CN101845510A - 一种脂质代谢相关基因的基因型检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种脂质代谢相关基因的基因型检测方法，其特征在于，具体步骤为：检测的样品类型与采样方法：基因组DNA的抽提方法；荧光定量PCR反应；以及SNP基因型分析。本发明的优点是：检测准确率高，可重复性强。

Description

一种脂质代谢相关基因的基因型检测方法

技术领域

本发明涉及一种脂质代谢相关基因的基因型检测方法，用于检测ATP结合盒转运体A1基因ABCA1、脂联蛋白的C1Q和胶原结构域编码基因ADIPOQ和脂蛋白脂酶基因LPL的变异，属于分子生物学技术领域。

背景技术

脂类物质具有重要的生物功能，脂肪是体内的一种主要能量来源，但脂肪摄入过量而运动量又过少将产生肥胖，并导致一些慢性病的发生；膳食脂肪总量增加，还会增大某些癌症的发生几率。因此有意识地控制脂肪摄入和积极从事体力或体育活动，以消耗摄入多余的热量，避免过多的脂肪在体内积存。

ABCA1为ATP-binding cassette transporterA1，abca1(三磷酸腺苷结合盒转运体A1)蛋白编码基因，它以ATP为能源，促进细胞内游离胆固醇和磷脂的流出，在胆固醇逆转运(RCT)和HDL生成的起始步骤中起重要作用，被称作RCT守门人。核受体PPARs、LXRs和FXR对abca1蛋白的表达具有调控作用。ABCA1功能障碍将导致巨噬细胞内大量的胆固醇沉积而成为泡沫细胞，继而浸润血管壁，促进冠心病的发生发展。

ABCA1在机体中最重要的作用是对高密度脂蛋白的转运。高密度脂蛋白是机体重要的抵抗心脑血管疾病的大分子，它可以将机体多余的胆固醇从外周细胞转运入肝脏内，同时也可以保护低密度脂蛋白不受氧化损伤的影响，抑制血管内皮细胞上粘性大分子的表达，组织单核分子进入血管壁。而ABCA1对于肝脏内和外周细胞内的胆固醇水平可以进行调节，主要通过将多余的胆固醇从外周细胞泵出，与乏脂蛋白apoA-I结合形成初始状态的高密度脂蛋白，而初始状态的高密度脂蛋白通过胆固醇磷酸酰化成为胆淄醇酸脂的脂化反应转化为成熟的α高密度脂蛋白。决定血清内α高密度脂蛋白含量的几个因素包括肝脏内ABCA1转运酶和apoA-I的含量以及乏脂蛋白apoA-I的含量。

ADIPOQ为adiponectin，C1Q and collagen domain containing(脂联蛋白的C1Q和胶原结构域)编码基因，它编码一种在结构上与胶原X和VIII以及补体C1q类似的蛋白质。这种基因主要在脂肪组织中表达，所编码的蛋白质在血液中循环，并且和代谢以及激素产生过程有关。它的突变或异常表达等都会引起胰岛素等代谢综合症。

LPL基因编码脂蛋白脂酶，该酶在心脏、肌肉和脂肪组织中进行表达。LPL以同型二聚体蛋白的形式行使功能，其分子生物学的作用包括两部分，一部分为甘油三脂的水解酶作用，另一部分则是受体介导的脂蛋白内吞作用的桥梁。LPL蛋白上的位点突变在严重的情况下可以导致I型高脂蛋白血症，而较轻程度上则引起体内脂蛋白代谢的紊乱。

大样本量中国人群研究证实，ATP结合盒转运体A1基因ABCA1、脂联蛋白的C1Q和胶原结构域编码基因ADIPOQ和脂蛋白脂酶基因LPL的变异在中国人群众普遍存在。以往的检测方法在对ATP结合盒转运体A1基因ABCA1、脂联蛋白的C1Q和胶原结构域编码基因ADIPOQ和脂蛋白脂酶(LPL)基因进行检测时出现的假阳性现象无法很好的排查和解释。

发明内容

本发明的目的是提供一种准确率高的脂质代谢相关基因的基因型检测方法。

为了达到上述目的，本发明的技术方案是提供一种脂质代谢相关基因的基因型检测方法，其特征在于，具体步骤为：

第一步、检测的样品类型与采样方法：

用采样拭刮被测者口腔中左右两腮各20次，以采集口腔粘膜上皮细胞样本；

第二步、基因组DNA的抽提方法：

采用硅胶吸附法抽提每一个被测者口腔上皮细胞样本的基因组DNA，时间为2-2.5小时，经电泳检测后，肉眼可见清晰白色条带即进入下一步检测；

第三步、荧光定量PCR反应：

将每一个被测者样本分别放入4个反应孔，同时检测4个位点，即ATP结合盒转运体A1基因rs2230806、脂联蛋白的C1Q和胶原结构域编码基因rs2241766和脂蛋白脂酶基因rs320和rs285，并增设2个不含DNA模板的NTC空白对照孔；

在每一个反应孔中加入荧光定量PCR反应体系，所述PCR反应体系的总体积为10μl，由2μl浓度为20ng/μl的被测者口腔上皮细胞的基因组DNA模板溶液、1μl 10X荧光定量PCR反应缓冲液、0.1μl浓度分别为25mM的合成DNA的四种脱氧核苷酸底物d NTP混合液、0.5μl浓度为25mM的氯化镁溶液、0.02μl浓度为5units/μl的Taq DNA聚合酶溶液、5.43μl去离子水、0.225μ1浓度为20μM的正向引物溶液、0.225μ1浓度为20μM的反向引物溶液、0.25μl浓度为10μM的VIC荧光探针溶液和0.25μl浓度为10μM的FAM荧光探针溶液组成，其中，4个位点的正向引物、反向引物、带VIC荧光探针以及带FAM荧光探针序列如下：

(1)、ATP结合盒转运体A1基因SEQ ID N01：rs2230806：

带VIC荧光A型探针：ACCAAAGGAGAAACTG；

带FAM荧光G型探针：ACCAAGGGAGAAACTG；

正向引物：CATTGGACTGTTGCAATGGA；

反向引物：ACAAAGTCATGCTGTCCAAGG；

(2)、脂联蛋白的C1Q和胶原结构域编码基因SEQ ID NO1：rs2241766：

带VIC荧光G型探针：CGGGCATGACCAGG；

带FAM荧光T型探针：CGGTCATGACCAGG；

正向引物：GTATTACAGATTTCAGGGCAGAAAGA；

反向引物：TGTGATGAAAGAGGCCAGAA；

(3)、脂蛋白脂酶基因SEQ ID NO1：rs320：

带VIC荧光G型探针：AAGCGTTTATACT；

带FAM荧光T型探针：AAGCTTTTATACT；

正向引物：ATAAGCCCTGAATCGCTCAC；

反向引物：TTCCATCCCCAAGATCTTTTT；

(4)、脂蛋白脂酶基因SEQ ID NO1：rs285：

带VIC荧光C型探针：TTAGCAGCTGTGG；

带FAM荧光T型探针：TTAGTAGCTGTGG；

正向引物：AAGAGAGGACTGTGGGACCAT；

反向引物：TGCTGCTTTAGACTCTTGTCCA；

将反应孔和空白对照孔在PCR扩增仪上进行反应，先进行预热：50℃、2分钟，95℃、10分钟，然后再进行60个循环的95℃、30秒，60℃、1分钟，反应结束，取出后再放入荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，得到ATP结合盒转运体A1基因rs2230806、脂联蛋白的C1Q和胶原结构域编码基因rs2241766和脂蛋白脂酶基因rs320和rs285四张图；

第四步、SNP基因型分析：

将荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号的4个图和NTC空白对照进行比较，每个位点存在三种不同的信号，纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧光信号，分别代表该位点三种不同的基因型；

(1)、ATP结合盒转运体A1基因rs2230806：

在检测结果图中，坐标轴左下区域点为空白对照、坐标轴左上区域点为AA基因型、坐标轴右上区域点为AG基因型、坐标轴右下区域点为GG基因型；

(2)、脂联蛋白的C1Q和胶原结构域编码基因rs2241766：

在检测结果图中，坐标轴左下区域点为空白对照、坐标轴左上区域点为TT基因型、坐标轴右上区域点为GT基因型、坐标轴右下区域点为GG基因型；

(3)、脂蛋白脂酶基因rs320：

在检测结果图中，坐标轴左下区域点为空白对照、坐标轴左上区域点为TT基因型、坐标轴右上区域点为GT基因型、坐标轴右下区域点为GG基因型；

(4)、脂蛋白脂酶基因rs285：

在检测结果图中，坐标轴左下区域点为空白对照、坐标轴左上区域点为CC基因型、坐标轴右上区域点为CT基因型、坐标轴右下区域点为TT基因型。

本发明所需检测的DNA可以利用口腔粘膜上皮细胞进行抽提获得。采用口腔粘膜上皮细胞采样方法和器材进行样本采集。样本的DNA抽提利用硅胶吸附法进行口腔上皮细胞的DNA抽提并进行DNA浓度和纯度的测定。本发明4个位点的基因分型分别采用PCR技术及

技术进行分型。经重复实验验证，基因分型的准确率达到了99％以上，重复性达到了100％。本发明增加了一对内参因物的设计避免了假阳性现象，同时适用于大样本量的基因分型检测。

本发明的优点是：检测准确率高，可重复性强。

附图说明

图1为ATP结合盒转运体A1基因SEQ ID NO1：rs2230806基因分型图；

图2为脂联蛋白的C1Q和胶原结构域编码基因SEQ ID NO1：rs2241766基因分型图。

图3为脂蛋白脂酶基因SEQ ID NO1：rs320基因分型图；

图4为脂蛋白脂酶基因SEQ ID NO1：rs285基因分型图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例

一种脂质代谢相关基因的基因型检测方法：

第一步、检测的样品类型与采样方法：

用采样拭刮被测者口腔中左右两腮各20次，以采集口腔粘膜上皮细胞样本；

第二步、基因组DNA的抽提方法：

采用硅胶吸附法抽提每一个被测者口腔上皮细胞样本的基因组DNA，时间为2小时，经电泳检测后，肉眼可见清晰白色条带即进入下一步检测；

第三步、荧光定量PCR反应：

将每一个被测者样本分别放入4个反应孔，同时检测4个位点，即ATP结合盒转运体A1基因(ABCA1)rs2230806、脂联蛋白的C1Q和胶原结构域编码基因(ADIPOQ)rs2241766和脂蛋白脂酶基因(LPL)rs320和rs285，并增设2个不含DNA模版的NTC空白对照孔；

在每一个反应孔中加入荧光定量PCR反应体系，其总体积为10μl，即2μl浓度为20ng/μl的被测者口腔上皮细胞样本的基因组DNA溶液、1μl 10X荧光定量PCR反应缓冲液(ABI Master Mix)、0.1μl浓度分别为25mM的合成DNA的四种脱氧核苷酸底物d NTP混合液、0.5μl浓度为25mM的氯化镁溶液、0.02μl浓度为5units/μl的Taq DNA聚合酶(TIANGEN Taq DNA Polymerase)、5.43μl去离子水、0.225μl浓度为20μM的正向引物、0.225μl浓度为20μM的反向引物、0.25μl浓度为10μM的VIC荧光探针和0.25μl浓度为10μM的FAM荧光探针，其中，4个位点的正向引物、反向引物、带VIC荧光探针以及带FAM荧光探针如下：

ATP结合盒转运体A1基因(ABCA1)SEQ ID NO1：rs2230806：

带VIC荧光A型探针：ACCAAaGGAGAAACTG

带FAM荧光G型探针：ACCAAgGGAGAAACTG

正向引物：CATTGGACTGTTGCAATGGA

反向引物：ACAAAGTCATGCTGTCCAAGG

脂联蛋白的C1Q和胶原结构域编码基因(ADIPOQ)SEQ ID NO1：rs2241766：

带VIC荧光G型探针：CGGgCATGACCAGG

带FAM荧光T型探针：CGGtCATGACCAGG

正向引物：GTATTACAGATTTCAGGGCAGAAAGA

反向引物：TGTGATGAAAGAGGCCAGAA

脂蛋白脂酶基因(LPL)SEQ ID NO1：rs320：

带VIC荧光G型探针：AAGCgTTTATACT

带FAM荧光T型探针：AAGCtTTTATACT

正向引物：ATAAGCCCTGAATCGCTCAC

反向引物：TTCCATCCCCAAGATCTTTTT

脂蛋白脂酶基因(LPL)SEQ ID NO1：rs285：

带VIC荧光C型探针：TTAGcAGCTGTGG

带FAM荧光T型探针：TTAGtAGCTGTGG

正向引物：AAGAGAGGACTGTGGGACCAT

反向引物：TGCTGCTTTAGACTCTTGTCCA

将反应孔和空白对照孔在PCR扩增仪上进行反应，先进行预热：50℃、2分钟，95℃、10分钟，然后再进行60个循环的95℃、30秒，60℃、1分钟，反应结束，取出后再放入荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，得到ATP结合盒转运体A1基因(ABCA1)rs2230806、脂联蛋白的C1Q和胶原结构域编码基因(ADIPOQ)rs2241766和脂蛋白脂酶基因(LPL)rs320和rs285四张图；

第四步、SNP基因型分析：

将荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号的4个图和一个NTC空白对照进行比较，每个位点存在三种不同的信号，纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧光信号，分别代表该位点三种不同的基因型；

(1)、ATP结合盒转运体A1基因(ABCA1)rs2230806

如图1所示，为ATP结合盒转运体A1基因SEQ ID NO1：rs2230806基因分型图，坐标轴左下区域点为空白对照、坐标轴左上区域点为AA基因型、坐标轴右上区域点为AG基因型、坐标轴右下区域点为GG基因型；图中每个点代表一个受检样本，根据点所处的区域和位置和颜色可以进行基因型判断。

(2)、脂联蛋白的C1Q和胶原结构域编码基因(ADIPOQ)rs2241766

如图2所示，为脂联蛋白的C1Q和胶原结构域编码基因SEQ ID NO1：rs2241766基因分型图，坐标轴左下区域点为空白对照、坐标轴左上区域点为TT基因型、坐标轴右上区域点为GT基因型、坐标轴右下区域点为GG基因型；图中每个点代表一个受检样本，根据点所处的区域和位置和颜色可以进行基因型判断。

(3)、脂蛋白脂酶基因(LPL)rs320：

如图3所示，为脂蛋白脂酶基因SEQ ID NO1：rs320基因分型图，坐标轴左下区域点为空白对照、坐标轴左上区域点为TT基因型、坐标轴右上区域点为GT基因型、坐标轴右下区域点为GG基因型；图中每个点代表一个受检样本，根据点所处的区域和位置和颜色可以进行基因型判断。

(4)、脂蛋白脂酶基因(LPL)rs285：

如图4所示，为脂蛋白脂酶基因SEQ ID NO1：rs285基因分型图，坐标轴左下区域点为空白对照、坐标轴左上区域点为CC基因型、坐标轴右上区域点为CT基因型、坐标轴右下区域点为TT基因型。图中每个点代表一个受检样本，根据点所处的区域和位置和颜色可以进行基因型判断。

序列表

<110>上海中优医药高科技有限公司

 

<120>一种脂质代谢相关基因的基因型检测方法

 

<160>20

 

<210>1

<211>480

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

 

<220>

<221>mutation

<222>(256)

<223>n＝a或g

 

<400>1

atgcattgga ctgttgcaat ggaacctgtt ttaagatctt caaagctgta ttgatatgaa 60

gttctccaaa agacttcaag gacccagctt ccaatcttca taatcctctt gtgcttgtct 120

ctctttgcat gaaatgcttc caggtatttt tgcaaggcta ccagttacat ttgacaagtc 180

tgtgcaatgg atcaaaatca gaagagatga ttcaacttgg tgaccaagaa gtttctgagc 240

tttgtggcct accaanggag aaactggctg cagcagagcg agtacttcgt tccaacatgg 300

acatcctgaa gccaatcctg gtgagtagac ttgctcactg gagaaacttc aagcactaat 360

gctttcggaa tgtgaggctt ttccttggac agcatgactt tgttttgtag aaaagtacgg 420

ctggctggga gtttgtgata taatttagtt cagtggtatt ctaagtgttc ttagtgttct 480

 

<210>2

<211>500

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

 

<220>

<221>mutation

<222>(251)

<223>n＝g或t

 

<400>2

gtattacaga tttcagggca gaaagagatc aaggtgggct gcaatattca gaaaagtctt 60

cctggaaaag ttgaatactt agaaagcagc tcctagaagt agactctgct gagatggacg 120

gagtcctttg taggtcccaa ctgggtgtgt gtgtggggtc tgtctctcca tggctgacag 180

tgcacatgtg gattccaggg ctcaggatgc tgttgctggg agctgttcta ctgctattag 240

ctctgcccgg ncatgaccag gaaaccacga ctcaagggcc cggagtcctg cttcccctgc 300

ccaagggggc ctgcacaggt tggatggcgg gcatcccagg gcatccgggc cataatgggg 360

ccccaggccg tgatggcaga gatggcaccc ctggtgagaa gggtgagaaa ggagatccag 420

gtaagaatgt ttctggcctc tttcatcaca gacctcctac actgatataa actatatgaa 480

ggcattcatt attaactaag 500

 

<210>3

<211>504

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

 

<220>

<221>mutation

<222>(268)

<223>n＝g或t

 

<400>3

ggaaaacata agccctgaat cgctcacagt tattcagtga gagctgggat tagaagtcag 60

gaatctcagc ttctcatttg gcactgtttc ttgtaagtac aaaatagtta gggaacaaac 120

ctccgagatg ctacctggat aatcaaagat tcaaaccaac ctcttcaaga agggtgagat 180

tccaagataa tctcaacctg tctccgcagc cccacccatg tgtacccata aaatgaatta 240

cacagagatc gctataggat ttaaagcntt tatactaaat gtgctgggat tttgcaaact 300

atagtgtgct gttattgtta atttaaaaaa actctaagtt aggattgaca aattatttct 360

ctttagtcat ttgcttgtat caccaaagaa gcaaacaaac aaacaaaaaa aaaaagaaaa 420

agatcttggg gatggaaatg ttataaagaa tcttttttac actagcaatg tctagctgaa 480

ggcagatgcc ctaattcctt aatg 504

 

<210>4

<211>400

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

 

<220>

<221>mutation

<222>(201)

<223>n＝c或t

 

<400>4

gtaaagagag gactgtggga ccataatctt gaagacacag acaggcttca ctcatccctg  60

cctcctgcac cagtgggttc aaggctctgt cagtgtcccc taggggcacc tcaccactcc 120

cagcttcttc agctctggcc tgtcctgctg cctgcaaggg ttttgcttaa ttctcaattc 180

aatgtctctt catcttttag nagctgtggg gttttgttgt tgttcttctg tttttgctta 240

gtatctgact actttttaat tataaaaaga gatgtatcta aacaaaatag agattgttat 300

cagaagttca caacatttat taaaaatttt ttcacctgga caagagtcta aagcagcata 360

aaaatatggt ctgctatatt ctaaaccatc agtcttaaga 400

 

<210>5

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>带VIC荧光A型探针，与ABCA1 rs2230806SNP位点结合。

 

<400>5

accaaaggag aaactg 16

 

<210>6

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>带FAM荧光G型探针，与ABCA1 rs2230806SNP位点结合。

 

<400>6

accaagggag aaactg 16

 

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>用于ABCA1 rs2230806SNP序列扩增的正向引物。

 

<400>7

cattggactg ttgcaatgga 20

 

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>用于ABCA1 rs2230806SNP序列扩增的反向引物。

 

<400>8

acaaagtcat gctgtccaag g  21

 

<210>9

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>带VIC荧光G型探针，与ADIPOQ rs2241766SNP位点结合。

 

<400>9

cgggcatgac cagg 14

 

<210>10

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>带FAM荧光T型探针，与ADIPOQ rs2241766SNP位点结合。

 

<400>10

cggtcatgac cagg 14

 

<210>11

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>用于ADIPOQ rs2241766SNP序列扩增的正向引物。

 

<400>11

gtattacaga tttcagggca gaaaga  26

 

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>用于ADIPOQ rs2241766SNP序列扩增的反向引物。

 

<400>12

tgtgatgaaa gaggccagaa  20

 

<210>13

<211>13

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>带VIC荧光G型探针，与LPL rs320SNP位点结合。

 

<400>13

aagcgtttat act 13

 

<210>14

<211>13

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>带FAM荧光T型探针，与LPL rs320SNP位点结合。

 

<400>14

aagcttttat act 13

 

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>用于LPL rs320SNP序列扩增的正向引物。

 

<400>15

ataagccctg aatcgctcac  20

 

<210>16

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>用于LPL rs320SNP序列扩增的反向引物。

 

<400>16

ttccatcccc aagatctttt t  21

Claims (1)

1.一种脂质代谢相关基因的基因型检测方法，其特征在于，具体步骤为：

第一步、检测的样品类型与采样方法：

用采样拭刮被测者口腔中左右两腮各20次，以采集口腔粘膜上皮细胞样本；

第二步、基因组DNA的抽提方法：

采用硅胶吸附法抽提每一个被测者口腔上皮细胞样本的基因组DNA，时间为2-2.5小时，经电泳检测后，肉眼可见清晰白色条带即进入下一步检测；

第三步、荧光定量PCR反应：

将每一个被测者样本分别放入4个反应孔，同时检测4个位点，即ATP结合盒转运体A1基因rs2230806、脂联蛋白的C1Q和胶原结构域编码基因rs2241766和脂蛋白脂酶基因rs320和rs285，并增设2个不含DNA模板的NTC空白对照孔；

在每一个反应孔中加入荧光定量PCR反应体系，所述PCR反应体系的总体积为10μl，由2μl浓度为20ng/μl的被测者口腔上皮细胞的基因组DNA模板溶液、1μl 10X荧光定量PCR反应缓冲液、0.1μl浓度分别为25mM的用于合成DNA的四种脱氧核苷酸底物d NTP混合液、0.5μl浓度为25mM的氯化镁溶液、0.02μl浓度为5units/μl的Taq DNA聚合酶溶液、5.43μl去离子水、0.225μl浓度为20μM的正向引物溶液、0.225μl浓度为20μM的反向引物溶液、0.25μl浓度为10μM的VIC荧光探针溶液和0.25μl浓度为10μM的FAM荧光探针溶液组成，其中，4个位点的正向引物、反向引物、带VIC荧光探针以及带FAM荧光探针序列如下：

(1)、ATP结合盒转运体A1基因SEQ ID NO1：rs2230806：

带VIC荧光A型探针：ACCAAAGGAGAAACTG；

带FAM荧光G型探针：ACCAAGGGAGAAACTG；

正向引物：CATTGGACTGTTGCAATGGA；

反向引物：ACAAAGTCATGCTGTCCAAGG；

(2)、脂联蛋白的C1Q和胶原结构域编码基因SEQ ID NO1：rs2241766：

带VIC荧光G型探针：CGGGCATGACCAGG；

带FAM荧光T型探针：CGGTCATGACCAGG；

正向引物：GTATTACAGATTTCAGGGCAGAAAGA；

反向引物：TGTGATGAAAGAGGCCAGAA；

(3)、脂蛋白脂酶基因SEQ ID NO1：rs320：

带VIC荧光G型探针：AAGCGTTTATACT；

带FAM荧光T型探针：AAGCTTTTATACT；

正向引物：ATAAGCCCTGAATCGCTCAC；

反向引物：TTCCATCCCCAAGATCTTTTT；

(4)、脂蛋白脂酶基因SEQ ID NO1：rs285：

带VIC荧光C型探针：TTAGCAGCTGTGG；

带FAM荧光T型探针：TTAGTAGCTGTGG；

正向引物：AAGAGAGGACTGTGGGACCAT；

反向引物：TGCTGCTTTAGACTCTTGTCCA；

将反应孔和空白对照孔在PCR扩增仪上进行反应，先进行预热：50℃、2分钟，95℃、10分钟，然后再进行60个循环的95℃、30秒，60℃、1分钟，反应结束，取出后再放入荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，得到ATP结合盒转运体A1基因rs2230806、脂联蛋白的C1Q和胶原结构域编码基因rs2241766和脂蛋白脂酶基因rs320和rs285四张图；

第四步、SNP基因型分析：

将荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号的4个图和一个NTC空白对照进行比较，每个位点存在三种不同的信号，纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧光信号，分别代表该位点三种不同的基因型；

(1)、ATP结合盒转运体A1基因rs2230806：

在检测结果图中，坐标轴左下区域点为空白对照、坐标轴左上区域点为AA基因型、坐标轴右上区域点为AG基因型、坐标轴右下区域点为GG基因型；

(2)、脂联蛋白的C1Q和胶原结构域编码基因rs2241766：

在检测结果图中，坐标轴左下区域点为空白对照、坐标轴左上区域点为TT基因型、坐标轴右上区域点为GT基因型、坐标轴右下区域点为GG基因型；

(3)、脂蛋白脂酶基因rs320：

在检测结果图中，坐标轴左下区域点为空白对照、坐标轴左上区域点为TT基因型、坐标轴右上区域点为GT基因型、坐标轴右下区域点为GG基因型；

(4)、脂蛋白脂酶基因rs285：

在检测结果图中，坐标轴左下区域点为空白对照、坐标轴左上区域点为CC基因型、坐标轴右上区域点为CT基因型、坐标轴右下区域点为TT基因型。

Images