CN110106251A - 用于冠心病发病风险预测的单核苷酸多态性位点的组合、试剂盒及芯片 - Google Patents

Abstract

本发明“用于冠心病发病风险预测的单核苷酸多态性位点的组合、试剂盒及芯片”，属于生物医学检测技术领域。所述单核苷酸多态性位点的序列选自由SEQ ID NO.1‑303中的任意1条序列、任意2条序列、任意3条序列、或任意3条以上的序列组成的组。本发明中涉及的303个单核苷酸多态性位点集合及其应用具有准确、灵活、快速、低成本的特点，经过模型验证，该发明对冠心病的发病风险具有很好的辅助预测价值。

Description

用于冠心病发病风险预测的单核苷酸多态性位点的组合、试 剂盒及芯片

技术领域

本发明属于生物医学领域临床检测技术中的基因检测技术，具体涉及一种包含303个单核苷酸多态性位点的集合及用于冠心病发病风险预测的方法，特别是涉及一种根据使用303个单核苷酸多态性位点检测结果进行预测冠心病发病风险的方法。

背景技术

冠心病是严重威胁人类健康和生命的重大疾病。前期大量的研究证实，冠心病是可以预防的疾病。因此，如果能对人群的冠心病发病风险进行评估，识别出冠心病的高危人群，就可以采取相应的针对性的措施，减少冠心病的发病概率。

目前，国际上通用的冠心病风险评估模型主要有Framingham风险评估模型，欧洲系统性冠心病风险评估计划模型等，但是他们存在只针对欧洲人群以及没有纳入遗传因素的缺点。有研究表明，遗传因素可以至少解释50％的冠心病发病。因此如果不纳入遗传因素，对于预测冠心病发病率的准确性有很大的影响。

截至目前为止，全基因组关联研究(GWAS)已经至少发现了50个与冠心病相关的易感单核苷酸多态性位点。这些单核苷酸多态性位点与冠心病的发生密切相关。CARDIoGRAMplusC4D协会的研究发现104个与冠心病相关的独立的单核苷酸多态性位点，这些位点能够解释10.6％的冠心病的遗传性。如果可以在冠心病风险评估模型中纳入多位点的单核苷酸多态性位点风险评分，有可能可以显著提高冠心病的风险预测准确性。

但目前，全世界仍未找到一个非常适合预测冠心病发病风险的单核苷酸多态性位点集合。

发明内容

本发明要解决的问题是克服上述的缺陷，提供一种全新的包括303个单核苷酸多态性位点的集合，可根据303个单核苷酸多态性位点的结果进行预测冠心病的发病风险。

本发明的技术方案如下：

用于冠心病发病风险预测的单核苷酸多态性位点的组合，其特征在于，所述单核苷酸多态性位点的序列选自由SEQ ID NO.1-303中的任意1条序列、任意2条序列、任意3条序列、或任意3条以上的序列组成的组。

所述的用于冠心病发病风险预测的单核苷酸多态性位点的组合，其特征在于，包括SEQ ID NO.1-303所示的序列。

所述冠心病发病风险预测指，采用所述组合，并基于MassARRAY核酸测序技术对受试者DNA样品进行检测。

一种用于预测冠心病发病风险的试剂盒，其特征在于，包括所述的组合的单核苷酸多态性位点的序列。

所述的一种用于预测冠心病发病风险的试剂盒还包括：用于扩增所述的组合的单核苷酸多态性位点的序列的特异性引物，所述特异性引物基于所述单核苷酸多态性位点的序列设计得到。

所述的一种用于预测冠心病发病风险的试剂盒还包括，用于采用所述特异性引物进行PCR的常规试剂，和/或，进行MassARRAY核酸测序技术的常规试剂。

所述预测指采用所述特异性引物，并基于MassARRAY核酸测序技术对受试者DNA样品进行检测。

所述检测包括如下步骤：

(1)利用权利要求1所述的特异性引物对受试者基因组DNA进行超多重PCR扩增；

(2)对步骤(1)得到的扩增产物利用虾碱性磷酸酶去除扩增反应后剩余的核酸碱基；

(3)对步骤(2)得到的产物进行单碱基延伸反应(EXTEND)

(4)对步骤(3)得到的产物进行树脂纯化；

(5)对步骤(4)得到的纯化产物芯片点板及MassARRAY仪器检测质谱检测；

(6)对步骤(5)得到的结果使用Typer 4.0软件的Typer Analyzer导出Onco CartaReport，获得检测结果；

(7)将步骤(6)获得的检测结果用下述公式进行计算得到总分：

S＝n₁×X₁+n₂×X₂+n₃×X₃+……+n₃₀₃×X₃₀₃(本发明的SNP位点组合中涉及的303个位点都需要进行测定计算)

上述公式中，S代表总分，n为各SNP位点的风险碱基的个数，X为该位点的加权系数；

每个SNP位点的风险碱基、加权系数如下表1所示，下表1中的风险碱基的作用在于，利用MassARRAY仪器自带的massarray系统对每个SNP位点进行检测可获知该位点风险碱基的个数，该风险碱基的个数即上述公式中的n，如果结果为带有一个碱基，则上面公式中对应的n为1，如果带有两个则n为2，不带有则n为0。

表1

表1每条序列中的N即等位基因碱基；

(8)根据步骤(7)得到的总分评估受试者冠心病风险，其中，总分小于等于20分为低风险，大于80分为高风险，大于20分小于等于80分为中等风险。

所述受试者基因组DNA来自受试者的外周血、体液、组织器官样本。

一种用于预测冠心病发病风险的SNP芯片，其特征在于，包括所述的用于冠心病发病风险预测的单核苷酸多态性位点的组合，和/或，所述的试剂盒。

本发明利用生物信息学原理，通过计算机模拟计算和人群的验证，新构成了一个303个单核苷酸多态性位点的集合，使用这些位点的信息对健康人群进行检测，通过检测结果利用相关的风险预测模型，可以准确预测未来冠心病的发病风险。

本发明还提供一种上述303个单核苷酸多态性位点在制备诊断试剂盒中的应用，所述试剂盒用于预测冠心病发病风险。

进一步，所述应用包括下列步骤：

(1)提供受试者样本的基因组DNA；

(2)利用权利要求1所述的303个单核苷酸多态性位点集合，使用其特异性引物，进行扩增；

(3)对步骤(2)得到的扩增产物进行MassARRAY仪器检测；

(4)对步骤(3)得到的结果转换为相应单核苷酸多态性位点信息；

(5)对步骤(4)得到的位点信息利用预测模型进行冠心病发病风险预测；

优选的，所述样本来自受试者的外周血、体液、组织器官样本。

更优选的，所述应用进一步用于指导预防，例如通过预测结果可以个体化告知受试者需要改善哪些生活习惯，更改体检间隔时间以达到预防冠心病发病风险的目的。

本发明还提供一种诊断试剂盒，其中，所述试剂盒包括上述包含303个单核苷酸多态性位点的特异性引物。

采用本发明的303个单核苷酸多态性位点集合对正常人群进行冠心病发病风险预测有着以下重要意义和效果：

1.可有效告知受试者未来冠心病的发病风险，解答受试者对于自己未来是否会得冠心病的疑惑；

2.可有助于临床医师对受试者做出个体化预防建议，有效降低受试者未来的发病风险；

3.我国是冠心病发病大国，利用此结果可以实现全民针对性预防，显著降低冠心病的发病率；

4.本申请的单核苷酸多态性位点集合从超过单核苷酸多态性位点中选择的303个单核苷酸多态性位点，这些基因尤其适合包括中国人在内的黄色人种人群的检测；

5.本发明采用基于MassARRAY核酸飞行质谱对扩增产物进行检测，能够在一次测序反应中同时检测本发明中涉及的303个单核苷酸多态性位点。

本发明设计的检测方法经过Sanger测序法验证，对于303个单核苷酸多态性位点的检测，本方法的准确度达到99.5％。获得本发明方法的准确度的具体步骤是，选取了30个样本的303个SNP分别使用MassARRAY核酸飞行质谱检测和使用测序金标准的Sanger测序法进行检测，比较其准确性。其检测的9090个结果，与Sanger测序法相比，结果一致的为9055个结果，即与金标准相比准确性为99.5％。

综合来看，本发明中涉及的303个单核苷酸多态性位点集合及其应用具有准确、灵活、快速、低成本的特点，经过模型验证，该发明对冠心病的发病风险具有很好的辅助预测价值。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，下述实施例只是说明性的，并不限制本发明保护范围。

第1组实施例、本发明的用于冠心病发病风险预测的单核苷酸多态性位点的组合

本组实施例提供一种用于冠心病发病风险预测的单核苷酸多态性位点的组合。本组所有的实施例具备如下共同特征：所述单核苷酸多态性位点的序列选自由SEQ ID NO.1-303中的任意1条序列、任意2条序列、任意3条序列、或任意3条以上的序列组成的组。SEQ IDNO.1-303所述序列分别对应上文的表1所列的序号1-303分别对应的序列。

在优选的实施例中，所述的用于冠心病发病风险预测的单核苷酸多态性位点的组合，其特征在于，包括SEQ ID NO.1-303所示的序列。

在一些实施例中，所述冠心病发病风险预测指，采用所述组合，并基于MassARRAY核酸测序技术对受试者DNA样品进行检测。

第2组实施例、本发明的用于预测冠心病发病风险的试剂盒

本组实施例提供一种用于预测冠心病发病风险的试剂盒，其特征在于，包括第1组实施例任一所述的组合的单核苷酸多态性位点的序列。

在进一步的实施例中，所述试剂盒还包括用于扩增第1组实施例任一所述的组合的单核苷酸多态性位点的序列的特异性引物；具体地，所述特异性引物基于所述单核苷酸多态性位点的序列设计得到。

更进一步的，所述试剂盒还包括，用于采用所述特异性引物进行PCR的常规试剂，和/或，进行MassARRAY核酸测序技术的常规试剂。

在一些实施例中，所述预测指采用所述特异性引物，并基于MassARRAY核酸测序技术对受试者DNA样品进行检测。

在具体的实施例中，所述检测包括如下步骤：

(1)利用权利要求1所述的特异性引物对受试者基因组DNA进行超多重PCR扩增；

(2)对步骤(1)得到的扩增产物利用虾碱性磷酸酶去除扩增反应后剩余的核酸碱基；

(3)对步骤(2)得到的产物进行单碱基延伸反应(EXTEND)

(4)对步骤(3)得到的产物进行树脂纯化；

(5)对步骤(4)得到的纯化产物芯片点板及MassARRAY仪器检测质谱检测；

(6)对步骤(5)得到的结果使用Typer 4.0软件的Typer Analyzer导出Onco CartaReport，获得检测结果；

(7)将步骤(6)获得的检测结果用下述公式进行计算得到总分：

S＝n₁×X₁+n₂×X₂+n₃×X₃+……+n₃₀₃×X₃₀₃

上述公式中，S代表总分，n为各SNP位点的风险碱基的个数，X为该位点的加权系数；每个SNP位点的风险碱基的个数、加权系数如上文中所述的表1所示。

例如：rs10139550的等位基因有C/G两种，风险等位基因为G，加权系数为0.076。某人检测的结果为GG，则此位点的加权的分数为2*0.076＝0.152

实验例.本发明方法的具体操作及验证

1.该方法中所用到的试剂：

Onco Carta panel 1.0(Sequenom公司,San Diego)

Onco Carta扩增引物混合物(Sequenom公司)

Onco Carta延伸引物混合物(Sequenom公司)

Clean Resin树脂(Sequenom公司)

Spectro CHIPⅡ芯片(Sequenom公司)

2.标本采集和保存

(1)标本采集：标本为患者外周血。血液为常规取静脉血5ml，EDTA抗凝处理。

(2)保存：可立即检测，4℃保存一周，超过一周-80℃保存。

3.检测步骤和结果分析：

(1)标本基因组DNA的提取：标本DNA的提取按照天根生化科技(北京)有限公司的血液DNA提取试剂盒操作说明进行。

(2)DNA PCR扩增反应：

1)扩增反应体系：

双蒸水0.8μl

10×PCR Buffer 0.5μl

25m M MgCl2 0.4μl

25m M d NTP Mix 0.1μl

0.5u M/500u M Onco Carta Primer Mix 1.0μl

5U/μL PCR Enzyme 0.2μl

样本DNA2.0μl

总体积5.0μl

2)扩增反应条件：

PCR起始：95℃2min

PCR

(3)利用虾碱性磷酸酶去除扩增反应后剩余的核酸碱基

(4)单碱基延伸反应(EXTEND)

(5)样品树脂纯化

(6)芯片点板及MassARRAY仪器检测质谱检测

(7)数据分析：使用Typer 4.0软件的Typer Analyzer导出Onco Carta Report，获得检测结果

(8)预测结果：利用检测结果，使用内部的加权算法，每个位点根据加权计算总分，通过查询得分表，得到受试者冠心病风险结果

第(7)步为软件操作直接计算机自动判断得出检测结果。

第(8)步对303个SNP根据其分型结果分别进行内部加权计算对应分数，并进行累加得到总危险评分。评分大于80分为高风险，小于20分为低风险，介于20至80分为中等风险。

上述第(1)-(6)步的具体实验操作步骤的参考文献：The MassARRAY System forTargeted SNP Genotyping.Ellis JA et al.Methods Mol Biol.(2017)

结果说明及分析

通过本发明中涉及的MassARRAY测序技术一次性对303个标本的目标区域进行检测可以准确检测到相应单核苷酸多态性位点的基因型，通过内部的加权算法，然后查询总表可以得出相应受试者的未来冠心病的发病风险，为临床提供预防依据。

本发明的临床应用例证

利用本发明所提供的方法，在体检中心开展了针对健康人群的冠心病风险预测，共检测350例健康人群，发现了23例冠心病高危发病风险的个体，并对他们给予了个性化的预防建议。

目前冠心病风险预测的权威方法是《Framingham针对冠心病风险评估量表》，其参考文献https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/？term＝9603539。它使用年龄、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、甘油三脂、血压、糖尿病史、吸烟史通过查询相应的评分列表，将冠心病的发病风险分为极高危，高危，中危，低危和极低危。

我们使用本发明的方法与权威方法预测上述同样的群体，本发明的高危险与权威方法的极高危和高危的一致性为93.12％，本发明的中危与权威方法的中危一致性为91.63％，本发明的低危与权威方法的低危一致性为86.54％。

需要注意的是，权威方法的预测并不是金标准，目前世界上对于冠心病发病风险的预测，准确度仍没有超过90％。

Claims (10)

1.用于冠心病发病风险预测的单核苷酸多态性位点的组合，其特征在于，所述单核苷酸多态性位点的序列选自由SEQ ID NO.1-303中的任意1条序列、任意2条序列、任意3条序列、或任意3条以上的序列组成的组。

2.根据权利要求1所述的用于冠心病发病风险预测的单核苷酸多态性位点的组合，其特征在于，包括SEQ ID NO.1-303所示的序列。

3.根据权利要求1或2所述的组合，其特征在于，所述冠心病发病风险预测指，采用所述组合，并基于MassARRAY核酸测序技术对受试者DNA样品进行检测。

4.一种用于预测冠心病发病风险的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一所述的组合的单核苷酸多态性位点的序列。

5.根据权利要求4所述的一种用于预测冠心病发病风险的试剂盒，其特征在于，还包括：用于扩增所述的组合的单核苷酸多态性位点的序列的特异性引物，所述特异性引物基于所述单核苷酸多态性位点的序列设计得到。

6.根据权利要求4所述的一种用于预测冠心病发病风险的试剂盒，其特征在于，还包括，用于采用所述特异性引物进行PCR的常规试剂，和/或，进行MassARRAY核酸测序技术的常规试剂。

7.根据权利要求4或5所述的一种用于预测冠心病发病风险的试剂盒，其特征在于，所述预测指采用所述特异性引物，并基于MassARRAY核酸测序技术对受试者DNA样品进行检测。

8.根据权利要求6所述的一种用于预测冠心病发病风险的试剂盒，其特征在于，所述检测包括如下步骤：

(1)利用权利要求1所述的特异性引物对受试者基因组DNA进行超多重PCR扩增；

(2)对步骤(1)得到的扩增产物利用虾碱性磷酸酶去除扩增反应后剩余的核酸碱基；

(3)对步骤(2)得到的产物进行单碱基延伸反应(EXTEND)

(4)对步骤(3)得到的产物进行树脂纯化；

(5)对步骤(4)得到的纯化产物芯片点板及MassARRAY仪器检测质谱检测；

(6)对步骤(5)得到的结果使用Typer4.0软件的Typer Analyzer导出Onco CartaReport，获得检测结果；

(7)将步骤(6)获得的检测结果用下述公式进行计算得到总分：

S＝n1×X1+n2×X2+n3×X3+……+n303×X303(本发明的SNP位点组合中涉及的303个位点都需要进行测定计算)

上述公式中，S代表总分，n为各SNP位点的风险碱基的个数，X为该位点的加权系数；

每个SNP位点的风险碱基、加权系数如下表1所示，下表1中的风险碱基的作用在于，利用MassARRAY仪器自带的massarray系统对每个SNP位点进行检测可获知该位点风险碱基的个数，该风险碱基的个数即上述公式中的n，如果结果为带有一个碱基，则上面公式中对应的n为1，如果带有两个则n为2，不带有则n为0；

表1

表1每条序列中的N即等位基因碱基；

(8)根据步骤(7)得到的总分评估受试者冠心病风险，其中，总分小于等于20分为低风险，大于80分为高风险，大于20分小于等于80分为中等风险。

9.根据权利要求8所述的一种用于预测冠心病发病风险的试剂盒，其特征在于，所述受试者基因组DNA来自受试者的外周血、体液、组织器官样本。

10.一种用于预测冠心病发病风险的SNP芯片，其特征在于，包括权利要求1-3任一所述的组合，和/或，权利要求4-9任一所述的试剂盒。