CN104004852B - 一种基于荧光定量pcr检测cyp2a6全基因缺失的方法 - Google Patents

一种基于荧光定量pcr检测cyp2a6全基因缺失的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于荧光定量PCR检测CYP2A6全基因缺失的方法，用于非疾病诊断目的。通过分别设计针对于CYP2A6基因和ALB基因的高特异性引物，利用荧光定量PCR技术来快速准确检测CYP2A6全基因缺失的方法。其中，针对CYP2A6的引物探针组合为:Fp:5’-TCCCACCCTACTCCCTCTCTC-3’；Rp:5’-GGAGGTGAACGCGGGA-3’；Probe:5’-FAM-TGGAGACAGGCCAGGGGGCG-BHQ2-3’。

Description

一种基于荧光定量PCR检测CYP2A6全基因缺失的方法
技术领域
本发明涉及一种检测CYP2A6全基因缺失的方法。
背景技术
CYP2A6基因是人细胞色素P450基因超家族的一员，其编码的蛋白为一种重要的代谢酶，参与多种药物及有毒化合物在人体内的代谢。CYP2A6基因在人群中表现出广泛的多态性，其中CYP2A6全基因缺失在中国人群中的发生频率为5％-15％。
替加氟以及以替加氟为主要活性成分的化合物是目前临床上应用最为广泛的抗嘧啶类药物，对消化道肿瘤及等多种实体瘤均有良好治疗效果。
大量研究表明，CYP2A6全基因缺失多态性与S-1和UFT等以替加氟为活性成分的药物的药效密切相关。未携带该多态性的患者相对于发生基因缺失的患者有更高的药物应答率和更长的生存时间。此外，CYP2A6全基因缺失多态性与人对尼古丁的依赖性(烟瘾)及多种癌症的易感性都有紧密的联系。
传统检测CYP2A6全基因缺失多态性的技术主要是PCR-凝胶电泳。这种方法成本低，重复性好，然而需要多次的PCR后处理，既操作复杂，又容易发生污染而产生假性结果。SmartPCR技术很大程度上弥补了PCR-凝胶电泳技术的不足之处，可以在短时间内检测出CYP2A6全基因纯合缺失，然而其无法检测出CYP2A6全基因杂合缺失的样本。
基于实时定量PCR技术对基因拷贝数进行定量的方法已成功应用于基因缺失的检测技术。其基本原理是设计一套引物探针组合来特异性扩增待检测的目的基因(靶基因)，同时设计一套引物探针组合来扩增一个在人基因组中保持拷贝数高度稳定的基因(内参基因)。在一次实时定量PCR反应中，同时对一个样本的靶基因和内参基因进行扩增，并通过二者的扩增指标(Ct值)，计算二者拷贝数的比例。在未发生基因缺失的情况(也未发生异常扩增)，靶基因和内参基因的拷贝数比例应该是1:1，即两种基因在基因组中均以正常二倍体的形式存在；而当靶基因发生杂合缺失的情况下，靶基因与内参基因的拷贝数比例应该是0.5:1，即内参基因以正常二倍体的形式存在，而靶基因则只呈现出单倍体的状态；而当靶基因发生纯合缺失时，扩增靶基因的引物探针组合不能产生扩增信号，而内参基因的扩增则正常。在进行样本检测时，只需将一个未发生基因缺失的样本作为对照(质控品)，则可以很清楚地判断待检测样本是否发生了基因缺失，以及该缺失是杂合状态还是纯合状态。
然而，该技术至今未见应用于CYP2A6全基因缺失的检测；其根本原因是CYP2A6基因与CYP2A7基因及CYP2A13基因具有非常高的序列同源性(90％以上)，因而设计一套适宜于荧光定量PCR反应高特异性扩增CYP2A6基因的引物探针组合十分困难。
发明内容
本发明提供一种基于荧光定量PCR检测CYP2A6全基因缺失的方法，通过分别设计针对于CYP2A6基因和白蛋白基因(ALB)的高特异性引物，利用荧光定量PCR技术来快速准确检测CYP2A6全基因缺失的方法。
为实现以上发明目的，本发明的技术方案如下。
该检测方法包括以下环节：
(1)基因特异性引物的设计
针对CYP2A6基因设计的序列特异性引物探针组合，序列如下:
Fp(上游引物):5’-TCCCACCCTACTCCCTCTCTC-3’
Rp(下游引物):5’-GGAGGTGAACGCGGGA-3’
Probe(探针):5’-FAM-TGGAGACAGGCCAGGGGGCG-BHQ2-3’
针对ALB基因设计的序列特异性引物探针组合，序列如下:
Fp(上游引物):5’-TGTTGCATGAGAAAACGCCA-3’
Rp(下游引物):5’-GTCGCCTGTTCACCAAGGAT-3’
Probe(探针):5’-HEX-AGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACA-BHQ2-3’
其中，FAM为6-carboxyfluorescein；HEX为6-carboxy-hexachlorofluorescein；BHQ2为BlackHoleQuencher-2
(2)模板的制备:提取待测样本的基因组DNA；
(3)实时定量PCR:针对环节(1)中的两种特异性引物，建立被测样本的检测体系：
以反应体系总量20μL计，在同一个反应体系中，加入CYP2A6基因特异性上游引物250nM-500nM、下游引物250nM-500nM、探针100nM-200nM、以及ALB基因特异性上游引物250nM-500nM、下游引物250nM-500nM、探针100nM-200nM、2×Mastermix10μL、被测样本基因组DNA约10-50ng，使用PCR等级的H2O补足体积20μL；
(4)结果判定:将配制好的各反应体系在荧光实时定量PCR仪上进行扩增，根据仪器给出的两基因的扩增指标(Ct值)来进行结果判定。
上述扩增过程的最佳扩增参数为：95℃，2～15min，不循环；95℃，5～10sec，60℃，20-30sec，68℃，20～30sec，共计35～40个循环。
对结果的判定分两种情况进行:
第一种情况，若样本在FAM通道和HEX通道均呈现正常扩增，则根据仪器给出的样本在两个通道的Ct值(FAM通道Ct值指代CYP2A6扩增，HEX通道Ct值指代ALB扩增)来判定该样本的基因型，计算公式如下:Ratio(S)＝2Ct(CYP2A6)-Ct(ALB)。同时将已通过可靠技术检测过确定为未携带CYP2A6全基因缺失多态性的样本作为质控品，参照上述Ratio(S)公式求得质控品两基因的拷贝数比例Ratio(C)，然后进一步求得待测样本Ratio(C):Ratio(S)的值，即为r值。
若r值范围在0.90～1.10范围内，则该样本未携带有CYP2A6全基因缺失多态性；
若r值范围在0.5～0.6范围内，则该样本为CYP2A6全基因杂合缺失。
第二种情况，若样本在FAM通道没有扩增，而在HEX通道扩增情况正常，则表明该样本中没有CYP2A6基因存在，即该样本的基因型为CYP2A6全基因纯合缺失；第二种情况实际上为第一种情况中的特殊例，即此时样本的Ratio(S)为无穷大，其r值为0。
相应的，本发明还提供一种用于荧光定量PCR检测CYP2A6全基因缺失的试剂盒，当中包括权利要求1中所述的针对CYP2A6基因设计的序列特异性引物探针组合、针对ALB基因设计的序列特异性引物探针组合、以及2×Mastermix和H2O。
具体以试剂盒中的试剂总量20μL计，各试剂的较佳用量分别为：CYP2A6基因特异性上游引物250nM-500nM、下游引物250nM-500nM、探针100nM-200nM、以及ALB基因特异性上游引物250nM-500nM、下游引物250nM-500nM、探针100nM-200nM、2×Mastermix10μL，H2O补足体积20μL。
本发明的有益效果如下：
1.简单易行。本发明中只需一个反应便可以准确检测出待测样本的CYP2A6全基因缺失情况。
2.避免假性结果产生。在本发明中，针对CYP2A6基因设计的特异性引物具有很高的序列特异性，可以完全消除CYP2A7基因及CYP2A13基因序列同源性对PCR反应的干扰；同时没有PCR后操作，避免了交叉污染，二者共同保证了检测的准确性，避免了假性结果的产生。
3.灵敏度高。在本发明中，只需10ng基因组DNA便可以进行准确的CYP2A6全基因缺失检测，相比于传统的技术，大大提高了检测的灵敏度。
4.节省耗材和时间。基于本实验中设计和PCR反应的特点，使得该方法可以很大程度上节省实验时间和耗材，检测过程只需要60min，整个实验也可以在4小时内全部完成。
附图说明
图1为本发明所设计的CYP2A6基因特异性及探针的示意图。
图2为本发明分别检测一例CYP2A6全基因纯合缺失样本和未携带CYP2A6全基因缺失多态性样本的结果图。
图3为本发明检测5个样本CYP2A6全基因缺失的结果图。
图4为本发明检测40例DNA样本CYP2A6全基因缺失所得到的统计结果。
具体实施方式
本发明提供一种基于荧光定量PCR快速准确检测CYP2A6全基因缺失的方法，即通过分别设计针对于CYP2A6基因和ALB(作为内参基因)的高特异性引物，利用荧光定量PCR技术来快速准确检测CYP2A6全基因缺失的方法。
请参阅图1所示,本发明所设计的CYP2A6基因的特异性引物及探针组合。我们利用CYP2A6基因与CYP2A7及CYP2A13基因序列上细微差别，基于引物3’末端序列决定其延伸效率的原理，设计出一套可以高特异性扩增CYP2A6基因的引物探针组合。利用该组合进行实时定量PCR，既可以高效的扩增出CYP2A6基因，又可以完全避免CYP2A7及CYP2A13基因对反应特异性的干扰。
该方法包括以下环节:
(1)基因特异性引物的设计:
针对CYP2A6基因设计的序列基因特异性引物探针组合，序列如下:
Fp(上游引物):5’-TCCCACCCTACTCCCTCTCTC-3’
Rp(下游引物):5’-GGAGGTGAACGCGGGA-3’
Probe(探针):5’-FAM-TGGAGACAGGCCAGGGGGCG-BHQ2-3’
针对ALB基因设计的序列基因特异性引物探针组合，序列如下:
Fp(上游引物):5’-TGTTGCATGAGAAAACGCCA-3’
Rp(下游引物):5’-GTCGCCTGTTCACCAAGGAT-3’
Probe(探针):5’-HEX-AGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACA-BHQ2-3’
其中，FAM为6-carboxyfluorescein；HEX为6-carboxy-hexachlorofluorescein；BHQ2为BlackHoleQuencher-2。
(2)模板的制备:提取待测样本的基因组DNA。
(3)实时定量PCR:针对步骤(1)中的两种特异性引物，建立被测样本的检测体系：
每个被测样本的反应体系为20μL。在同一个反应体系中，加入CYP2A6基因特异性上游引物250nM-500nM、下游引物250nM-500nM、探针100nM-200nM、加入ALB基因特异性上游引物250nM-500nM、下游引物250nM-500nM、探针100nM-200nM、2×Mastermix10μL、被测样本基因组DNA约10-50ng，使用PCR等级的H2O补足体积20μL；
(4)结果判定:将配制好的各反应体系在荧光实时定量PCR仪上进行扩增，扩增过程的参数为：95℃，2～15min，不循环；95℃，5～10sec，60℃，20-30sec，68℃，20～30sec，共计35～40个循环。根据仪器给出的两基因的扩增指标(Ct值)来进行结果判定。对结果的判断分两种情况进行:
第一种情况，若样本在FAM通道和HEX通道均呈现正常扩增，则根据仪器给出的样本在两个通道的Ct值(FAM通道Ct值指代CYP2A6扩增，HEX通道Ct值指代ALB扩增)来判定该样本的基因型，计算公式如下:Ratio(S)＝2Ct(CYP2A6)-Ct(ALB)。同时将已通过可靠技术检测过确定为未携带CYP2A6全基因缺失多态性的样本作为质控品，根据上述公式求得质控品两基因的拷贝数比例Ratio(C)，然后进一步求得待测样本Ratio(C):Ratio(S)的值，即为r值。
若r值范围在0.90～1.10范围内，则该样本未携带有CYP2A6全基因缺失多态性；
若r值范围在0.5～0.6范围内，则该样本为CYP2A6全基因杂合缺失。
第二种情况，若样本在FAM通道没有扩增，而在HEX通道扩增情况正常，则表明该样本中没有CYP2A6基因存在，即该样本的基因型为CYP2A6全基因纯合缺失；第二种情况实际上为第一种情况中的特殊例，即此时样本的Ratio(S)为无穷大，其r值为0。
请参阅图2所示，利用本发明所设计的检测反应体系，对一例已知基因型为CYP2A6全基因纯合缺失的样本和一例未携带有CYP2A6全基因缺失多态性的样本进行检测。从图中可以清晰的看出，CYP2A6全基因纯合缺失的样本在FAM通道没有扩增，而在HEX通道的呈现出正常的扩增情况；而未携带有CYP2A6全基因缺失多态性的样本则在FAM和HEX两个通道均呈现正常的扩增情况。
请参阅图3所示，利用本发明所设计的体系，对5例已知基因型的样本进行验证，其中编号2、3、4、5的样本未携带CYP2A6全基因缺失(其中2号样本作为质控品)，而编号1的样本为CYP2A6全基因杂合缺失。从实验结果中可以清楚看到，本发明所建立的方法可以准确的区别未携带CYP2A6全基因缺失多态性的样本和CYP2A6全基因杂合缺失的样本。
请参阅图4所示，利用本发明对40例已知基因型的DNA样本进行检测，其中35例为未携带CYP2A6全基因缺失多态性的样本，4例为CYP2A6全基因杂合缺失的样本，1例为CYP2A6全基因纯合缺失的样本。本发明检测结果与实际基因型完全符合，其中4例CYP2A6全基因杂合缺失的样本的r值为0.53-0.56，而35例未携带CYP2A6全基因缺失多态性的样本r值为0.91-1.10。

Claims (4)

1.一种基于荧光定量PCR检测CYP2A6全基因缺失的方法，用于非疾病诊断目的，包括以下环节：
(1)基因特异性引物的设计:
针对CYP2A6基因设计的序列特异性引物探针组合，序列如下:
上游引物:5’-TCCCACCCTACTCCCTCTCTC-3’
下游引物:5’-GGAGGTGAACGCGGGA-3’
探针:5’-FAM-TGGAGACAGGCCAGGGGGCG-BHQ2-3’
针对ALB基因设计的序列特异性引物探针组合，序列如下:
上游引物:5’-TGTTGCATGAGAAAACGCCA-3’
下游引物:5’-GTCGCCTGTTCACCAAGGAT-3’
探针:5’-HEX-AGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACA-BHQ2-3’
其中，FAM为6-羧基荧光素；HEX为6-羧基六氯荧光素；
(2)模板的制备:提取待测样本的基因组DNA；
(3)实时定量PCR:
以反应体系总量20μL计，在同一个反应体系中，加入CYP2A6基因特异性上游引物250nM-500nM、下游引物250nM-500nM、探针100nM-200nM、以及ALB基因特异性上游引物250nM-500nM、下游引物250nM-500nM、探针100nM-200nM、2×Mastermix10μL、待测样本的基因组DNA10-50ng，H2O补足体积20μL；
(4)结果判定:将配制好的反应体系在荧光实时定量PCR仪上进行扩增，根据仪器给出的两基因的扩增指标进行结果判定。
2.根据权利要求1所述的基于荧光定量PCR检测CYP2A6全基因缺失的方法，其特征在于，荧光实时定量PCR仪上进行的扩增过程的扩增参数为：95℃，2～15min，不循环；95℃，5～10sec，60℃，20-30sec，68℃，20～30sec，共计35～40个循环。
3.一种用于荧光定量PCR检测CYP2A6全基因缺失的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1中所述的针对CYP2A6基因设计的序列特异性引物探针组合、针对ALB基因设计的序列特异性引物探针组合、以及2×Mastermix和H2O。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：以试剂盒中的试剂总量20μL计，CYP2A6基因特异性上游引物250nM-500nM、下游引物250nM-500nM、探针100nM-200nM、以及ALB基因特异性上游引物250nM-500nM、下游引物250nM-500nM、探针100nM-200nM、2×Mastermix10μL，H2O补足体积20μL。
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