CN111961734A - 一种快速检测A1和A2型β-酪蛋白基因型奶牛的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明创造提供了一种快速检测A1和A2型β‑酪蛋白基因型奶牛的方法，涉及分子标记育种技术领域，以解决现有技术中存在的检测β‑酪蛋白基因方法在实际生产应用中存在样本处理时间长而且检测成本高的技术问题，该方法步骤：S1:建立样本DNA快速提取体系，该体系包括DNA Extract Solution A和DNA Extract Solution B；S2：根据β‑酪蛋白基因碱基序列，设计用于PCR扩增的引物；S3：设置空白对照；S4：建立PCR扩增体系和扩增程序；S5：荧光信号扫描，得到β‑酪蛋白基因分型。本发明创造能够大大的缩短样本DNA常规提取消耗的时间，检测准确率达到99.9％以上，可以支持高通量研究和少量样本的重复性实验。
Description
技术领域
本发明创造属于分子标记育种领域，尤其是涉及一种快速检测A1和A2型β-酪蛋白基因型奶牛的方法。
背景技术
β-酪蛋白约占牛奶乳蛋白总量的24％～28％，文献报道，已鉴定出β酪蛋白的12种亚型，可根据相应位置氨基酸的变异来确定每一种亚型。按67位氨基酸的突变可分为A1(组氨酸)或A2(脯氨酸)型，其中A2型为野生型，A1型为突变型。有研究表明，A1型奶牛生产的牛奶在消化过程中可以产生β-酪啡肽(BCM-7)，BCM-7能够被人体直接吸收，有报道称其可能与孤独症、精神分裂症、选择言语困难、多动症、自残、I型糖尿病、冠心病等非传染性疾病的发生有关。
目前检测β-酪蛋白基因多态性位点分型的方法主要有测序法、限制性酶切法、荧光定量PCR方法、质谱检测法等，然而上述方法在实际生产应用中存在样本处理时间长而且检测成本高的问题。因此，现有的β-酪蛋白基因多态性位点分型的方法需要进一步改善。
发明内容
有鉴于此，本发明创造旨在提出一种快速检测A1和A2型β-酪蛋白基因型奶牛的方法，以解决上述背景技术中提出的技术问题。本发明提供的诸多技术方案中的优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。
为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：
一种快速检测A1和A2型β-酪蛋白基因型奶牛的方法，具体步骤如下：
S1：建立样本DNA快速提取体系，该体系包括DNA Extract Solution A和DNAExtract Solution B；
S2：根据β-酪蛋白基因碱基序列，设计用于PCR扩增的引物；
S3：设置空白对照；
S4：建立PCR扩增体系和扩增程序；
S5：荧光信号扫描，得到β-酪蛋白基因分型。
进一步的，所述所述步骤S1中，所述样本DNA快速提取体系建立方法如下：
S11:取3mm牛血卡或者20μL牛血液加入1.5mL离心管中；
S12：加入50μLDNA Extract Solution A，简短震混，95℃孵育5min；
S13:加入50μLDNA Extract Solution B，简短震混后瞬离取上清,作为PCR扩增的模板，加入配制好的PCR反应体系；
S14:S1所述的DNA快速提取体系来源于康为世纪的快速DNA提取试剂盒(货号：CW3011M)。
进一步的，所述步骤S2中，设计的所述PCR扩增引物包括3种：SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2和SEQ ID No.3。
进一步的，所述步骤S4中,建立所述PCR体系，所述PCR体系包括2.5uL DNA、2.5uLKASP Master Mix(LGC Genomics,Hoddeston,UK)以及0.07uL 3种混合引物。
进一步的，所述步骤S4中,所述PCR扩增程序包括：
94℃预变性15min，94℃变性20s,55-61℃退火和延伸60s,进行10个循环；
94℃变性20s，55℃退火和延伸60s，进行26个循环；
94℃变性20s，57℃退火和延伸60s，进行3个循环。
进一步的，所述步骤S5中，荧光信号扫描参照《ABI7900HT Fast Real Time PCRSystem实验室操作规程》进行数据扫描得到β-酪蛋白基因多态性位点分型结果。
相对于现有技术，本发明创造所述的快速检测A1和A2型β-酪蛋白基因型奶牛的方法具有以下优势：
本发明创造所述的快速检测A1和A2型β-酪蛋白基因型奶牛的方法，基于样本DNA快速提取和荧光信号实现β-酪蛋白基因多态性位点检测，能够大大的缩短样本DNA常规提取消耗的时间，直接拿血液或者血卡样本简单处理即可。检测准确率达到99.9％以上，可以支持高通量研究和少量样本的重复性实验。
附图说明
构成本发明创造的一部分的附图用来提供对本发明创造的进一步理解，本发明创造的示意性实施例及其说明用于解释本发明创造，并不构成对本发明创造的不当限定。在附图中：
图1为本发明创造实施例所述的根据本发明的基因型检测得到的β-酪蛋白基因多态性位点分型结果。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明创造中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在本发明创造的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明创造和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明创造的限制。此外，术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”等的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明创造的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本发明创造的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以通过具体情况理解上述术语在本发明创造中的具体含义。
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明创造。
S1：建立样本DNA快速提取体系，该体系包括DNA Extract Solution A和DNAExtract Solution B；
S2：根据β-酪蛋白基因碱基序列，设计用于PCR扩增的引物；
S3：设置空白对照；
S4：建立PCR扩增体系和扩增程序；
S5：荧光信号扫描，得到β-酪蛋白基因分型。
其中，步骤S1中，样本DNA快速提取体系建立方法如下：
S11:取3mm牛血卡或者20μL牛血液加入1.5mL离心管中；
S12：加入50μLDNA Extract Solution A，简短震混，95℃孵育5min；
S13:加入50μLDNA Extract Solution B，简短震混后瞬离取上清,作为PCR扩增的模板，加入配制好的PCR反应体系；
S14:S1的DNA快速提取体系来源于康为世纪的快速DNA提取试剂盒(货号：CW3011M)；
其中，步骤S2中，所设计的PCR扩增引物如下：
引物SEQ ID No.1：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTCTATCCCTTCCCTGGGCCCATCCC-3’(SEQ ID No.1，下划线部分为特异荧光试剂结合序列FAM)；
引物SEQ ID No.2：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCTATCCCTTCCCTGGGCCCATCCA-3’(SEQ ID No.2，下划线部分为特异荧光试剂结合序列Hex)；
引物SEQ ID No.3：5’-GAGTAAGAGGAGGGATGTTTTG-3’(SEQ ID No.3)；
其中，步骤S3中,空白对照体系为将PCR体系中的DNA以等量的ddH2O代替所得。
其中，步骤S4中,建立PCR体系，该体系包括2.5uL DNA、2.5uL KASP Master Mix(LGC Genomics,Hoddeston,UK)以及0.07uL3种混合引物。
其中，步骤S4中，PCR扩增程序包括：
94℃预变性15min，94℃变性20s,55-61℃退火和延伸60s,进行10个循环
94℃变性20s，55℃退火和延伸60s，进行26个循环
94℃变性20s，57℃退火和延伸60s，进行3个循环。
其中，步骤S5中，荧光信号扫描，参照《ABI7900HT Fast Real Time PCR System实验室操作规程》进行数据扫描得到β-酪蛋白基因多态性位点分型结果。
图1为根据本发明的基因型检测得到的β-酪蛋白基因多态性位点分型结果，结合图1可知本发明基于样本DNA快速提取和荧光信号实现β-酪蛋白基因多态性位点检测，能够大大的缩短样本DNA常规提取消耗的时间，直接拿血液或者血卡样本简单处理即可。检测准确率达到99.9％以上，可以支持高通量研究和少量样本的重复性实验。
实验验证情况
北京奶牛中心的106个荷斯坦奶牛的血液样本用我们的引物检测，结果如下：
1、38个仅检测到FAM信号，为纯合A2β-酪蛋白基因型，即纯合A2奶牛；
2、11个仅检测到HEX信号，为纯合A1β-酪蛋白基因型；
3、57个同时检测到FAM和HEX信号，为杂合β-酪蛋白基因型，即杂合A1/A2奶牛。
以上检测结果同时使用专利号CN107058582A所述方法进行验证，检测结果两者的一致率达到100％。
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种快速检测A1和A2型β-酪蛋白基因型奶牛的方法，其特征在于，具体步骤如下：
S1：建立样本DNA快速提取体系，该体系包括DNA Extract Solution A和DNA ExtractSolution B；
S2：根据β-酪蛋白基因碱基序列，设计用于PCR扩增的引物；
S3：设置空白对照；
S4：建立PCR扩增体系和扩增程序；
S5：荧光信号扫描，得到β-酪蛋白基因分型。
2.根据权利要求1所述的快速检测A1和A2型β-酪蛋白基因型奶牛的方法，其特征在于：
所述步骤S1中，所述样本DNA快速提取体系建立方法如下：
S11:取3mm牛血卡或者20μL牛血液加入1.5mL离心管中；
S12：加入50μL DNA Extract Solution A，简短震混，95℃孵育5min；
S13:加入50μL DNA Extract Solution B，简短震混后瞬离取上清,作为PCR扩增的模板，加入配制好的PCR反应体系；
S14:S1所述的DNA快速提取体系来源于康为世纪的快速DNA提取试剂盒(货号：CW3011M)。
3.根据权利要求1所述的快速检测A1和A2型β-酪蛋白基因型奶牛的方法，其特征在于：所述步骤S2中，设计的所述PCR扩增引物包括3种：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ IDNo.3。
4.根据权利要求1所述的快速检测A1和A2型β-酪蛋白基因型奶牛的方法，其特征在于，所述步骤S4中,建立所述PCR体系，所述PCR体系包括2.5uL DNA、2.5uL KASP Master Mix(LGC Genomics,Hoddeston,UK)以及0.07uL 3种混合引物。
5.根据权利要求1所述的快速检测A1和A2型β-酪蛋白基因型奶牛的方法，其特征在于，所述步骤S4中,所述PCR扩增程序包括：
94℃预变性15min，94℃变性20s,55-61℃退火和延伸60s,进行10个循环；
94℃变性20s，55℃退火和延伸60s，进行26个循环；
94℃变性20s，57℃退火和延伸60s，进行3个循环。
6.根据权利要求1所述的快速检测A1和A2型β-酪蛋白基因型奶牛的方法，其特征在于：所述步骤S5中，荧光信号扫描参照《ABI7900HT Fast Real Time PCR System实验室操作规程》进行数据扫描得到β-酪蛋白基因多态性位点分型结果。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20201120 |
|
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