CN107058582A - 基于KASP检测β‑酪蛋白基因型的方法 - Google Patents

基于KASP检测β‑酪蛋白基因型的方法 Download PDF

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CN107058582A CN201710416932.8A CN201710416932A CN107058582A CN 107058582 A CN107058582 A CN 107058582A CN 201710416932 A CN201710416932 A CN 201710416932A CN 107058582 A CN107058582 A CN 107058582A
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

本发明涉及一种基于KASP检测β‑酪蛋白基因型的方法，包括如下步骤：S1：根据β‑酪蛋白的碱基序列，设计至少一种引物；S2：建立PCR体系，该PCR体系包括DNA、KASP Master Mix以及由步骤S1中的至少一种引物组成的混合引物；S3：设置空白对照；S4：PCR扩增；S5：扫描数据，得到β‑酪蛋白的基因型。本发明DNA样本需求低，成本低，检测结果准确，并且可支持低、中或高通量研究以及单个重复实验，灵活性强。

Description

基于KASP检测β-酪蛋白基因型的方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种基于KASP检测β-酪蛋白基因型的方法。
背景技术
A2β-酪蛋白是现代乳牛β-酪蛋白的天然原型。基于A2β-酪蛋白制成的配方奶粉,可能与母乳更接近，更有利于促进婴幼儿的生长发育。而且，A2奶已经对澳大利亚、英国及美国等国家的奶业产生重大影响，对于奶牛育种者来说，构建A2核心群是最具成本效益的。
β-酪蛋白是人乳和牛奶内的一种主要蛋白，且广泛存在于各钟奶制品中。牛奶中的β-酪蛋白有两个主要的变异型，A1和A2，及一些罕见的亚变异型。由于自然基因突变，出现了A1蛋白质的变体，而且通过广泛牧养,今天全球乳牛均普遍含A1β-酪蛋白。A1和A2β-酪蛋白的蛋白质结构存在差异，A1型β-酪蛋白的第67位为组氨酸，因此其前7个氨基酸残基可以被裂解产生β-酪啡肽-7(BCM-7)。A2型的第67位则为脯氨酸，则不会生成BCM-7。正是这种结构差异,使A2β-酪蛋白比A1更接近天然母乳中的蛋白质。实验证明A2β-酪蛋白有潜力改善宝宝的消化功能，促进宝宝对营养物质的吸收，呵护宝宝稚嫩的消化系统；含有A2β-酪蛋白的配方，从源头上最大程度地避免了(由A1酪蛋白引起的)不良的健康反应。这个观点已得到全球100多项科学论文的支持和认同。
目前检测β-酪蛋白基因型的方法有酶切、测序、荧光定量PCR技术等，然而，上述方法费事、费力且成本高。
因此，现有的β-酪蛋白基因型的检测方法仍有改善的必要。
发明内容
第一代分子标记的代表是RFLP，即限制性片段长度多态性，在对研究样品基因组信息不清楚的情况下，使用随机选择性酶切以后进行电泳，利用众多条带的多态性进行区分，目前已基本被淘汰；
第二代分子标记是SSR和STR，即简单序列重复数，目前还被广泛应用，但存在等位基因数目过多，人工判别不准确，实验可重复性差，分布密度不足等问题，正在被第三代标记技术替代；
随着进入后基因组时代，第三代分子标记应运而生，就是SNP，即单核苷酸多态性。它是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异而引起的一种DNA序列多态性。与第一二代不同，SNP具有分布密度高、遗传稳定性好、二等位基因型等特点，就如二进位制相对于十进位制，更适合于计算机算法一样，更容易实现高通量和自动化检测。KASP是竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR)的缩写，可在广泛的基因组DNA样品中(甚至是一些复杂基因组的DNA样品)，对SNPs和特定位点上的InDels进行精准的双等位基因判断。
为解决现有技术存在的不足，本发明结合第三代分子标记技术，提供了一种基于KASP检测β-酪蛋白基因型的方法，包括如下步骤：
S1：根据β-酪蛋白的碱基序列，设计至少一种引物；
S2：建立PCR体系，该PCR体系包括DNA、KASP Master Mix以及由步骤S1中的至少一种引物组成的混合引物；
S3：设置空白对照；
S4：PCR扩增；
S5：扫描数据，得到β-酪蛋白的基因型。
其中，所述步骤S1中，所设计的引物包括如下两种：
Master mix：5’-GAT GTT TTG TGG GAG GCT GTT AG-3’
5’-GGA TGT TTT GTG GGA GGC TGT TAT-3’
Primer mix：5’-TCT ATC CCT TCC CTG GGC CCA T-3’。
其中，所述步骤S2中，所述PCR体系介于4-6uL，其中，DNA的含量介于2-3uL，KASPMaster Mix的含量介于2-3uL，混合引物的含量介于0.03-0.10uL。
其中，所述步骤S2中，所述PCR体系为5.07uL，其中包括2.5uL DNA、2.5uL KASPMaster Mix以及0.07uL混合引物；所述混合引物由Master mix、Primer mix以及ddH2O组成，其中，Master mix、Primer mix以及ddH2O的体积份数分别介于20-30份、25-35份以及40-55份，且Master mix中，两条末端碱基不同的等位基因正向引物的量相同。
其中，所述步骤S3中，所述空白对照体系为将PCR体系中的DNA以等量ddH2O代替所得。
其中，所述步骤S4中，PCR扩增包括：
S41：在90-100摄氏度的温度下激活10-20分钟，90-100摄氏度的温度下变性15-25秒，50-65摄氏度的温度下退火和延伸55-65秒，进行8-12个循环；
S42：在90-100摄氏度的温度下变性15-25秒，50-60摄氏度的温度下退火和延伸55-65秒，进行25-30个循环；
S43：在90-100摄氏度的温度下变性15-25秒，50-60摄氏度的温度下退火和延伸55-65秒，进行2-5个循环。
其中，所述步骤S2中，PCR体系中的DNA选自奶牛血液，其制备方法如下：
S21：取离心管，加入预定体积的细胞裂解液，取溶化后的血块样品置于离心管中；
S22：匀浆仪磨碎、离心、弃上清，取底部的细胞核沉淀；
S23：重复步骤S21-S22，进一步离心弃上清；
S24：加缓冲液GS、Proteinase K溶液、涡旋混匀，加入缓冲液GB，再次涡旋混匀，置于分子杂交炉中消化预定时间；
S25：加入无水乙醇，充分混匀直至出现絮状沉淀；
S26：取吸附柱CB3，置于一收集管中，将步骤S25得到的带有絮状沉淀的溶液加入到吸附柱中，离心、弃废液；
S27：向吸附柱中加入已加入无水乙醇的缓冲液GD、离心、弃废液；
S28：向吸附柱中加入已加入无水乙醇的漂洗液PW、离心、弃废液；
S29：重复步骤S28；
S210：空甩离心、弃废液；
S211：将吸附柱转入新的EP离心管中，室温下开盖放置数分钟，将残余的漂洗液挥发掉；
S212：向吸附柱膜中间位置悬空加入洗脱缓冲液TB，室温放置数分钟，使DNA沉淀充分溶解；
S213：离心、弃吸附柱，收集DNA溶液，通过琼脂糖凝胶电泳和核酸分析仪检测DNA溶液的质量和浓度。
其中，所述步骤S2中，PCR体系中的DNA提取自奶牛血液，其制备方法如下：
S21：取若干2毫升EP离心管，每支加入700-800uL的细胞裂解液，取溶化后的血块样品置于离心管中，血块样品的体积介于0.3-0.6mL；
S22：匀浆仪磨碎、离心、弃上清，取底部的细胞核沉淀；
S23：重复步骤S21-S22，每支离心管再加入400-600uL的细胞裂解液，进一步离心弃上清；
S24：加200-300uL缓冲液GS、20-30uL Proteinase K溶液、涡旋混匀，加入200-300uL缓冲液GB，再次涡旋混匀，置于分子杂交炉中消化3-5h；
S25：加入150-250uL无水乙醇，充分混匀直至出现絮状沉淀；
S26：取吸附柱CB3，置于一收集管中，将步骤S25得到的带有絮状沉淀的溶液加入到吸附柱中，离心、弃废液；
S27：向吸附柱中加入400-600uL已加入无水乙醇的缓冲液GD、离心、弃废液；
S28：向吸附柱中加入600-800uL已加入无水乙醇的漂洗液PW、离心、弃废液；
S29：重复步骤S28；
S210：空甩离心、弃废液；
S211：将吸附柱转入新的EP离心管中，室温下开盖放置数分钟，将残余的漂洗液挥发掉；
S212：向吸附柱膜中间位置悬空加入80-100uL洗脱缓冲液TB，室温放置数分钟，使DNA沉淀充分溶解；
S213：离心、弃吸附柱，收集DNA溶液，通过琼脂糖凝胶电泳和核酸分析仪检测DNA溶液的质量和浓度。
其中，所述步骤S2中，PCR体系中的DNA提取自奶牛精液，其制备方法如下：
S21：取离心管，加冻精及生理盐水，涡旋混匀，离心、弃上清；
S22：再次加入生理盐水，离心、弃上清；
S23：向沉淀中加入牛冻精裂解液及SDS以溶解沉淀，之后加入Proteinase K溶液，混匀；
S24：将步骤S23所得溶液在分子杂交炉中消化预定时间；
S25：加入饱和食盐水，混匀，低温静置后低温离心，收集上清、弃沉淀；
S26：在上清液中加入低温无水乙醇，混匀，离心、弃上清；
S27：加入乙醇溶液，混匀，离心、弃上清；
S28：再次加入乙醇溶液，混匀，离心、弃上清，之后开盖放置预定时间，残余的乙醇彻底挥发；
S29：加入TB溶液，低温下过夜溶解DNA沉淀；
S210：通过琼脂糖凝胶电泳和核酸分析仪检测DNA溶液的质量和浓度。
其中，所述步骤S2中，PCR体系中的DNA选择奶牛精液，其制备方法如下：
S21：取2毫升EP离心管，加冻精及400-600uL生理盐水，涡旋混匀，离心、弃上清；
S22：再次加入400-600uL生理盐水，离心、弃上清；
S23：向沉淀中加入300-500uL牛冻精裂解液及80-120uL SDS以溶解沉淀，之后加入10-30uL Proteinase K溶液，混匀；
S24：将步骤S23所得溶液在分子杂交炉中消化预定时间；
S25：加入200-400uL饱和食盐水，混匀，低温静置后低温离心，收集上清、弃沉淀；
S26：在上清液中加入800-1200uL低温无水乙醇，混匀，离心、弃上清；
S27：加入400-600uL乙醇溶液，混匀，离心、弃上清；
S28：再次加入400-600uL乙醇溶液，混匀，离心、弃上清，之后开盖放置预定时间，使残余的乙醇彻底挥发；
S29：加入150-250uL TB溶液，低温下过夜溶解DNA沉淀；
S210：通过琼脂糖凝胶电泳和核酸分析仪检测DNA溶液的质量和浓度。
本发明提供的基于KASP检测β-酪蛋白基因型的方法，DNA样本需求低，成本低，检测结果准确，并且可支持低、中或高通量研究以及单个重复实验，灵活性强。
附图说明
图1：根据本发明的基因型检测得到的β-酪蛋白的基因型。
具体实施方式
为了对本发明的技术方案及有益效果有更进一步的了解，下面结合详细说明本发明的技术方案及其产生的有益效果。
本发明提供的基于KASP检测β-酪蛋白基因型的方法，具体实施时，本发明提供了如下的两个优选实施例：
实施例1：
S1：根据β-酪蛋白的碱基序列，设计引物：
Master mix：5’-GAT GTT TTG TGG GAG GCT GTT AG-3’
5’-GGA TGT TTT GTG GGA GGC TGT TAT-3’
Primer mix：5’-TCT ATC CCT TCC CTG GGC CCA T-3’。
S2：建立PCR体系，该PCR体系包括2.5uL DNA、2.5uL KASP Master Mix(LGCGenomics,Hoddeston,UK)以及0.07uL混合引物。
S3：将PCR体系中的DNA以等量ddH2O代替，以作为空白对照。
S4：进行PCR扩增：
S41：在94摄氏度的温度下激活15分钟，94摄氏度的温度下变性20秒，55-61摄氏度的温度下退火和延伸60秒，进行10个循环；
S42：在94摄氏度的温度下变性20秒，55摄氏度的温度下退火和延伸60秒，进行26个循环；
S43：在94摄氏度的温度下变性20秒，57摄氏度的温度下退火和延伸60秒，进行3个循环。
S5：参照《ABI7900HT Fast RealTime PCR system实验操作规程》进行数据扫描，得到β-酪蛋白的基因型。
其中，所述步骤S2中，PCR体系中的DNA选自奶牛血液，本实施例中利用天根生化科技有限公司(北京)的血液基因组DNA提取试剂盒DP318从血块中提取牛的基因组DNA，在获取DNA之前，需要先在缓冲液GD和漂洗液PW中加入相应体积的无水乙醇
所述奶牛血液中的DNA的具体获取方法如下：
S21：取若干2毫升EP离心管，每支加入750uL的细胞裂解液CL，取牛血块样品，溶化后剪取大约0.5mL置于离心管中；
S22：匀浆仪磨碎、10000r/min离心1min、弃上清，取底部的细胞核沉淀；
S23：重复步骤S21-S22，每支离心管再加入500uL的细胞裂解液CL，使用涡旋仪混匀，进一步离心弃上清；
S24：加250uL缓冲液GS、25uL Proteinase K溶液、涡旋混匀，加入250uL缓冲液GB，再次涡旋混匀，置于56℃分子杂交炉中消化4h；
S25：加入150-250uL无水乙醇，充分混匀直至出现絮状沉淀；
S26：取吸附柱CB3，置于一收集管中，将步骤S25得到的带有絮状沉淀的溶液加入到吸附柱中，12000r/min离心1min、弃废液；
S27：向吸附柱中加入500uL已加入无水乙醇的缓冲液GD、12000r/min离心1min、弃废液；
S28：向吸附柱中加入700uL已加入无水乙醇的漂洗液PW、12000r/min离心1min、弃废液；
S29：重复步骤S28；
S210：空甩，12000r/min离心2min、弃废液；
S211：将吸附柱转入新的1.5ml EP离心管中，室温下开盖放置数分钟，将残余的漂洗液挥发掉；
S212：向吸附柱膜中间位置悬空加入80-100uL洗脱缓冲液TB(56℃提前预热)，室温放置10min，使DNA沉淀充分溶解；
S213：12000r/min离心2min、弃吸附柱，收集DNA溶液，通过1％琼脂糖凝胶电泳和核酸分析仪检测DNA溶液的质量和浓度。
将检测合格的基因组DNA置于-20℃长期保存备用。
实施例2：
S1：根据β-酪蛋白的碱基序列，设计引物：
Master mix：5’-GAT GTT TTG TGG GAG GCT GTT AG-3’
5’-GGA TGT TTT GTG GGA GGC TGT TAT-3’
Primer mix：5’-TCT ATC CCT TCC CTG GGC CCA T-3’。
S2：建立PCR体系，该PCR体系包括2.5uL DNA、2.5uL KASP Master Mix(LGCGenomics,Hoddeston,UK)以及0.07uL混合引物。
S3：将PCR体系中的DNA以等量ddH2O代替，以作为空白对照。
S4：进行PCR扩增：
S41：在94摄氏度的温度下激活15分钟，94摄氏度的温度下变性20秒，55-61摄氏度的温度下退火和延伸60秒，进行10个循环；
S42：在94摄氏度的温度下变性20秒，55摄氏度的温度下退火和延伸60秒，进行26个循环；
S43：在94摄氏度的温度下变性20秒，57摄氏度的温度下退火和延伸60秒，进行3个循环。
S5：参照《ABI7900HT Fast RealTime PCR system实验操作规程》进行数据扫描，得到β-酪蛋白的基因型。
本实施例中，所述步骤S2中，PCR体系中的DNA选择奶牛精液，其制备方法如下：
S21：取2毫升EP离心管，加冻精一支及500uL生理盐水，涡旋混匀，12000r/min离心1min、弃上清；
S22：再次加入500uL生理盐水，12000r/min离心1min、弃上清；
S23：向沉淀中加入400uL牛冻精裂解液(先加入60ml双蒸水后加0.5mol/L的EDTA(pH＝8.0)2ml，1mol/L的Tris.Cl(pH＝8.0)1ml，10％的SDS 10ml，DTT 0.77g，NaCl 0.29g，定容至80ml)，及100uL20％的SDS以溶解沉淀，室温放置1-2分钟，涡旋，使沉淀完全溶于裂解液，之后加入20uL Proteinase K溶液，混匀；
S24：将步骤S23所得溶液在56℃分子杂交炉中消化20-22h；
S25：取出已消化好的样品，加入300uL饱和食盐水，混匀，低温下(冰箱)静置10分钟后4℃离心机中12000r/min离心10min，收集上清、弃沉淀；
S26：在上清液中加入1000uL低温无水乙醇，混匀，12000r/min离心1min、弃上清；
S27：加入500uL75％的乙醇溶液，混匀，12000r/min离心2min、弃上清；
S28：再次加入500uL75％的乙醇溶液，混匀，12000r/min离心2min、弃上清，之后开盖放置预定时间，使残余的乙醇彻底挥发；
S29：加入200μL 56℃的TB溶液，低温下过夜溶解DNA沉淀；
S210：通过1％琼脂糖凝胶电泳和核酸分析仪检测DNA溶液的质量和浓度。
将检测合格的基因组DNA置于-20℃长期保存备用。
本发明中，所谓的“Proteinase K溶液”，是指蛋白酶K溶液；所谓的缓冲液GS、缓冲液GB、缓冲液GD以及漂洗液PW，均选自天根试剂盒自带试剂DP318。
图1为根据本发明的基因型检测得到的β-酪蛋白的基因型图，结合图1可知：本发明利用KASP进行β-酪蛋白的基因型检测，对DNA样本的需求低，适于大批量样本检测，独立评价的准确性可达99.8％以上，且可支持低、中或高通量研究以及单个重复实验。
虽然本发明已利用上述较佳实施例进行说明，然其并非用以限定本发明的保护范围，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围之内，相对上述实施例进行各种变动与修改仍属本发明所保护的范围，因此本发明的保护范围以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种基于KASP检测β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：根据β-酪蛋白的碱基序列，设计至少一种引物；
S2：建立PCR体系，该PCR体系包括DNA、KASP Master Mix以及由步骤S1中的至少一种引物组成的混合引物；
S3：设置空白对照；
S4：PCR扩增；
S5：扫描数据，得到β-酪蛋白的基因型。
2.如权利要求1所述的基于KASP检测β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于：所述步骤S1中，所设计的引物包括如下两种：
Master mix：5’-GAT GTT TTG TGG GAG GCT GTT AG-3’
5’-GGA TGT TTT GTG GGA GGC TGT TAT-3’
Primer mix：5’-TCT ATC CCT TCC CTG GGC CCA T-3’。
3.如权利要求2所述的基于KASP检测β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于：所述步骤S2中，所述PCR体系介于4-6uL，其中，DNA的含量介于2-3uL，KASP Master Mix的含量介于2-3uL，混合引物的含量介于0.03-0.10uL。
4.如权利要求3所述的基于KASP检测β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于：所述步骤S2中，所述PCR体系为5.07uL，其中包括2.5uL DNA、2.5uL KASP Master Mix以及0.07uL混合引物；所述混合引物由Master mix、Primer mix以及ddH2O组成，其中，Master mix、Primermix以及ddH2O的体积份数分别介于20-30份、25-35份以及40-55份，且Master mix中，两条末端碱基不同的等位基因正向引物的量相同。
5.如权利要求1所述的基于KASP检测β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于：所述步骤S3中，所述空白对照体系为将PCR体系中的DNA以等量ddH2O代替所得。
6.如权利要求1-5中任一项所述的基于KASP检测β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于：所述步骤S4中，PCR扩增包括：
S41：在90-100摄氏度的温度下激活10-20分钟，90-100摄氏度的温度下变性15-25秒，50-65摄氏度的温度下退火和延伸55-65秒，进行8-12个循环；
S42：在90-100摄氏度的温度下变性15-25秒，50-60摄氏度的温度下退火和延伸55-65秒，进行25-30个循环；
S43：在90-100摄氏度的温度下变性15-25秒，50-60摄氏度的温度下退火和延伸55-65秒，进行2-5个循环。
7.如权利要求1所述的基于KASP检测β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于：所述步骤S2中，PCR体系中的DNA提取自奶牛血液，其制备方法如下：
S21：取离心管，加入预定体积的细胞裂解液，取溶化后的血块样品置于离心管中；
S22：匀浆仪磨碎、离心、弃上清，取底部的细胞核沉淀；
S23：重复步骤S21-S22，进一步离心弃上清；
S24：加缓冲液GS、Proteinase K溶液、涡旋混匀，加入缓冲液GB，再次涡旋混匀，置于分子杂交炉中消化预定时间；
S25：加入无水乙醇，充分混匀直至出现絮状沉淀；
S26：取吸附柱CB3，置于一收集管中，将步骤S25得到的带有絮状沉淀的溶液加入到吸附柱中，离心、弃废液；
S27：向吸附柱中加入已加入无水乙醇的缓冲液GD、离心、弃废液；
S28：向吸附柱中加入已加入无水乙醇的漂洗液PW、离心、弃废液；
S29：重复步骤S28；
S210：空甩离心、弃废液；
S211：将吸附柱转入新的EP离心管中，室温下开盖放置数分钟，将残余的漂洗液挥发掉；
S212：向吸附柱膜中间位置悬空加入洗脱缓冲液TB，室温放置数分钟，使DNA沉淀充分溶解；
S213：离心、弃吸附柱，收集DNA溶液，通过琼脂糖凝胶电泳和核酸分析仪检测DNA溶液的质量和浓度。
8.如权利要求7所述的基于KASP检测β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于：所述步骤S2中，PCR体系中的DNA提取自奶牛血液，其制备方法如下：
S21：取若干2毫升EP离心管，每支加入700-800uL的细胞裂解液，取溶化后的血块样品置于离心管中，血块样品的体积介于0.3-0.6mL；
S22：匀浆仪磨碎、离心、弃上清，取底部的细胞核沉淀；
S23：重复步骤S21-S22，每支离心管再加入400-600uL的细胞裂解液，进一步离心弃上清；
S24：加200-300uL缓冲液GS、20-30uL Proteinase K溶液、涡旋混匀，加入200-300uL缓冲液GB，再次涡旋混匀，置于分子杂交炉中消化3-5h；
S25：加入150-250uL无水乙醇，充分混匀直至出现絮状沉淀；
S26：取吸附柱CB3，置于一收集管中，将步骤S25得到的带有絮状沉淀的溶液加入到吸附柱中，离心、弃废液；
S27：向吸附柱中加入400-600uL已加入无水乙醇的缓冲液GD、离心、弃废液；
S28：向吸附柱中加入600-800uL已加入无水乙醇的漂洗液PW、离心、弃废液；
S29：重复步骤S28；
S210：空甩离心、弃废液；
S211：将吸附柱转入新的EP离心管中，室温下开盖放置数分钟，将残余的漂洗液挥发掉；
S212：向吸附柱膜中间位置悬空加入80-100uL洗脱缓冲液TB，室温放置数分钟，使DNA沉淀充分溶解；
S213：离心、弃吸附柱，收集DNA溶液，通过琼脂糖凝胶电泳和核酸分析仪检测DNA溶液的质量和浓度。
9.如权利要求1所述的基于KASP检测β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于：所述步骤S2中，PCR体系中的DNA提取自奶牛精液，其制备方法如下：
S21：取离心管，加冻精及生理盐水，涡旋混匀，离心、弃上清；
S22：再次加入生理盐水，离心、弃上清；
S23：向沉淀中加入牛冻精裂解液及SDS以溶解沉淀，之后加入Proteinase K溶液，混匀；
S24：将步骤S23所得溶液在分子杂交炉中消化预定时间；
S25：加入饱和食盐水，混匀，低温静置后低温离心，收集上清、弃沉淀；
S26：在上清液中加入低温无水乙醇，混匀，离心、弃上清；
S27：加入乙醇溶液，混匀，离心、弃上清；
S28：再次加入乙醇溶液，混匀，离心、弃上清，之后开盖放置预定时间，残余的乙醇彻底挥发；
S29：加入TB溶液，低温下过夜溶解DNA沉淀；
S210：通过琼脂糖凝胶电泳和核酸分析仪检测DNA溶液的质量和浓度。
10.如权利要求9所述的基于KASP检测β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于：所述步骤S2中，PCR体系中的DNA选择奶牛精液，其制备方法如下：
S21：取2毫升EP离心管，加冻精及400-600uL生理盐水，涡旋混匀，离心、弃上清；
S22：再次加入400-600uL生理盐水，离心、弃上清；
S23：向沉淀中加入300-500uL牛冻精裂解液及80-120uL SDS以溶解沉淀，之后加入10-30uL Proteinase K溶液，混匀；
S24：将步骤S23所得溶液在分子杂交炉中消化预定时间；
S25：加入200-400uL饱和食盐水，混匀，低温静置后低温离心，收集上清、弃沉淀；
S26：在上清液中加入800-1200uL低温无水乙醇，混匀，离心、弃上清；
S27：加入400-600uL乙醇溶液，混匀，离心、弃上清；
S28：再次加入400-600uL乙醇溶液，混匀，离心、弃上清，之后开盖放置预定时间，使残余的乙醇彻底挥发；
S29：加入150-250uL TB溶液，低温下过夜溶解DNA沉淀；
S210：通过琼脂糖凝胶电泳和核酸分析仪检测DNA溶液的质量和浓度。
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