CN109234390A - 野生型特异性阻止探针、检测方法及其用途 - Google Patents

野生型特异性阻止探针、检测方法及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种野生型特异性阻止探针、检测方法及其用途，本发明的野生型特异性阻止探针结合多重PCR方法可以在存在大量野生型DNA情况下富集肿瘤驱动突变基因，能够一次性扩增多个驱动肿瘤突变基因，并且具有很低的检测阈值，具有高精确性、高敏感性、成本低、无创、省时、高通量和操作简便等优点，可用于临床高危人群的预警筛查，肿瘤病人的预测、判断预后及药物靶向治疗，直接可以应用到临床。

Description

野生型特异性阻止探针、检测方法及其用途
技术领域
本发明属于医学检测领域，具体涉及一种野生型特异性阻止探针、检测方法及其用途。
背景技术
基于人类基因组计划，一批人类疾病相关的基因被揭示，而这些人类疾病相关的基因被迅速应用于疾病的风险评估、预防、诊断和个体化治疗。近年来，随着新一代基因检测技术的发展和应用，更多的遗传病和恶性肿瘤的致病或易感基因得到检测，迄今为止，科学家已经发现了大约60个基因与临床用药及治疗效果有关。
肿瘤是世界人口死亡的一个主要原因，从2008-2030年，中国实际预计的肿瘤发病和死亡人数将持续增长。国际癌症研究中心(IARC)报告显示，2030年中国预计将有487万癌症新发病例，死亡病例达到360万，每年用于癌症患者的医疗费用近千亿元。传统的癌症治疗有手术、放化疗、介入治疗、免疫疗法等，据统计药物治疗在癌症患者人群中无效率高达75％，为了增加治疗的有效性，越来越多的靶向治疗用于治疗晚期癌症得的患者。临床实践证明靶向药物治疗比传统的化疗更有效。然而，由于肿瘤的异质性和肿瘤的克隆演变及自然选择的结果，几乎所有肿瘤对药物产生了耐药性。为了选择哪些病人能够从特定的药物治疗中受益或无效，靶向药物基因检测已成为不可缺少的工具。
在过去的10年中肿瘤靶向治疗已经取得了很大的进展。近年有人提出了驱动基因的概念，驱动基因是与肿瘤发生发展相关的重要基因，知道了肿瘤的驱动基因，便可以清楚哪些药物可以对抗它，而当驱动基因突变后，则原来可以对抗它的药物失去对其的敏感性。比如，检测KRAS基因突变可以判断药物维克替比治疗转移性大肠癌的治疗敏感性，而KRAS基因突变的病人用维克替比药物治疗是无效的。检测HER2基因可以指导乳腺癌病人用靶向药物赫赛丁的敏感性，若HER2蛋白或基因拷贝数增加，病人用赫赛丁是有效的。然而肿瘤细胞释放到外周血中的肿瘤游离DNA量非常少，而突变的驱动基因只占野生型DNA的0.1-1％，使得在大量野生型背景下检测低水平的肿瘤驱动突变基因存在技术上的挑战。为了富集基因组肿瘤驱动突变基因，几种优先富集驱动突变基因的技术已经被开发。相比全基因组测序，有针对性的测序覆盖的基因组区域的数量减少，并且可以显著增加肿瘤病人低水平的突变基因检测灵敏度。虽然几个基因检测方法已被应用，但上述的方法在检测驱动突变基因方面只能检测单一的突变基因，通量低，检测阀值高，扩增的突变基因产物无法进行高通量测序的缺陷。为此，本发明提供一种野生型特异性阻止探针以及检测方法以富集多个肿瘤驱动突变基因，检测阈值低，可以进行高通量测序，同时具有无创、简便、精确度及灵敏度均高等优点，可以直接用于临床肿瘤病人的筛查，诊断，判断药物的疗效及预后。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的检测突变基因技术存在只能检测单一的突变基因，通量低，检测阀值高，扩增的突变基因产物无法进行高通量测序等缺陷，从而提供一种野生型特异性阻止探针以及检测方法以富集多个肿瘤驱动突变基因，检测阈值低，可以进行高通量测序，同时具有无创、简便、检测阈值低、精确度及灵敏度均高等优点。
本发明提供了一种野生型特异性阻止探针，所述探针的结构包括：
1)与待测基因野生型等位基因特异互补结合；
2)3’末端修饰有延伸阻断物；
3)长度为15-25个核苷酸。
所述的野生型特异性阻止探针，所述3’末端修饰有C3 spacer或Dideoxy-Cytosine(ddC)。
本发明提供了基于抑制野生型的多重PCR扩增反应体系，包括所述的野生型特异性阻止探针。
所述的多重PCR扩增反应体系，所述反应体系为25ul，包括：
待测基因组，5-10ng，1-10ul；
待测基因的PCR引物，浓度为0.1-0.3uM，2.5ul；
所述的野生型特异性阻止探针，2uM，2.5ul；
Q5高保真聚合酶，0.25U，0.25ul；
dNTPs，浓度为10mM，0.5ul；
ddH2O，补足至25ul。
本发明提供了基于抑制野生型的多重PCR反应试剂盒，包括所述的野生型特异性阻止探针和/或所述的基于抑制野生型的多重PCR扩增反应体系。
本发明提供了一种基于抑制野生型的多重PCR检测突变基因的方法，包括利用所述的野生型特异性阻止探针、所述的基于抑制野生型的多重PCR扩增反应体系和/或基于抑制野生型的多重PCR反应试剂盒对含有突变基因的待测基因组进行多重PCR扩增。
所述的方法，所述多重PCR反应的反应程序为：98℃变性30秒；98℃保持5秒，62℃保持30秒，72℃保持30秒，15个循环；最终72℃延伸5分。
所述的方法，还包括将多重PCR扩增获得的产物进行测序的步骤。优选的，选择Illumina高通量测序平台测序。
所述的方法，在测序步骤中的PCR扩增程序为：98℃变性30秒；98℃保持5秒钟,68℃保持120秒，15个循环；72℃延伸5分钟。
所述的野生型特异性阻止探针、所述的基于抑制野生型的多重PCR扩增反应体系和/或所述的基于抑制野生型的多重PCR反应试剂盒在用于检测突变基因产品的用途。优选的，所述的用途为在制备用于检测肿瘤驱动突变基因的用途。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明一种野生型特异性阻止探针，所述探针的结构包括：1)与待测基因野生型等位基因特异互补结合；2)3’末端修饰有延伸阻断物；3)长度为15-25个核苷酸；上述探针结构简单，省略了在其5’端修饰水解阻断物，容易制备，降低成本，且结合本发明的多重PCR扩增反应体系可以广泛应用于检测多个靶基因的多个突变位点，所述探针可以优先与野生型等位基因特异性互补结合，且所述探针的5’端不会被聚合酶降解，并保持较高的热稳定性，DNA核苷酸替换和野生型特异性阻止探针保持高的Tm值(比相应引物高约5℃)，阻碍野生型等位基因的扩增，从而降低甚至抑制野生型等位基因的扩增效率，而所述探针和突变基因之间碱基错配，防止了探针序列的退火，因此突变基因可以优先扩增，实现了突变基因的富集，提高了突变基因检测的灵敏度；
因此，所述的野生型特异性阻止探针结合多重PCR方法可以在存在大量野生型DNA情况下富集肿瘤驱动突变基因，能够一次性扩增多个驱动肿瘤突变基因，并且具有很低的检测阈值(样本中的等位突变基因频率最低可为4％)，具有高精确性、高敏感性、成本低、无创、省时、高通量和操作简便等优点，可用于临床高危人群的预警筛查，肿瘤病人的预测、判断预后及药物靶向治疗，直接可以应用到临床，可以应用于临床常用的经FDA批准的和靶向药物相关的基因的检测，或是热点区域为FDA批准的癌症类型出现频繁突变的区域，并且在科学文献中已经得到证实对治疗是有益的基因。
2.本发明所述的基于抑制野生型的多重PCR扩增反应体系，所述反应体系为25ul，包括：待测基因组，5-10ng，1-10ul；待测基因的PCR引物，浓度为0.1-0.3uM，2.5ul；所述的野生型特异性阻止探针，2uM，2.5ul；Q5高保真聚合酶，0.25U，0.25ul；dNTPs，浓度为10mM，0.5ul；ddH2O，补足至25ul；利用上述的多重PCR扩增反应体系进行多重PCR可以在存在大量野生型DNA情况下富集突变基因，且能够一次性扩增多个突变基因，并使得扩增的等位突变基因频率能够达到≥5％，满足高通量测序的要求，尤其是对于二代测序来说，二代测序的检测等位突变基因的频率一般为≥5％，如Illumina高通量测序平台，进而可以结合高通量测序平台，实现等位突变基因的高通量测序，同时具有高敏感性和精确性。
3.本发明所述的一种基于抑制野生型的多重PCR检测突变基因的方法，包括利用所述的野生型特异性阻止探针、所述的基于抑制野生型的多重PCR扩增反应体系和/或基于抑制野生型的多重PCR反应试剂盒对含有突变基因的待测基因组进行多重PCR扩增；上述方法可以在存在大量野生型DNA情况下富集突变基因，且能够一次性扩增多个突变基因，实现等位突变基因的高通量测序，同时具有高敏感性和精确性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例2中的应用数字PCR方法检测BRAF_V600E和EGFR_G719S的检测结果；
图2是本发明实施例4中DNA样本1测序结果图；
图3是本发明实施例5中突变等位基因频率和标准DNA突变频率的关系图；
图4是本发明实施例6中使用不同浓度的探针进行多重PCR扩增后的产物进行电泳结果；
图5是本发明实施例6中使用不同浓度的探针突变等位基因读数。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的探针和引物均由Integrated DNA Technologies(IDT)合成。
实施例1
1)样本的来源
选取7个标准的DNA样本(7个DNA样本的名称分别是TRU-Q NGS DNA 1,TRU-Q NGSDNA 2,TRU-Q NGS DNA 3,TRU-Q NGS DNA 4,mixture of TRU-Q NGS DNA 1+2(TRU-Q NGSDNA 1和TRU-Q NGS DNA 2的混合),mixture of TRU-Q NGS DNA 3+4(TRU-Q NGS DNA 3和TRU-Q NGS DNA 42的混合),mixture of TRU-Q NGS DNA 1+4(TRU-Q NGS DNA 1和TRU-QNGS DNA 4的混合)，上述样本依次简称为样本1、样本2、……样本7，下同)均购自于HorizonDiagnostics(Columbus,GA)公司。Tru-Q NGS DNA参考标准包含基因组DNA中多个不同频率的常见突变基因，DNA浓度为3.6ng/ul。DNA样本的突变信息为(每个DNA样本的突变信息包括至少一种以下突变信息)(BRAF_Exon15,EGFR_Exon18,EGFR_Exon19,EGFR_Exon20_1,EGFR_Exon20_2,EGFR_Exon21,IDH1_Exon4,IDH2_Exon4_1,IDH2_Exon4_2,KIT_Exon7,KIT_Exon11,KIT_Exon13,KIT_Exon17,KRAS_Exon2,KRAS_Exon3,NRAS_Exon2,NRAS_Exon3,PDGFRA_Exon12,PDGFRA_Exon13,PDFRA_Exon18)。
2)野生型特异性阻止探针及引物的设计与合成
根据步骤1)中的7个DNA样本的突变信息分别利用FastPCR软件(Primer DigitalLtd)设计引物，保证采用上述引物进行扩增时的产物大小为80-120bp，所述引物序列如SEQID NO：1-40所示，其中SEQ ID NO：1-2分别为BRAF_Exon15的正向引物和反向引物，SEQ IDNO：3-4分别为KRAS_Exon2的正向引物和反向引物，SEQ ID NO：5-6分别为KRAS_Exon3的正向引物和反向引物，SEQ ID NO：7-8分别为EGFR_Exon20_1的正向引物和反向引物，SEQ IDNO：9-10分别为EGFR_Exon20_2的正向引物和反向引物，SEQ ID NO：11-12分别为EGFR_Exon21的正向引物和反向引物，SEQ ID NO：13-14分别为EGFR_Exon19的正向引物和反向引物，SEQ ID NO：15-16分别为EGFR_Exon18的正向引物和反向引物，SEQ ID NO：17-18分别为NRAS_Exon2的正向引物和反向引物，SEQ ID NO：19-20分别为NRAS_Exon3的正向引物和反向引物，SEQ ID NO：21-22分别为IDH2_Exon4_1的正向引物和反向引物，SEQ ID NO：23-24分别为IDH2_Exon4_2的正向引物和反向引物，SEQ ID NO：25-26分别为IDH1_Exon4的正向引物和反向引物，SEQ ID NO：27-28分别为PDGFRA_Exon12的正向引物和反向引物，SEQ IDNO：29-30分别为PDGFRA_Exon13的正向引物和反向引物，SEQ ID NO：31-32分别为PDFRA_Exon18的正向引物和反向引物，SEQ ID NO：33-34分别为KIT_Exon11的正向引物和反向引物，SEQ ID NO：35-36分别为KIT_Exon13的正向引物和反向引物，SEQ ID NO：37-38分别为KIT_Exon17的正向引物和反向引物，SEQ ID NO：39-40分别为KIT_Exon7的正向引物和反向引物。上述引物序列见下表1
表1.引物序列
野生型特异性阻止探针根据7个DNA样本设计，所述野生型特异性阻止探针与7个DNA样本的野生型等位基因互补结合，并且在所述野生型特异性阻止探针上的3’末端设计有C3-spacer或Dideoxy-Cytosine以阻止引物延伸，在本实施例中选择Dideoxy-Cytosine(由Integrated DNA Technologies(IDT)提供并设计合成探针)，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：41-48所示，所述探针核苷酸序列见下表2。
表2.探针序列
3)多重PCR反应
以步骤1)中的7个DNA样本为待测基因组，利用步骤2)中设计的野生型特异性阻止探针及引物进行多重PCR反应，所述的多重PCR扩增反应体系为25ul，如下：
待测基因组(步骤1)中的7个DNA样本)，每个样本为7.2ng，2ul；
待测基因组的PCR引物，每个引物浓度为0.1-0.3uM，2.5ul；
所述的野生型特异性阻止探针，2uM，2.5ul；
Q5高保真聚合酶(由新英格兰生物学实验室,伊普斯维奇,MA提供)，0.25U，0.25ul；
dNTPs，浓度为10mM，0.5ul；
ddH2O，补足至25ul。
所述多重PCR反应程序如下：98℃变性30秒；98℃保持5秒，62℃保持30秒，72℃保持30秒，15个循环；最终72℃延伸5分钟。
4)测序
将步骤3)中所得到的PCR扩增产物进行纯化，在本实施例中选择采用AMPure珠子(由贝克曼库尔特，Brea，CA)纯化PCR产物，AMPure珠子与PCR产物按照体积比2:1混合后纯化，然后进行测序，在本实施例中选择Illumina高通量测序平台测序，首先采用Illuminaindex引物序列(由IDT公司提供)将纯化后PCR产物再次扩增，扩增体系为：25ul,包括：10ulPCR产物，2.5ul Illumina index引物(浓度为10uM)，0.25ul Q5高保真聚合酶(由新英格兰生物学实验室,伊普斯维奇,MA提供)，0.5ul dNTPs(浓度为10mM)；PCR扩增程序为：98℃变性30秒；98℃保持5秒钟,68℃保持120秒，15个循环；72℃延伸5分钟。将上述扩增得到的文库按照文库与AMPure珠子的体积比为1:1的比例混合纯化。所有的文库通过KAPA文库定量试剂盒(KAPA Biosystems,Wilmington,MA)定量。所有的文库混合送Illumina高通量测序平台测序，测序结果应用Lasergene基因组分析软件汇集和分析(DNASTAR,Inc.Madison,MI)。测序结果见下表3，其中Clinical Sample 1-5由分子诊断实验室(美国)(MolecularDiagnostic Lab in USA)提供，其中没有突变基因，按照上述样本1-7的基于抑制野生型的多重PCR检测突变基因的方法实施。
表3.测序结果
实施例2
本实施例采用数字PCR方法验证实施例1中的测序结果的准确性应用数字PCR方法检测样本3和样本4中的BRAF_V600E(Assay ID:Hs000000004_rm，目标基因序列为ATGGGACCCACTCCATCGAGATTTC[T/A]CTGTAGCTAGACCAAAATCACCTAT，其中的“[T/A]”表示当该核苷酸为T时为野生型基因，当核苷酸为A时为突变基因。)和EGFR_G719S(Assay ID:Hs000000030_rm，目标基因序列为TGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTG[G/A]GCTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTA，其中的“[G/A]”表示当该核苷酸为G时为野生型基因，当核苷酸为A时为突变基因。)，反应体系为：16ul，包括：基因组DNA，3ng；数字PCR混合液，8.0ul；TaqMan wildtype probe，0.8ul；mutant probe，0.8ul。上述反应体系由LifeTechnologies(USA)提供每份反应混合液装上数字PCR芯片在数字PCR标准条件下40个循环。收集末端荧光数据应用数字PCR在线数据分析系统分析。数字PCR应用QuantStudioTM3D数字PCR系统(由Life Technologies提供)。
应用数字PCR方法检测BRAF_V600E和EGFR_G719S的检测结果如图1所示，图1中左侧的图为样本3中的检测结果，右侧的图为样本4中的检测结果，结果显示V600E和G719S突变频率在样本3中分别占6.65％和16.5％，同样V600E和G719S突变频率在样本4中分别占7.66％和18.62％。应用数字PCR检测到的基因突变频率和测序结果一致。
实施例3
本实施例考察了实施例1中设计的引物的质量，按照标准PCR条件选择不同的退火温度52-65℃进行退火，具体步骤如下：
选择以实施例1中的步骤1)中的7个DNA样本为待测基因组，利用实施例1中的步骤2)中设计的引物进行多重PCR反应，所述的多重PCR扩增反应体系为25ul，如下：
待测基因组(实施例1步骤1)中的7个DNA样本)，每个样本为10ng，3ul；
待测基因的PCR上游引物，浓度为10uM，1.25ul；
待测基因的PCR上游引物，浓度为10uM，1.25ul；
5×Q5扩增缓冲液(由新英格兰生物学实验室,伊普斯维奇,MA提供)，5ul；
Q5高保真聚合酶(由新英格兰生物学实验室,伊普斯维奇,MA提供)，0.25U，0.25ul；
dNTPs，浓度为10mM，0.5ul；
ddH2O，补足至25ul。
所述多重PCR反应程序如下：98℃变性30秒；98℃保持5秒，52-65℃退火30秒，72℃保持30秒，35个循环；最终72℃延伸5分。
将上述PCR产物分别用2％琼脂糖凝胶电泳检测，测试每一对引物后定义普通PCR条件，然后根据每一对电泳结果调整每一对引物的浓度。根据每一对PCR扩增的强度大小混合20对引物，使得每对引物的扩增产物接近。最终将多重PCR的退火温度设定为62℃。
实施例4
本实施例考察了实施例1中的测序覆盖范围，具体如下：
按照实施例1中的方法检测DNA样本1(TRU-Q NGS DNA 1)，测序结果见附图2，由图中显示所有的样本均被成功的扩增，平均测序深度为11,347x(2,343～18,954)，最低测序深度为2,343读数，设定最低限度为5％突变基因检测。
实施例5
本实施例考察了实施例1中的方法是否可以检测下限突变等位基因频率5％的样本，具体如下：
本实施例设定检测结果下限突变等位基因频率为5％，将不符合标准的去除，通过筛查，在没有加探针的情况下应用实施例1中的多重PCR方法检测已知突变基因检测率为96.7％(85/88)，为了检查测序数据中是否遗漏已知的突变基因，在所有的目的区域序列中做了肉眼的对比分析，发现了3个未被筛选出来的突变等位基因，其频率均低于5％，占3.4％(3/88)。将检测结果下限等位基因频率设定为1％，在没有加探针的情况下应用实施例1中的多重PCR方法可以检测到88已知突变基因，分别在实施例1中的DNA样本2,4和6中遗漏了3个突变基因为(2个为KRAS G12V和1个NRAS Q61R)。然而，未检测到的突变基因在样本中频率低于4％，3个样本的测序深度低于10个读数。对比检测到的突变等位基因频率和提供标准DNA突变频率具有高度的一致性，见附图3，r＝0.87。
实施例6
本实施例为考察实施例1中设计的探针在抑制野生型DNA方面的效果，具体如下：
本实施例与实施例1基本相同，区别仅在于，在本实施例中将引物的浓度设定为1倍，加入的探针的浓度分别配制成1倍、2倍、10倍和20倍的浓度，经30个循环后进行测序，结果如图4所示，随着探针浓度的增加，目的条带有明显减弱的趋势。用上述方法检测了6个DNA样本1(图中Sample1)、2(图中Sample2)、4(图中Sample4)、6(图中Sample6)、7(图中Sample7)，当加入0倍或10倍浓度的探针时，突变等位基因读数见图5，由图中可以观察到当采用10倍探针浓度时突变等位基因读数增加了～2倍(1.47～3.37)。
由上述结果表明，利用本发明中的野生型特异性阻止探针结合多重PCR方法可以在存在大量野生型DNA情况下富集肿瘤驱动突变基因，能够一次性扩增多个驱动肿瘤突变基因，并且具有很低的检测阈值，具有高精确性、高敏感性、成本低、无创、省时、高通量和操作简便等优点，可用于临床高危人群的预警筛查，肿瘤病人的预测、判断预后及药物靶向治疗，直接可以应用到临床。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 刘红彦
<120> 野生型特异性阻止探针、检测方法及其用途
<130> HA201800039
<160> 48
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工合成(BRAF_Exon 15-F)
<400> 1
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgttcaaa ctgatgggac ccact 55
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工合成(BRAF_Exon 15-R)
<400> 2
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttatttc ttcatgaaga cctcacagta 60
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工合成(KRAS_Exon 2-F)
<400> 3
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctaatgatt ctgaattagc tgtatcgtca 60
<210> 4
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工合成(KRAS_Exon 2-R)
<400> 4
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgctgaa aatgactgaa tataaacttg 60
tggt 64
<210> 5
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工合成(KRAS_Exon 3-F)
<400> 5
acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttggcttt tacacaaaga aagccctc 58
<210> 6
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工合成(KRAS_Exon 3-R)
<400> 6
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcaagt agtaattgat ggagaaacct 60
gt 62
<210> 7
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工合成(EGFR_Exon 20-1-F)
<400> 7
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcacactg acgtgcctct ccc 53
<210> 8
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工合成(EGFR_Exon 20-1-R)
<400> 8
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttgaggc agatgcccag cagg 54
<210> 9
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工合成(EGFR_Exon 20-2-F)
<400> 9
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcacctcc accgtgcagc tca 53
<210> 10
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工合成(EGFR_Exon 20-2-R)
<400> 10
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcaatat tgtctttgtg ttcccggaca 60
<210> 11
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工合成(EGFR_Exon 21-F)
<400> 11
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgccagga acgtactggt gaa 53
<210> 12
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工合成(EGFR_Exon 21-R)
<400> 12
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttgcctc cttctgcatg gtattc 56
<210> 13
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工合成(EGFR_Exon 19-F)
<400> 13
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgtgagaa agttaaaatt cccgtcgc 58
<210> 14
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工合成(EGFR_Exon 19-R)
<400> 14
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcacagc aaagcagaaa ctcacat 57
<210> 15
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工合成(EGFR_Exon 18-F)
<400> 15
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctctcttga ggatcttgaa ggaaactg 58
<210> 16
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工合成(EGFR_Exon 18-R)
<400> 16
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcctgt gccagggacc ttac 54
<210> 17
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工合成(NRAS_Exon 2-F)
<400> 17
acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttctacaa agtggttctg gattagct 58
<210> 18
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工合成(NRAS_Exon 2-R)
<400> 18
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctctggtt tccaacaggt tcttgc 56
<210> 19
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工合成(NRAS_Exon 3-F)
<400> 19
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcgcctgt cctcatgtat tggtctc 57
<210> 20
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工合成(NRAS_Exon 3）
<400> 20
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaacaag tggttataga tggtgaaacc 60
t 61
<210> 21
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工合成(IDH2_Exon 4_1-F）
<400> 21
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgatgttt ttgcagatga tgggct 56
<210> 22
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工合成(IDH2_Exon 4_1-R）
<400> 22
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgtcctc acagagttca agctga 56
<210> 23
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工合成(IDH2_Exon 4_2-F）
<400> 23
acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttcccctc tccaccctgg ccta 54
<210> 24
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成(IDH2_Exon 4_2-R）
<400> 24
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctctgcaa aaacatccca cgcctagtc 59
<210> 25
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成(IDH1_Exon 4-F）
<400> 25
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgccaaca tgacttactt gatccccat 59
<210> 26
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成(IDH1_Exon 4-R）
<400> 26
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcaaaa atatcccccg gcttgtgag 59
<210> 27
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工合成(PDGFRA_Exon 12-F）
<400> 27
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctccgaggt atgaaattcg ctgga 55
<210> 28
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工合成(PDGFRA_Exon 12-R）
<400> 28
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcagctg catcgggtcc acata 55
<210> 29
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工合成(PDGFRA_Exon 13-F）
<400> 29
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgtctgaa ctgaagataa tgactcacct 60
<210> 30
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工合成(PDGFRA_Exon 13-R）
<400> 30
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagtgaa aatcctcact ccaggt 56
<210> 31
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工合成(PDGFRA_Exon 18-F）
<400> 31
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgtgaaga tctgtgactt tggcc 55
<210> 32
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工合成(PDGFRA_Exon 18-R）
<400> 32
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgggaag tgaggacgta cactgc 56
<210> 33
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工合成(KIT_Exon 11-F）
<400> 33
acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttccccac agaaacccat gtatga 56
<210> 34
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工合成(KIT_Exon 11-R）
<400> 34
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgtttct gggaaactcc catttgt 57
<210> 35
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工合成(KIT_Exon 13-F）
<400> 35
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgagtgcc catttgacag aacgg 55
<210> 36
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工合成(KIT_Exon 13-R）
<400> 36
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctatggtg caggctccaa gtag 54
<210> 37
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工合成(KIT_Exon 17-F）
<400> 37
acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttatcctc cttactcatg gtcgg 55
<210> 38
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工合成(KIT_Exon 17-R）
<400> 38
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcaagca gagaatgggt actcacg 57
<210> 39
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工合成(KIT_Exon 7-F）
<400> 39
acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttccagca ctctgacata tggcc 55
<210> 40
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工合成(KIT_Exon 7-R）
<400> 40
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttgggct ctgggaatcc tgct 54
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成(BRAF_600_p）
<400> 41
ctagctacag tgaaatctcg a 21
<210> 42
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成(KRAS_12-13_p）
<400> 42
tgcctacgcc accagctc 18
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成(KRAS_61_p）
<400> 43
gtactcctct tgacctgctg t 21
<210> 44
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成(EGFR_768_p）
<400> 44
gttgtccacg ctggccatc 19
<210> 45
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成(EGFR_790_p）
<400> 45
ctcatcacgc agctcatg 18
<210> 46
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成(EGFR_858-861_p）
<400> 46
ttgggctggc caaactgc 18
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(EGFR_747-759del_p）
<400> 47
agaagcaaca tctccgaaag 20
<210> 48
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成(EGFR_719_p）
<400> 48
caccggagcc cagcactt 18

Claims (10)

1.一种野生型特异性阻止探针，其特征在于，所述探针的结构包括：
1)与待测基因野生型等位基因特异互补结合；
2)3’末端修饰有延伸阻断物；
3)长度为15-25个核苷酸。
2.根据权利要求1所述的野生型特异性阻止探针，其特征在于，所述3’末端修饰有C3spacer或Dideoxy-Cytosine。
3.基于抑制野生型的多重PCR扩增反应体系，其特征在于，包括权利要求1-2任一项所述的野生型特异性阻止探针。
4.根据权利要求3所述的多重PCR扩增反应体系，其特征在于，所述反应体系为25ul，包括：
待测基因组，5-10ng，1-10ul；
待测基因的PCR引物，浓度为0.1-0.3uM，2.5ul；
权利要求1-2任一项所述的野生型特异性阻止探针，2uM，2.5ul；
Q5高保真聚合酶，0.25U，0.25ul；
dNTPs，浓度为10mM，0.5ul；
ddH2O，补足至25ul。
5.基于抑制野生型的多重PCR反应试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-2任一项所述的野生型特异性阻止探针和/或权利要求3-4任一项所述的基于抑制野生型的多重PCR扩增反应体系。
6.一种基于抑制野生型的多重PCR检测突变基因的方法，其特征在于，包括利用权利要求1-2任一项所述的野生型特异性阻止探针、权利要求3-4任一项所述的基于抑制野生型的多重PCR扩增反应体系和/或基于抑制野生型的多重PCR反应试剂盒对含有突变基因的待测基因组进行多重PCR扩增。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述多重PCR反应的反应程序为：98℃变性30秒；98℃保持5秒，62℃保持30秒，72℃保持30秒，15个循环；最终72℃延伸5分。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，还包括将多重PCR扩增获得的产物进行测序的步骤。优选的，选择Illumina高通量测序平台测序。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在测序步骤中的PCR扩增程序为：98℃变性30秒；98℃保持5秒钟,68℃保持120秒，15个循环；72℃延伸5分钟。
10.权利要求1-2任一项所述的野生型特异性阻止探针、权利要求3-4任一项所述的基于抑制野生型的多重PCR扩增反应体系和/或权利要求5所述的基于抑制野生型的多重PCR反应试剂盒在用于检测突变基因产品的用途。优选的，所述的用途为在制备用于检测肿瘤驱动突变基因的用途。
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