CN103695534A - 检测dhfr的c829t单核苷酸多态性的引物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了检测DHFR的C829T单核苷酸多态性的引物,其特征在于,所述引物包括特异性扩增引物SEQNO.1、SEQNO.2,其序列为:SEQNO.1:ACTAAGTGCTTCTCCAAGACC,SEQNO.2:Biotin-AATGTCAAGGACTGGCAAGAG。所述引物进一步还包括特异性测序引物SEQNO.3,其序列为:SEQNO.3:AGTCCCCAGCACCTG。本发明通过特异性引物扩增目的区域,并利用焦磷酸测序分析鉴定多态性,不但保证了一定的准确性及灵敏度,同时相对Sanger测序法具备了较短的检测周期,具有灵敏度高,操作简单、成本低等优点。
Description
本申请是申请号为201210331289.6、申请日2012年9月10日的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域,特别是一种DHFR的C829T单核苷酸多态性检测试剂盒,采用基因测序技术,可以对DHFR(C829T)多态性位点进行检测。
背景技术
骨髓抑制限制了多种化疗药物的应用,使之难以达到治愈或抑制肿瘤生长的效果,而一些耐药基因是产生骨髓抑制的分子基础,如二氢叶酸还原酶基因
(dihydrofolate reductase,DHFR)。
DHFR是细胞内叶酸代谢的关键酶,分子量为22KD。在还原型辅酶Ⅱ(NADPH)的参与下,DHFR能催化叶酸变成二氢叶酸,而后者为合成胸嘧啶核苷及嘌呤核苷输送了碳元素,因此DHFR是DNA、RNA及蛋白质等物质合成的其中一种关键酶。此外,DHFR也是抗代谢类抗肿瘤药物氨甲嘌呤(MTX)的靶酶。MTX是一种叶酸类似物,在临床上常用来治疗乳腺癌、急性白血病、淋巴瘤等多种肿瘤。其作用原理是通过竞争性与DHFR的活性位点紧密结合而使其失活,从而导致细胞中四氢叶酸含量下降,细胞DNA合成异常,造成细胞死亡。但是在治疗过程中一些肿瘤细胞很快对其产生耐药性,骨髓抑制的毒副作用也较严重、限制了其疗效。
DHFR基因的SNP是导致肿瘤细胞对MTX产生耐药的一种因素。虽然MTX 可以竞争性地抑制DHFR,但是当MTX和DHFR亲和力下降时,MTX抑制该酶的作用就会明显下降。诸多研究表明在一些耐药细胞中,由于DHFR基因中第829号核苷酸会发生T代替C的突变,即产生CC型(野生纯合型)、CT型(杂合型)、TT 型(突变纯合型)三种基因型,而后两者导致了DHFR蛋白质结构的改变,进而影响DHFR与MTX结合的空间结构,最终引起DHFR和MTX亲和力的下降,提高了细胞的抗药性。吴瑞琼等将含突变mDHFR的逆转录病毒上清转染脐血 CD34+细胞之后进行细胞抗MTX分析,结果发现转导mDHFR耐药基因的脐血干细胞集落形成数明显高于对照组,同时对MTX的抗性提高了约2倍。另有资 料显示将转导有人的突变mDHFR基因的小鼠骨髓移植到荷瘤小鼠后,再使用大剂量MTX治疗,结果表明转导有突变mDHFR基因的小鼠骨髓能耐受大剂量化 疗的冲击治疗,并使44%的小鼠肿瘤完全消退,而对照组小鼠全部死亡。终上所述,正是由于DHFR中一个氨基酸的改变从而使细胞具有对MTX的耐受性。
因此,检测肿瘤患者中DHFR(C829T)的基因型,有助于临床医生制定更具针对性的个体治疗方案,获得较佳效果的同时也减轻患者的经济与身体负担。
发明内容
本发明的目的在于,提供一种DHFR的C829T单核苷酸多态性检测试剂盒,可用于检测DHFR(C829T)位点是否发生突变。
一种DHFR的C829T单核苷酸多态性检测试剂盒,包括红细胞裂解液、DNA提取液、PCR试剂、单链纯化试剂和测序试剂,其特征在于:
PCR试剂包括特异性扩增引物SEQ NO.1、SEQ NO .2,其序列为:
SEQ NO.1:ACTAAGTGCTTCTCCAAGACC,
SEQ NO.2:Biotin- AATGTCAAGGACTGGCAAGAG;
测序试剂包括特异性测序引物SEQ NO.3,其序列为:
SEQ NO.3:AGTCCCCAGCACCTG。
进一步地,所述PCR试剂包括2*PCR Buffer、10mM dNTP、5U/μl Taq 酶、特异性扩增引物SEQ NO.1和SEQ NO .2、灭菌水;所述单链纯化试剂包括链亲和素包被的磁珠、70%(V/V)乙醇、变性液、1×Wash Buffer、结合缓冲液、退火缓冲液;所述测序试剂包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、底物APS、荧光素及dNTP。
所述试剂盒的使用方法包括如下步骤:
(1)提取样本中的DNA
(2)以DNA为模板,依据所述的特异性扩增引物(SEQ NO.1、SEQ NO.2)进行PCR扩增;
(3)将步骤(2)所得的PCR产物以所述的标记生物素的引物序列进行单链纯化;
(4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行测序;
(5)结果分析。
进一步地,步骤(2)的PCR反应按以下条件进行扩增:94℃ 2min预变性;98℃ 10s、58℃ 30s、68℃ 30s,40个循环;68℃ 5min。
步骤(3) 单链纯化的具体步骤为:将得到的50μl PCR产物与3μl 链亲和素包被的磁珠及47μl 结合缓冲液混合,室温孵育10~15min,期间震荡2~3次,然后使用Vaccuum prep tool 吸取磁珠,将带有磁珠的Vaccuum prep tool先后放进70%(V/V)乙醇、变性液、1×Wash Buffer中清洗10s左右,再将Vaccuum prep tool放入含有49μl 退火缓冲液及1μl 测序引物(SEQ NO3)的96孔板中,释放磁珠,将该96孔板放置于80℃ 2min,再冷却至室温,即得到测序反应所需的单链纯化产物。
步骤(5)结果分析的具体方法是将测序结果与标准序列对比,得到DHFR(C829T)位点的碱基类型。DHFR部分标准序列为:ACTCTTGTCTCTATCAGATA CCATTTATGAGACATTCTTGCTATAACTAAGTGCTTCTCCAAGACCCCAACTGAGTCCCCAGCACCTGCTA C AGTGAGCTGCCATTCCACACCCATCACATGTGGCACTCTTGCCAGTCCTTGACATTGTCGGGCTTTTCACATGTTGGTAATATTTAT。其中下划线部分为829位点。
本发明的有益效果:目前,对于检测DHFR(C829T)多态性的最可靠的方法就是进行测序,而本发明通过特异性引物扩增目的区域,并利用焦磷酸测序分析鉴定多态性。该方法不但保证了一定的准确性及灵敏度,同时相对Sanger测序法具备了较短的检测周期,具有灵敏度高,操作简单、成本低等优点。
附图说明
图1是样本A测序图。测序结果为:CTA C AGTGAG,该样本是CC型(野生型),图中红框部分是样本A基因型的判断区。
图2是样本B测序图。测序结果为:CTA C(T) AGTGAG,该样本是CT型(杂合型),图中红框部分是样本B基因型的判断区。
图3是样本C测序图。测序结果为:CTA T AGTGAG,该样本是TT型(突变纯合型),图中红框部分是样本C基因型的判断区。
图4~6分别是样本A、B、C的sanger测序图谱。目的是为验证图1~3的结果,最终发现两种测序检测结果一致。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应当注意的是,实施例中未说明的常规条件和方法,通常按照所属领域实验人员常规采用方法:譬如,奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版,或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
检测DHFR的C829T单核苷酸多态性检测试剂盒,包括红细胞裂解液、DNA提取液、PCR试剂、单链纯化试剂和测序试剂,其中:
(i) PCR扩增试剂:2*PCR Buffer、10mM dNTP、5U/μl Taq 酶、扩增引物(SEQ NO.1、SEQ NO. 2)及灭菌水;SEQ NO1、SEQ NO 2的序列为:
SEQ NO.1:ACTAAGTGCTTCTCCAAGACC,
SEQ NO.2:Biotin- AATGTCAAGGACTGGCAAGAG;
(ii) 单链纯化试剂:链亲和素bead、70%(V/V)乙醇、变性液、1×Wash Buffer、结合缓冲液、退火缓冲液;
(iii) 测序试剂:DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、底物APS、荧光素及dNTP(dNTP即dATP、dTTP、dCTP、dGTP)及测序引物(SEQ NO.3)。SEQ NO.3序列为:AGTCCCCAGCACCTG。
上述试剂盒的使用方法包括如下步骤:
(1)提取样本中的DNA
(2)以DNA为模板,依据所述的特异性扩增引物(SEQ NO.1、SEQ NO. 2)进行PCR扩增;
(3)将步骤(2)所得的PCR产物以所述的标记生物素的引物序列进行单链纯化;
(4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行测序;
(5)结果分析。
通过几百例临床受检样本用本试剂盒中的引物(SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.3)进行实时荧光定量PCR,发现其具有较高的扩增稳定性、特异性、灵敏度;同时使用Sanger测序法对相同的受检样本进行测序,结果两类方法的检测结果完全一致,说明本试剂盒具有极高的检测准确性。
实施例2:
本发明试剂盒的具体使用方法:
1、DNA提取
1) 抽取300μl 血液加入900μl 红细胞裂解液,颠倒混匀,室温放置5 分钟,期间再颠倒混匀几次。10000rpm离心1分钟(若离心机最高转速不允许,可3000rpm离心5min),吸去上清,留下白细胞沉淀,加200μl 缓冲液GA,振荡至彻底混匀。
2) 加入20 μl 蛋白酶K 溶液,混匀后加入200 μl 缓冲液GB,充分颠倒混匀,70℃放置10 分钟,溶液应变清亮,简短离心以去除管盖内壁的水珠。
3) 加人200 μl 无水乙醇,充分振荡混匀15 秒,此时可能会出现絮状沉淀,简短离心以去除管盖内壁的水珠。
4) 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3 中(吸附柱放入收集管中),12,000 rpm (13,400×g)离心30 秒,倒掉废液,将吸附柱CB3 放回收集管中。
5) 向吸附柱CB3 中加入500 μl 缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12,000 rpm (13,400×g)离心30 秒,倒掉废液,将吸附柱CB3 放入收集管中。
6) 向吸附柱CB3 中加入700 μl 漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12,000 rpm (13,400×g)离心30 秒,倒掉废液,将吸附柱CB3 放入收集管中。
7) 向吸附柱CB3 中加入500 μl 漂洗液PW,12,000 rpm (13,400×g)离心30秒,倒掉废液。
8) 将吸附柱CB3 放回收集管中,12,000 rpm(13,400×g)离心2 分钟,倒掉废液。将吸附柱CB3 置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
9) 将吸附柱CB3 转入一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl 洗脱缓冲液TE,室温放置2-5 分钟,12,000 rpm (13,400×g)离心2 分钟,将溶液收集到离心管中。
2、PCR扩增
一例样本的总PCR体系为50μl :2*PCR Buffer 25μl 、10mM dNTP 10μl 、引物SEQ NO.1和SEQ NO.2各1.75μl 、5U/μl Taq 酶 1μl 、灭菌水9μl 、DNA模板2.5μl 。
PCR反应程序:94℃ 2min预变性;98℃ 10s,58℃ 30s,68℃ 30s,38个循环;68℃ 5min。
3、单链纯化
将得到的50μl PCR产物与3μl 链亲和素磁珠(bead)及47μl 结合缓冲液混合,室温孵育10~15min,期间震荡2~3次,以免bead下沉。然后使用Vaccuum prep workstation 中的Vaccuum prep tool 吸取bead,将带有bead的Vaccuum prep tool先后放进70%(V/V)乙醇、变性液(Denaturation Solution)、1×Wash Buffer中清洗10s左右,再将Vaccuum prep tool放入含有49μl 退火缓冲液及1μl 测序引物(SEQ NO3)的96孔板中,释放bead,将该96孔板放置于80℃ 2min,再冷却至室温,即得到测序反应所需的单链纯化产物。
4、结果分析。
具体方法为:测序结果与标准序列对比,得到DHFR(C829T)位点的碱基类型。DHFR部分标准序列为:ACTCTTGTCTCTATCAGATACCATTTATGAGACATTCTT GCTATAACTAAGTGCTTCTCCAAGACCCCAACTGAGTCCCCAGCACCTGCTA C AGTGAGCTGCCATTCCACACCCATCACATGTGGCACTCTTGCCAGTCCTTGACATTGTCGGGCTTTTCACATGTTGGTAATATTTAT。其中下划线部分为829位点。
实施例3
临床样品检测
取待检的临床样品A、B、C,按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。
PCR产物纯化后进行测序,将所得序列与标准序列比对,判断结果。
样品A的测序结果图如图1所示,测序结果为:CTA C AGTGAG,该样本是CC型(野生型),图中红框部分是样本A基因型的判断区。
样品B的测序结果图如图2所示,测序结果为:CTA C(T) AGTGAG,该样本是CT型(杂合型),图中红框部分是样本B基因型的判断区。
样品C的测序结果图如图3所示,测序结果为:CTA T AGTGAG,该样本是TT型(突变纯合型),图中红框部分是样本C基因型的判断区。
图4~6分别是样本A、B、C的sanger测序图谱。目的是为验证图1~3的结果,最终发现两种测序检测结果一致。
SEQUENCE LISTING
<110> 济南艾迪康医学检验中心有限公司
<120> 检测DHFR的C829T单核苷酸多态性的引物和方法
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
actaagtgct tctccaagac c 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aatgtcaagg actggcaaga g 21
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agtccccagc acctg 15
<210> 4
<211> 179
<212> DNA
<213> DHFR(C829T)
<400> 4
actcttgtct ctatcagata ccatttatga gacattcttg ctataactaa gtgcttctcc 60
aagaccccaa ctgagtcccc agcacctgct acagtgagct gccattccac acccatcaca 120
tgtggcactc ttgccagtcc ttgacattgt cgggcttttc acatgttggt aatatttat 179
Claims (5)
1.检测DHFR的C829T单核苷酸多态性的引物,其特征在于,所述引物包括特异性扩增引物SEQ NO.1、SEQ NO .2,其序列为:
SEQ NO.1:ACTAAGTGCTTCTCCAAGACC,
SEQ NO.2:Biotin- AATGTCAAGGACTGGCAAGAG。
2.如权利要求1所述的检测DHFR的C829T单核苷酸多态性的引物,其特征在于,所述引物还包括特异性测序引物SEQ NO.3,其序列为:
SEQ NO.3:AGTCCCCAGCACCTG。
3.检测DHFR的C829T单核苷酸多态性的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)提取样本中的DNA
(2)以DNA为模板,用特异性扩增引物(SEQ NO.1、SEQ NO.2)进行PCR扩增;
SEQ NO.1:ACTAAGTGCTTCTCCAAGACC,
SEQ NO.2:Biotin- AATGTCAAGGACTGGCAAGAG;
(3)将步骤(2)所得的PCR产物以所述的标记生物素的引物序列进行单链纯化;
(4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行测序,测序引物为SEQ NO.3;
SEQ NO.3:AGTCCCCAGCACCTG;
(5)结果分析。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,步骤(2)的PCR反应按以下条件进行扩增:94℃ 2min预变性;98℃ 10s、58℃ 30s、68℃ 30s,40个循环;68℃ 5min。
5.如权利要求3所述的方法,其特征在于,步骤(3) 单链纯化的具体步骤为:将得到的50ul PCR产物与3ul 链亲和素包被的磁珠及47ul 结合缓冲液混合,室温孵育10~15min,期间震荡2~3次,然后使用Vaccuum prep tool 吸取磁珠,将带有磁珠的Vaccuum prep tool先后放进70%(V/V)乙醇、变性液、1×Wash Buffer中清洗10s左右,再将Vaccuum prep tool放入含有49ul 退火缓冲液及1ul 测序引物(SEQ NO.3)的96孔板中,释放磁珠,将该96孔板放置于80℃ 2min,再冷却至室温,即得到测序反应所需的单链纯化产物。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107345243A (zh) * | 2016-10-12 | 2017-11-14 | 深圳市儿童医院 | 检测白血病二氢叶酸还原酶融合基因的方法、引物及试剂盒 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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CN102876779B (zh) | 2014-02-05 |
CN103695534B (zh) | 2016-02-24 |
CN102876779A (zh) | 2013-01-16 |
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