性激素结合球蛋白(SHBG) rs6259，另外根据实验需要增设不含DNA模版的NTC空白对照孔；
每一个反应孔的基因分型可以根据下表的引物和探针设计，采用TaqMan?-MGB技术，进行检测试剂合成；
在每一个反应孔中加入试剂为荧光定量PCR反应体系，总体积为10μl，即浓度为20ng/μl 的DNA模板2μl 、1μl 10X荧光定量PCR反应缓冲液ABI Taqman ? MGB、0.1μl 25mM d NTP合成DNA的四种脱氧核苷酸底物、0.5μl 25mM MgCl2溶液、0.02μl（5units/μl）Taq DNA聚合酶、去离子水4.98μl、3个位点分别采用不同的正向引物（20μM，0.225μl）、反向引物（20μM，0.225μl）、VIC荧光探针（10μM，0.25μl）和FAM荧光探针（10μM，0.25μl）工具进行检测（详见下表）；
Figure 7177DEST_PATH_IMAGE002
将反应孔和空白对照在PCR扩增仪上进行反应，先进行预热：50℃、2分钟，95℃、10分钟，然后再进行60个循环的95℃、30秒，60℃、1分钟、反应结束后取出后再放入荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，得到儿茶酚-氧位-甲基转移酶（COMT）rs4680，雌激素受体基因(ESR2) rs1256054，性激素结合球蛋白(SHBG) rs6259三张图。
步骤4：SNP基因型分析 
将荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号的3个图和一个NTC空白对照进行比较，每个位点理论上存在三种不同的信号，纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧光信号，分别代表该位点三种不同的基因型；
（1）、儿茶酚-氧位-甲基转移酶（COMT）rs4680
在检测结果图中，坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为GG基因型、坐标轴右上区域为AG基因型、坐标轴右下区域为AA基因型， 
（2）、雌激素受体基因(ESR2) rs1256054
在检测结果图中，坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为CC基因型、坐标轴右上区域为GC基因型、坐标轴右下区域为GG基因型， 
（3）、性激素结合球蛋白(SHBG) rs6259
在检测结果图中，坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为AA基因型、坐标轴中间区域为AG基因型、坐标轴右下区域为GG基因型， 
步骤5：检测报告表
Figure 201310586949X100002DEST_PATH_IMAGE001

Claims (2)

1.一种荷尔蒙失衡型肥胖基因体质评估方法，其特征在于，具体步骤为 
步骤1：检测的样品类型与采样方法
用采样拭在口腔中分别左右两腮至少需要各上下刮40次以上，以保证采集到足量的细胞样本；
步骤2：基因组DNA的抽提方法
采用硅胶吸附法抽提每一个口腔上皮细胞样本的基因组DNA，时间为2小时－2.5小时，经电泳检测后，用肉眼可见清晰白色条带即可判断获得的DNA能进入下一步检测；
步骤3：荧光定量PCR反应
将每一个被测者样本分别放入3个反应孔，同时检测3个位点，即儿茶酚-氧位-甲基转移酶（COMT）rs4680，雌激素受体基因(ESR2) rs1256054，性激素结合球蛋白(SHBG) rs6259，另外根据实验需要增设不含DNA模版的NTC空白对照孔；
每一个反应孔的基因分型可以根据下表的引物和探针设计，采用TaqMan?-MGB技术，进行检测试剂合成；
在每一个反应孔中加入试剂为荧光定量PCR反应体系，总体积为10μl，即浓度为20ng/μl 的DNA模板2μl 、1μl 10X荧光定量PCR反应缓冲液ABI Taqman ? MGB、0.1μl 25mM d NTP合成DNA的四种脱氧核苷酸底物、0.5μl 25mM MgCl2溶液、0.02μl（5units/μl）Taq DNA聚合酶、去离子水4.98μl、3个位点分别采用不同的正向引物（20μM，0.225μl）、反向引物（20μM，0.225μl）、VIC荧光探针（10μM，0.25μl）和FAM荧光探针（10μM，0.25μl）工具进行检测（详见下表）；
儿茶酚-氧位-甲基转移酶（COMT）rs4680
带VIC荧光A型探针   GGCaTGAAGGAC
带FAM荧光G型探针   GGCgTGAAGGAC
正向引物   GGGCCTACTGTGGCTACTCA
反向引物   GGGTTTTCAGTGAACGTGGT
雌激素受体基因(ESR2) rs1256054
带VIC荧光C型探针   ACTcCAACACAA
带FAM荧光G型探针   ACTgCAACACAA
正向引物   GATGAGGGGAAATGCGTAGA
反向引物   CAGCATCTCTCCCCGATAAA
性激素结合球蛋白(SHBG) rs6259
带VIC荧光A型探针   GAAaACTCTTCC
带FAM荧光G型探针   GAAgACTCTTCC
正向引物   AATGCCACCTTTGCACTACC
反向引物   AGCTTTAATGGGAAGCGTCA
将反应孔和空白对照在PCR扩增仪上进行反应，先进行预热：50℃、2分钟，95℃、10分钟，然后再进行60个循环的95℃、30秒，60℃、1分钟、反应结束后取出后再放入荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，得到儿茶酚-氧位-甲基转移酶（COMT）rs4680，雌激素受体基因(ESR2) rs1256054，性激素结合球蛋白(SHBG) rs6259三张图；
步骤4：SNP基因型分析
将荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号的3个图和一个NTC空白对照进行比较，每个位点理论上存在三种不同的信号，纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧光信号，分别代表该位点三种不同的基因型；
（1）、儿茶酚-氧位-甲基转移酶（COMT）rs4680
在检测结果图中，坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为GG基因型、坐标轴右上区域为AG基因型、坐标轴右下区域为AA基因型， 
（2）、雌激素受体基因(ESR2) rs1256054
在检测结果图中，坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为CC基因型、坐标轴右上区域为GC基因型、坐标轴右下区域为GG基因型， 
（3）、性激素结合球蛋白(SHBG) rs6259
在检测结果图中，坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为AA基因型、坐标轴中间区域为AG基因型、坐标轴右下区域为GG基因型。
2.权利要求书1中的所述的三个基因的组合模式。
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