CN101240328A - 一种检测胆固醇代谢异常易感遗传风险的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测个体胆固醇代谢异常易感遗传风险的试剂盒。该试剂盒包括检测三磷酸腺苷结合盒转运体A1基因(ABCA1)上rs2230806号SNP位点、载脂蛋白B基因(APOB)上rs693号SNP位点、脂蛋白脂酶基因(LPL)上rs320号SNP位点和rs285号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、检测载脂蛋白E基因(APOE)上rs429358号SNP位点和rs7412号SNP位点的特异性引物队及DNA测序引物、荧光定量PCR常规组件、PCR反应组件、PCR产物纯化组件、DNA测序反应组件等。本发明的试剂盒通过同时检测与胆固醇代谢异常易感遗传风险密切相关的ABCA1、APOB、LPL、APOE基因上的单核苷酸多态性位点基因型来评估个体胆固醇代谢异常易感遗传风险。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测胆固醇代谢异常易感遗传风险的试剂盒，通过同时检测三磷酸腺苷结合盒转运体A1基因(ABCA1)、载脂蛋白B基因(APOB)、载脂蛋白E基因(APOE)和脂蛋白脂酶基因(LPL)上的单核苷酸多态性位点基因型来评估个体胆固醇代谢异常易感遗传风险。
背景技术
胆固醇是体内最丰富的固醇类化合物，它既作为细胞生物膜的构成成分，又是类固醇类激素、胆汁酸及维生素D的前体物质。因此对于大多数组织来说，保证胆固醇的供给，对维持其代谢平衡是十分重要的。胆固醇广泛存在于全身各组织中，其中约1/4分布在脑及神经组织中，占脑组织总重量的2％左右。肝、肾及肠等内脏以及皮肤、脂肪组织亦含较多的胆固醇，每100g组织中约含200至500mg，以肝为最多，而肌肉较少，肾上腺、卵巢等组织胆固醇含量可高达1％-5％，但总量很少。生物体有非常精细的机制以调控胆固醇代谢平衡，但当胆固醇代谢出现障碍时，来自膳食的胆固醇不能从血液中被迅速代谢，当体内总胆固醇过高，超过合成生物膜、胆汁酸及类固醇激素等的需要时，将造成血中胆固醇浓度过高，常会导致心血管疾病、阿尔海默氏病及胆结石等的发生。
胆固醇代谢异常会造成冠状动脉粥样硬化性心脏病，三磷酸腺苷结合盒转运体A1基因(ABCA1)与冠状动脉粥样硬化性心脏病密切相关。三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)蛋白是一种整合膜蛋白，它以ATP为能源，促进细胞内游离胆固醇和磷脂的流出，在胆固醇逆转运(RCT)和HDL生成的起始步骤中起重要作用，被称作RCT守门人。核受体PPARs、LXRs和FXR对abca1蛋白的表达具有调控作用。人体50种组织中存在有ABCA1 mRNA，在胰、肝、肺、肾上腺和胎儿组织中ABCA1表达水平最高，ABCA1功能障碍将导致巨噬细胞内大量的胆固醇沉积而成为泡沫细胞，继而浸润血管壁，促进动脉粥样硬化的发生发展。以医院为基础的病例-对照研究。经冠状动脉造影确诊的冠心病病例224例，为江苏省人民医院、无锡市第一人民医院住院患者，同一地区正常对照248例。分别以PCR-RFLP和PIRA-PCR对abca1第219密码子G→A(Arg219Lys)和第883G→A(Met883Ile)密码子多态进行检测，比较不同基因型与个体血脂水平和冠心病患病风险的关系。结果吸烟、高血压和高血糖是冠心病的独立危险因素。与携带219RR基因型者比较，携带至少1个219K等位基因者(即RK和KK基因型)冠心病患病风险显著降低59％(OR＝0.41，95％CI＝0.27-0.61)。而两位点联合作用分析发现携带219RR，883MM或883MI基因型者比较，携带其他组合基因型的个体冠心病患者风险降低61％(OR＝0.39，95％CI＝0.26-0.60)。另外，对照组中携带219K等位基因血清HDL-C水平显著高于219K非携带者(p＝0.37)，提示Arg219Lys位点的多肽改变主要通过改变HDL-C水平影响个体冠心病的患病风险。ABCA1的R219K可能与中国汉族人群冠心病遗传易感性有关，血清高密度脂蛋白可能是其作用靶点。
胆固醇代谢异常还会造成高脂血症。由于脂肪代谢或运转异常使血浆中一种或儿种脂质高于正常称为高脂血症，可表现为高胆固醇血症、高甘油三酯血症或两者兼有，即混合型高脂血症。目前科学研究已知，载脂蛋白B(APOB)、载脂蛋白E(APOE)和脂蛋白脂酶(LPL)三种基因与高脂血症有密切关系。
载脂蛋白B(APOB)蛋白是乳糜微粒和低密度脂蛋白(LDL)最主要的转运蛋白。可以形成低密度脂蛋白胆固醇，通过肝脏细胞表面的低密度脂蛋白受体LDLR介导的细胞内吞作用将脂质代谢的残余物进行清除。已有的研究发现APOB基因上的多个多态位点的改变而引起的基因结构变化可能导致编码的载脂蛋白apoB和胆固醇结合后的脂蛋白复合物与肝脏细胞上的低密度脂蛋白受体结合能力下降，导致低密度脂蛋白胆固醇类在血浆中聚积，无法被排出体外，发生高脂血症。严重者可对血管的正常运作产生阻碍，引起动脉粥样硬化和冠心病。通过一系列的关联性分析研究发现，载脂蛋白B基因Xba I位点上T等位基因，在一定程度上影响体内脂质代谢，是血脂增高的内在易感因素。
载脂蛋白E(APOE)是一个主要的乳糜微粒的辅基蛋白，可以与肝脏细胞或者周围细胞上的受体结合。ApoE蛋白对于甘油三酯蛋白的正常代谢是非常重要的。APOE基因的缺陷可能导致由于乳糜微粒和极低密度脂蛋白无法被正常清除而引发的血清胆同醇和甘油三酯的升高，进而引发家族性的β脂蛋白异常或者III型高脂蛋白血症。此外apoE蛋白还能够调节β淀粉样肽的沉淀以及神经元τ蛋白的过磷酸化，对微管蛋白的固定、细胞的再生等都有很重要的作用。ApoE基因多态性影响血脂的代谢水平，ApoE2和ApoE4携带者对血脂的作用程度与年龄相关。而E2亚型可能更多得发展成为III型高脂血症，而E4亚型则可能与V型高脂血症关系更为密切。
脂蛋白脂酶(LPL)对富含甘油三酯的脂蛋白(如乳糜微粒和极低密度脂蛋白VLDL)的清除来说，是一个重要的组织酶。在LPL的催化下，甘油三酯在毛细血管和组织之间的界面上水解，产生脂肪酸供组织摄取。Apoc II是LPL的激活剂，而ApoC III则是抑制剂。LPL的缺陷可以产生家族性的I型高乳糜微粒血症(I型高脂蛋白血症)，而酶活性的不足会导致V型高脂蛋白血症。分析了来自四川地区的152例高脂血症患者和128例血脂正常者的脂蛋白酯酶基因内含子8Hind III多态性、HDL亚类组成及相对百分含量。结果显示高脂血症组H+H+基因型频率显著高于对照组，而其他两种基因型频率显著低于对照组(p＜0.05)。此外在两组中H+H+基因型者，血清TG明显高于H-H-者，apoB100、TG/HDL-C比值也明显高于H-H-者(p＜0.05)。高脂血症患者H+H+基因型小颗粒的preβ1-HDL、HDL3b相对含量多于H-H-者，大颗粒的HDL2a、HDL2b相对含量少于H-H-者；正常对照组H+H+基因型HDL3c多于H-H-者，而HDL2a少于H-H-者，其差异均显著(p＜0.05)。因此认为中国人高脂血症患者脂蛋白酯酶基因Hind III酶切位点多态性与HDL亚类的组成相关。
发明内容
根据国家生物基因检测技术应用评估认证中心颁布的《中国人口健康服务基因位点认证规程》，对与胆固醇代谢异常易感相关基因位点的支持文献、分子生物学机理研究、中国人群适用性等进行综合分析评估后，ABCA1基因上rs2230806号SNP位点、APOB基因上rs693号SNP位点、APOE基因上rs429358号SNP位点和rs7412号SNP位点、LPL基因上rs320号SNP位点和rs285号SNP位点通过国家生物基因检测技术应用评估认证中心认定，可用于检测评估胆固醇代谢异常易感遗传风险。
基于ABCA1、APOB、APOE、LPL基因上这6个SNP位点的多态性可用来评估个体胆固醇代谢异常易感遗传风险的基础上，本发明提供一种检测个体胆固醇代谢异常易感遗传风险的试剂盒。
该试剂盒包括：
检测ABCA1基因上rs2230806号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对；
检测APOB基因上rs693号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对；
检测LPL基因上rs320号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对；
检测LPL基因上rs285号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对；
检测APOE基因上rs429358号与rs7412号SNP多态性基因型的特异性引物对及DNA测序引物；
荧光定量PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水等)。
PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、PCR反应缓冲液、去离子水等)；
PCR产物纯化组件(包括SAP酶、Exo I酶、去离子水等)；
DNA测序反应组件(包括BigDye mix，EDTA溶液、70％乙醇溶液、100％乙醇溶液、HIDI溶液、去离子水等)。
本试剂盒中所述的特异性引物对是指针对这6个SNP位点，能特异性扩增出包含这6个SNP位点的DNA片段的引物对。设计这类引物对是本领域技术人员能够轻易完成的。优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO：1和2、3和4、5和6、7和8、9和10所示序列的引物对。特异性引物对可用常规的合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的引物不限于这五对引物。
本试剂盒中所述的特异性荧光探针对是指针对ABCA1、APOB、LPL基因上这4个SNP位点而设计，能通过荧光定量PCR技术特异性检测出这4个SNPs位点基因型的Taqman探针对。设计这类探针是本领域技术人员能够轻易完成的。优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO：11和12、13和14、15和16、17和18所示序列的Taqman探针对。特异性荧光探针对可用常规的探针合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的特异性荧光Taqman探针对不限于这四对探针，所有可用于荧光定量PCR法检测这4个SNPs位点的探针均在本发明范围内。
本试剂盒中所述的DNA测序引物是指针对APOE基因上rs429358号SNP位点和rs7412号SNP位点而设计，能通过DNA测序技术特异性检测出这2个SNPs位点基因型的DNA测序引物。设计这类引物是本领域技术人员能够轻易完成的。优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO：19所示序列的DNA测序引物。DNA测序引物可用常规的合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的DNA测序引物不限于这条引物，所有可用于DNA测序技术检测这2个SNPs位点的DNA测序引物均在本发明范围内。
本发明试剂盒的组分和含量包括：
1.荧光定量PCR反应套装
10X荧光定量PCR反应缓冲液4μl，
25mM dNTP混合液0.4μl，
25mM MgCl2溶液2.4μl，
5units/μl Taq DNA聚合酶0.1μl，
20μM特异性引物对每条引物各0.225μl，
10μM特异性荧光探针对每条探针各0.25μl，
去离子水21.3μl。
2.PCR反应套装
10X PCR反应缓冲液2.5μl，
25mM dNTP混合液0.2μl，
25mM MgCl2溶液1.5μl，
5units/μl Taq DNA聚合酶0.125μl，
20μM APOE基因特异性引物对每条引物各0.25μl，
去离子水19.175μl。
3.PCR产物纯化套装
1units/μl SAP酶0.75μl，
10units/μl ExoI酶0.375μl，
去离子水3.875μl。
4.测序反应套装
25％BigDye mix 1μl，
3.2μM DNA测序引物1μl，
125mM EDTA溶液1μl，
100％乙醇溶液15μl，
70％乙醇溶液30μl，
HIDI溶液8μl，
去离子水2μl。
本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20℃。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。
实施例1.检测试剂盒的使用
步骤1：DNA模板的抽取
用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。
步骤2：荧光定量PCR反应
使用检测试剂盒中的荧光定量PCR套装，其中，含有下列引物对和荧光探针对：
有义引物1：5’-TGTGCAATGGATCAAAATCAG-3’(SEQ ID NO：1)
反义引物1：5’-GTGAGCAAGTCTACTCAC-3’(SEQ ID NO：2)
有义引物2：5’-GGCTCACATGAAGGCCAAATTC-3’(SEQ ID NO：3)
反义引物2：5’-AGTTCCTGCTGAATGTCCATTTGAT-3’(SEQ ID NO：4)
有义引物3：5’-AATTCAATGTCTCTTC-3’(SEQ ID NO：5)
反义引物3：5’-AGAACAACAACAAAA-3’(SEQ ID NO：6)
有义引物4：5’-AGGGTGAGATTCCAAGATAA-3’(SEQ ID NO：7)
反义引物4：5’-CAAGCAAATGACTAAAGAGAA-3’(SEQ ID NO：8)
带VIC荧光基团探针1：5’-ACCAAgGGAGAA-3’(SEQ ID NO：11)
带FAM荧光基团探针1：5’-ACCAAaGGAGAAA-3’(SEQ ID NO：12)
带VIC荧光基团探针2：5’-TGTATCTTCTAGgGTCTCTC-3’(SEQ ID NO：13)
带FAM荧光基团探针2：5’-TGTATCTTCTAGaGTCTCTC-3’(SEQ ID NO：14)
带VIC荧光基团探针3：5’-TTTAGcAGCTGT-3’(SEQ ID NO：15)
带FAM荧光基团探针3：5’-TTTAGtAGCTGTG-3’(SEQ ID NO：16)
带VIC荧光基团探针4：5’-GGATTTAAAGCgTTT-3’(SEQ ID NO：17)
带FAM荧光基团探针4：5’-AGGATTTAAAGCtTT-3’(SEQ ID NO：18)
有义引物1，反义引物1、带VIC荧光基团探针1、带FAM荧光基团探针1特异地针对检测ABCA1基因上rs2230806号SNP位点多态性；
有义引物2，反义引物2、带VIC荧光基团探针2、带FAM荧光基团探针2特异地针对检测APOB基因上rs693号SNP位点多态性；
有义引物3，反义引物3、带VIC荧光基团探针3、带FAM荧光基团探针3特异地针对检测LPL基因上rs320号SNP位点多态性；
有义引物4，反义引物4、带VIC荧光基团探针4、带FAM荧光基团探针4特异地针对检测LPL基因上rs285号SNP位点多态性；
4个SNPs位点分别进行4次独立的荧光定量PCR反应，每个反应的体系为总体积10μl，包含浓度为20ng/μl的DNA模板2μl、1μl 10X荧光定量PCR反应缓冲液、0.1μl 25mM dNTP混合液、0.6μl 25mM MgCl2溶液、0.025μl(5units/μl)Taq DNA聚合酶、20μM的有义引物和反义引物各0.225μl、10μM的带VIC荧光探针和带FAM荧光探针各0.25μl，去离子水5.325μl。
在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50℃、2分钟，95℃、10分钟，进行60个循环的95C、30秒，60℃、1分钟。反应结束后在ABI7900型荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。
步骤3：PCR扩增反应
使用检测试剂盒中的PCR反应套装，其中，含有下列引物对：
有义引物：5’-TAAGCTTGCACGGCTGTCCAAGGA-3’(SEQ ID NO：9)
反义引物：5’-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC-3’(SEQ ID NO：10)
反应的体系为总体积25μl，包含浓度为12.5ng/μl的DNA模板1μl、10X PCR反应缓冲液2.5μl，25mMdNTP混合液0.2μl，25mM MgCl2溶液1.5μl，5units/μl Taq DNA聚合酶0.125μl，20μM APOE特异性引物对每条引物各0.25μl，去离子水19.175μl。
在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为94℃、12分钟，进行30个循环的94℃、30秒，60℃、30秒，72℃、30秒，然后进行72℃、10分钟。
步骤4：PCR产物纯化
使用检测试剂盒中的PCR产物纯化套装，反应体系为总体积25μl，包含步骤3中PCR产物20μl，1units/μl SAP酶0.75μl，10units/μl ExoI酶0.375μl，去离子水3.875μl。
在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37℃、15分钟，72℃、20分钟。
步骤5：DNA测序反应
使用检测试剂盒中的测序反应套装，其中，含有下列APOE基因的DNA测序引物：
DNA测序引物：5’-TAAGCTTGCACGGCTGTCCAAGG-3’(SEQ ID NO：19)
反应的体系为总体积5μl，包含步骤4中PCR纯化产物1μl，25％BigDye mix 1μl，3.2μM DNA测序引物1μl，去离子水2μl。
在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98℃、2分钟，进行25个循环的96℃、30秒，55℃、30秒，60℃、4分钟。
反应结束后加入125mM EDTA溶液1μl和100％乙醇溶液15μl，于室温下沉淀15分钟：在4℃以3650转/分的转速离心30分钟，轻轻倒去上清液；加入70％乙醇溶液30μl，以3650转/分的转速离心15分钟，轻轻倒去上清液；室温放置20分钟后加入HIDI溶液8μl，放入测序仪中。
步骤6：基因型分析
熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量，根据不同序列探针VIC和FAM荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因型。
熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的SNP位点的基因型。
实施例2.对人们进行个体胆固醇代谢异常易感遗传风险检测的服务
步骤1：DNA提取
由医院检验科医师指导被检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用硅胶吸附法进行口腔上皮细胞的DNA抽提。
步骤2：基因分型检测
使用本发明提供的试剂盒，对被检测者基因组DNA的ABCA1基因上rs2230806号SNP位点、APOB基因上rs693号SNP位点、LPL基因上rs320号SNP位点和rs285号SNP位点进行荧光定量PCR检测，对APOE基因上rs429358号SNP位点和rs7412号SNP位点进行DNA测序检测，确定这6个SNPs位点的基因型。
步骤3：个体胆固醇代谢异常易感遗传风险的分析
通过对被检测者SNPs基因型的分析，出具个体胆固醇代谢异常易感遗传风险的分析报告单。报告中详细说明了被检测者胆固醇代谢异常易感遗传风险的高低，并由医师向被检者详细说明和解读个体胆固醇代谢异常易感遗传风险分析报告单。
序列表
<110>上海主健生物工程有限公司
<120>一种检测胆固醇代谢异常易感遗传风险的试剂盒
<160>19
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1
TGTGCAATGG ATCAAAATCA G 21
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
GTGAGCAAGT CTACTCAC 18
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
GGCTCACATG AAGGCCAAAT TC 22
<210>4
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>4
AGTTCCTGCT GAATGTCCAT TTGAT 25
<210>5
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>5
AATTCAATGT CTCTTC 16
<210>6
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>6
AGAACAACAA CAAAA 15
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>7
AGGGTGAGAT TCCAAGATAA 20
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>8
CAAGCAAATG ACTAAAGAGA A 21
<210>9
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>9
TAAGCTTGCA CGGCTGTCCA AGGA 24
<210>10
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>10
ACAGAATTCG CCCCGGCCTG GTACAC 26
<210>11
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>11
ACCAAgGGAG AA 12
<210>12
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>12
ACCAAaGGAG AAA 13
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>13
TGTATCTTCT AGgGTCTCTC 20
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>14
TGTATCTTCT AGaGTCTCTC 20
<210>15
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>15
TTTAGcAGCT GT 12
<210>16
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>16
TTTAGtAGCT GTG 13
<210>17
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>17
GGATTTAAAG CgTTT 15
<210>18
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>18
AGGATTTAAA GCtTT 15
<210>19
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>19
TAAGCTTGCA CGGCTGTCCA AGG 23
Claims (8)
1. 一种检测个体胆固醇代谢异常易感遗传风险的试剂盒，其特征在于：包括检测三磷酸腺苷结合盒转运体A1基因(ABCA1)上rs2230806号SNP位点、载脂蛋白B基因(APOB)上rs693号SNP位点、脂蛋白脂酶基因(LPL)上rs320号SNP位点和rs285号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、检测载脂蛋白E基因(APOE)上rs429358号SNP位点和rs7412号SNP位点的特异性引物队及DNA测序引物、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、PCR反应缓冲液、SAP酶、Exo I酶、BigDye mix，EDTA溶液、70％乙醇溶液、100％乙醇溶液、HIDI溶液、去离子水等。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的特异性引物对是指针对三磷酸腺苷结合盒转运体A1基因(ABCA1)上rs2230806号SNP位点、载脂蛋白B基因(APOB)上rs693号SNP位点、脂蛋白脂酶基因(LPL)上rs320号SNP位点和rs285号SNP位点、载脂蛋白E基因(APOE)上rs429358号SNP位点和rs7412号SNP位点，能特异性扩增出包含这6个SNP位点的DNA片段的引物对。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的特异性荧光探针对是指针对三磷酸腺苷结合盒转运体A1基因(ABCA1)上rs2230806号SNP位点、载脂蛋白B基因(APOB)上rs693号SNP位点、脂蛋白脂酶基因(LPL)上rs320号SNP位点和rs285号SNP位点而设计，能通过荧光定量PCR技术特异性检测出这4个SNPs位点基因型的Taqman探针对。
4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的DNA测序引物是指针对APOE基因上rs429358号SNP位点和rs7412号SNP位点而设计，能通过DNA测序技术特异性检测出这2个SNPs位点基因型的DNA测序引物。
5. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所含的特异性引物对选自具有SEQ ID NO：1和2、3和4、5和6、7和8、9和10所示序列的引物对。
6. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所含的特异性荧光探针选自具有SEQ ID NO：11和12、13和14、15和16、17和18所示序列的Taqman探针对。
7. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所含的DNA测序引物选自具有SEQ ID NO：19所示序列的引物。
8. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括：
1)荧光定量PCR反应套装：10X荧光定量PCR反应缓冲液4μl，25mM dNTP混合液0.4μl，25mM MgCl2溶液2.4μl，5units/μl Taq DNA聚合酶0.1μl，20μM特异性引物对每条引物各0.225μl，10μM特异性荧光探针对每条探针各0.25μl，去离子水21.3μl。
2)PCR反应套装：10X PCR反应缓冲液2.5μl，25mM dNTP混合液0.2μl，25mM MgCl2溶液1.5μl，5units/μl Taq DNA聚合酶0.125μl，20μM特异性引物对每条引物各0.25μl，去离子水19.175μl。
3)PCR产物纯化套装：1units/μl SAP酶0.75μl，10units/μl ExoI酶0.375μl，去离子水3.875μl。
4)测序反应套装：25％BigDye mix 1μl，3.2μM DNA测序引物1μl，125mM EDTA溶液1μl，100％乙醇溶液15μl，70％乙醇溶液30μl，HIDI溶液8μl，去离子水2μl。
本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20℃。
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| CNA2007100371783A CN101240328A (zh) | 2007-02-06 | 2007-02-06 | 一种检测胆固醇代谢异常易感遗传风险的试剂盒 |
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101845510A (zh) * | 2010-06-18 | 2010-09-29 | 上海中优医药高科技有限公司 | 一种脂质代谢相关基因的基因型检测方法 |
| CN105154553A (zh) * | 2015-09-21 | 2015-12-16 | 上海中优生物高科技有限责任公司 | 高血压型肥胖基因个体化干预饮品的制备方法及其系统 |
| CN118006765A (zh) * | 2024-04-08 | 2024-05-10 | 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） | 一种检测BCAT2 rs493841多态性的试剂盒及其用途 |
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2007
- 2007-02-06 CN CNA2007100371783A patent/CN101240328A/zh active Pending
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