CN101608229A - 痛风遗传检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测痛风遗传风险的试剂盒。该试剂盒包括检测载脂蛋白E基因(APOE)、5，10－亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)的单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对、荧光定量PCR常规组件、PCR反应组件、DNA测序反应组件等。本发明的试剂盒通过同时检测与痛风遗传风险密切相关的基因上的多态性位点基因型来评估个体痛风遗传风险。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测个体痛风遗传易感性的试剂盒，通过同时检测与痛风密切相关的载脂蛋白E基因(APOE)、5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)上的单核苷酸多态性位点基因型来评估个体痛风遗传易感性。
背景技术
痛风(gout)是体内慢性嘌呤代谢障碍引起的疾病。主要是由于尿酸生成增加和/或尿酸排泄减少，尿酸在体内沉积，引起的病理生理改变。表现为高尿酸血症，反复发作痛风性急性关节炎、痛风石、尿酸性肾病，常伴尿路结石，严重者呈关节畸形及功能障碍。
然而，不同的人遗传状况不同，导致其痛风的发病风险也存在着个体差异。携带风险基因型的人群，其痛风的发病风险会明显高于正常基因型的人群。如果不采取积极的预防措施，将会显著影响其健康状况。
APOE基因编码的载脂蛋白E，该蛋白参与体内脂质代谢，主要功能是清除乳糜微粒和极低密度脂蛋白。如果该基因发生变异，将导致高脂血症、痛风的发生风险增加。当携带风险基因型时，ApoE与受体结合能力下降，乳糜微粒和极低密度脂蛋白无法被正常清除，引发血清胆固醇和甘油三酯在体内积累，并最终导致发生高脂血症的风险增加。而高脂血症是痛风主要的合并症之一，研究表明痛风患者75％-80％伴有高甘油三酯血症，而高甘油三酯血症患者中80％伴有高尿酸血症。
MTHFR编码5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶，参与叶酸代谢通路。该酶参与甲基化过程和嘌呤合成代谢通路，影响体内尿酸的生成。如果该基因发生变异，将导致痛风发病风险上升。近年通过对代谢综合征相关基因多态性研究发现N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T突变与高尿酸血症相关。MTHFR蛋白是一种重要的一碳单位代谢酶。其基因位于lp36.3区，全长17kb，mRNA长212kb，包含11个外显子。C677T位于MTHFR基因的催化区域，该突变直接影响MTHFR蛋白的活性和耐热性，表现为不同程度的酶活性降低并伴有酶的耐热性降低。当携带风险基因型时，直接影响MTHFR基因的活性和耐热性，表现为不同程度的5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶活性降低并伴有酶的耐热性降低，并进一步引发致叶酸代谢障碍，影响到嘌呤的合成，引起尿酸的增多，最终增加痛风的发病风险。
发明内容
基于载脂蛋白E基因(APOE)、5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)上的3个SNP位点多态性可用来评估个体痛风遗传易感性的基础上，本发明提供一种检测个体痛风遗传易感性的试剂盒。
该试剂盒包括：
检测APOE基因上rs429358号与rs7412号SNP多态性基因型的特异性引物对及DNA测序引物；
检测MTHFR基因上C677T SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对；
PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反应缓冲液、去离子水等)；
PCR产物纯化组件(包括SAP酶、Exo I酶、去离子水等)；
DNA测序反应组件(包括BigDye mix，EDTA溶液、70％乙醇溶液、100％乙醇溶液、HIDI溶液、去离子水等)。
荧光定量PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反应缓冲液、去离子水等)。
本试剂盒中所述的引物对是本领域技术人员能够轻易完成设计的，并可用常规的合成技术进行合成。
本试剂盒中所述的特异性荧光探针对是能够轻易完成设计的，特异性荧光探针对可用常规的探针合成技术进行合成。
本发明试剂盒的组分和含量包括：
1.PCR反应套装
10X PCR反应缓冲液2.5μl，
25mM dNTP混合液0.2μl，
25mM MgCl2溶液1.5μl，
5units/μl Taq DNA聚合酶0.125μl，
20μM特异性引物对每条引物各0.25μl，
去离子水19.175μl。
2.PCR产物纯化套装
1units/μl SAP酶0.75μl，
10units/μl ExoI酶0.375μl，
去离子水3.875μl。
3.测序反应套装
25％BigDye mix 1μl，
3.2μM DNA测序引物1μl，
125mM EDTA溶液1μl，
100％乙醇溶液15μl，
70％乙醇溶液30μl，
HIDI溶液8μl，
去离子水2μl。
4.荧光定量PCR反应套装
10X荧光定量PCR反应缓冲液1μl，
25mM dNTP混合液0.1μl，
25mM MgCl2溶液0.6μl，
5units/μl Taq DNA聚合酶0.025μl，
20μM特异性引物对 每条引物各0.225μl，
10μM特异性荧光探针对 每条探针各0.25μl，
去离子水5.325μl。
本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20℃。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。
实施例1.检测试剂盒的使用
步骤1：DNA模板的抽取
用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。
步骤2：PCR扩增反应
使用检测试剂盒中的PCR反应套装。
反应的体系为总体积25μl，包含浓度为12.5ng/μl的DNA模板1μl、10XPCR反应缓冲液2.5μl，25mMdNTP混合液0.2μl，25mM MgCl2溶液1.5μl，5units/μl Taq DNA聚合酶0.125μl，20μM特异性引物对每条引物各0.25μl，去离子水19.175μl。
在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为94℃、12分钟，进行30个循环的94℃、30秒，60℃、30秒，72℃、30秒，然后进行72℃、10分钟。
步骤3：PCR产物纯化
使用检测试剂盒中的PCR产物纯化套装，反应体系为总体积25μl，包含PCR产物20μl，1units/μl SAP酶0.75μl，10units/μl ExoI酶0.375μl，去离子水3.875μl。
在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37℃、15分钟，72℃、20分钟。
步骤4：DNA测序反应
使用检测试剂盒中的测序反应套装。
反应的体系为总体积5μl，包含PCR纯化产物1μl，25％BigDye mix 1μl，3.2μM DNA测序引物1μl，去离子水2μl。
在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98℃、2分钟，进行25个循环的96℃、30秒，55℃、30秒，60℃、4分钟。
反应结束后加入125mM EDTA溶液1μl和100％乙醇溶液15μl，于室温下沉淀15分钟；在4℃以3650转/分的转速离心30分钟，轻轻倒去上清液；加入70％乙醇溶液30μl，以3650转/分的转速离心15分钟，轻轻倒去上清液；室温放置20分钟后加入HIDI溶液8μl，放入测序仪中。
步骤5：荧光定量PCR反应
使用检测试剂盒中的荧光定量PCR套装，进行1次独立的荧光定量PCR反应，每个反应的体系为总体积10μl，包含浓度为20ng/μl的DNA模板2μl、1μl 10 X荧光定量PCR反应缓冲液、0.1μl 25mM dNTP混合液、0.6μl 25mM MgCl2溶液、0.025μl(5units/μl)Taq DNA聚合酶、20μM的有义引物和反义引物各0.225μl、10μM的带VIC荧光探针和带FAM荧光探针各0.25μl，去离子水5.325μl。
在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50℃、2分钟，95℃、10分钟，进行60个循环的95℃、30秒，60℃、1分钟。反应结束后在荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。
步骤6：基因型分析
根据试剂盒使用说明书标示的基因分型图示对SNP位点进行基因型分析。
熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的SNP位点的基因型。
熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量，根据不同序列探针VIC和FAM荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因型。
实施例2.应用检测试剂盒进行个体痛风遗传易感性检测的服务
步骤1：DNA提取
由医院检验科医师指导被检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用硅胶吸附法进行口腔上皮细胞的DNA抽提。
步骤2：基因分型检测
使用本发明提供的试剂盒，对被检测者基因组DNA的APOE基因上rs429358号SNP位点和rs7412号SNP位点进行DNA测序检测，对MTHFR基因上C677T SNP位点进行荧光定量PCR检测，确定这3个SNP位点的基因型。
步骤3：个体痛风遗传易感性的分析
通过对被检测者SNP基因型的分析，出具个体痛风遗传易感性的分析报告单。报告中详细说明了被检测者痛风遗传风险的高低，并由医师向被检者详细说明和解读个体痛风遗传易感性分析报告单。
Claims (2)
1.一种检测个体痛风遗传易感性的试剂盒，其特征在于：包括同时检测APOE基因上rs429358号SNP位点和rs7412号SNP位点的特异性引物与DNA测序引物、5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)上C677T SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反应缓冲液、SAP酶、Exo I酶、BigDye mix，EDTA溶液、70％乙醇溶液、100％乙醇溶液、HIDI溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水等。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：试剂盒的组分和含量包括
1)PCR反应套装：10X PCR反应缓冲液2.5μl，25mM dNTP混合液0.2μl，25mM MgCl2溶液1.5μl，5units/μl Taq DNA聚合酶0.125μl，20μM特异性引物对每条引物各0.25μl，去离子水19.175μl。
2)PCR产物纯化套装：1units/μl SAP酶0.75μl，10units/μl ExoI酶0.375μl，去离子水3.875μl。
3)测序反应套装：25％BigDye mix 1μ4，3.2μM DNA测序引物1μl，125mM EDTA溶液1μl，100％乙醇溶液15μl，70％乙醇溶液30μl，HIDI溶液8μl，去离子水2μl。
4)荧光定量PCR反应套装：10X荧光定量PCR反应缓冲液1μl，25mM dNTP混合液0.1μl，25mM MgCl2溶液0.6μl，5units/μl Taq DNA聚合酶0.0025μl，20μM特异性引物对每条引物各0.225μl，10μM特异性荧光探针对每条探针各0.25μl，去离子水5.325μl。
本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20℃。
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| CNA2008100392712A CN101608229A (zh) | 2008-06-20 | 2008-06-20 | 痛风遗传检测试剂盒 |
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|---|---|---|---|---|
| CN102154502A (zh) * | 2011-04-19 | 2011-08-17 | 北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司 | 一种用于临床检测的测序方法 |
| CN108004315A (zh) * | 2017-12-22 | 2018-05-08 | 佰世凯（杭州）生物科技有限公司 | 用于阿尔茨海默氏症患病风险的评估方法 |
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2008
- 2008-06-20 CN CNA2008100392712A patent/CN101608229A/zh active Pending
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| CN108004315A (zh) * | 2017-12-22 | 2018-05-08 | 佰世凯（杭州）生物科技有限公司 | 用于阿尔茨海默氏症患病风险的评估方法 |
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