CN102382896A - Npm1基因突变检测方法及其试剂盒 - Google Patents

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Abstract

NPM1是一种广泛表达的磷蛋白质，其作用为在细胞核与细胞浆之间穿梭，可与ALK、RARα和MLF-1等形成融合基因，参与多种白血病或淋巴瘤的发病。NPM1基因突变诊断对AML的诊断及分型具有重要临床意义。本发明自行设计了PCR扩增引物和测序引物，并研制了一种检测范围广，检测费用低，检测灵敏度高的NPM1基因突变检测方法及其试剂盒。

Description

NPM1基因突变检测方法及其试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体是NPM1基因突变检测方法及其试剂盒。
背景技术
NPM1是一种广泛表达的磷蛋白质，其作用为在细胞核与细胞浆之间穿梭，可与ALK、RARα和MLF-1等形成融合基因，参与多种白血病或淋巴瘤的发病。近来，多项研究显示46-62％的正常核型AML患者存在NPM1基因的突变，成为正常核型AML患者最常见的基因突变，而在异常核型AML患者中也有25％以上存在NPM1突变(BLOOD.2006 107：4514-4523；BLOOD.2007 109：874-885)。目前，国际上有报道的NPM1突变类型有30种以上，其中最常见的类型为12号外显子发生4个碱基的重复导致蛋白C端结构改变，A型(TCTG插入)占接近80％，B型(CATG插入)占6％左右，D型(CCTG插入)占6％左右。携带NPM1突变的AML患者表现出NPM1蛋白异常的胞浆内分布(正常情况下分布于细胞核内)，多发生于女性，骨髓原始细胞比例、血LDH、白细胞及血小板计数高于野生型患者，其白血病细胞的CD34呈低表达或缺如。由于NPM1基因具有肿瘤抑制基因的功能，可调节p53信号通路，有学者推测NPM1基因的突变可影响p53信号并进而导致遗传学不稳定性，因此NPM1基因的突变使得AML细胞能够获得其它的遗传学改变。大约40％伴NPM1突变的AML患者可同时检测到FLT3-ITD，不伴有FLT3-ITD而携带NPM1突变(NPM11mut/FLT3-ITDneg)的患者治愈后良好。伴有NPM1突变的AML患者FLT3基因突变(包括ITD和点突变)的检出率大约是NPM1野生型AML患者的2倍。
NPM1基因突变诊断对AML的诊断及分型具有重要临床意义。2007年，美国国立综合癌症网络(NCCN)将NPM1突变诊断作为AML患者检查项目，对于NPM1突变患者具有不同的治疗方案。目前，国内还没有对NPM1基因进行一个大标本量的检测，传统的检测方法只能检测A、B、D即12号外显子发生4个碱基的重复导致蛋白C端结构改变的突变类型。
发明内容
本发明正是针对以上技术问题，自行设计了PCR扩增引物和测序引物，并研制了一种检测范围广，检测费用低，检测灵敏度高的NPM1基因突变检测方法及其试剂盒。
本发明通过以下技术方案来实现：
本发明提供NPM1基因突变检测方法，包括以下步骤：
(e)提取待检样本的DNA；
(f)用自行设计的用于检测NPM1基因12号外显子开放阅读框多种突变位点的扩增引物对步骤(a)中的待检样本DNA进行PCR扩增；
(g)用自行设计的用于检测NPM1基因12号外显子开放阅读框多种突变位点的测序引物对步骤(b)中扩增后的DNA进行测序；
(h)将步骤(c)中的测序结果与标准NPM1基因12号外显子开放阅读框进行比较，并进行序列分析，即可找出突变类型与突变位点。
本发明根据人5号染色体基因组序列登录号：NT_023133.13设计NPM1基因12号外显子开放阅读框相关引物如下，
NPM1基因12号外显子开放阅读框PCR扩增引物：
NPM1F：5’-TCGGGAGATGAAGTTGGAAGTA-3’(NT_023133.13：15648494～15648515)；
NPM1R：5’-CATTTATCAAACACGGTAGGGA-3’(NT_023133.13：15648943～15648964)；
NPM1基因12号外显子开放阅读框测序反应引物：
NPM1R2：5’-GGACAGCCAGATATCAACT-3’(NT_023133.13：15648899～15648917)。
本发明还提供NPM1基因突变检测试剂盒，包括：PCR AmplificationMixture；Primer(sense，antisense)、HotStarTaq酶、消化酶、SequencingMixture。
本发明提供的NPM1基因突变检测试剂盒采用HotStarTaq DNA Polymerase作为热启动酶，扩增反应体系为：每50μl中含5μl的10倍扩增缓冲液、2μl浓度为25mM的Mg2+、2μl浓度为10mM的dNTPs、1.5μl浓度为10μM的正向引物、1.5μl浓度为10μM的反向引物、0.3μl的Taq DNA聚合酶、1μl的DNA模板、余量为mH2O，测序反应体系为：4μl的BigdyeV3.1、3μl的mH2O、1μl浓度为10μM的Sequencing引物(F，R)、2μl的PCR产物。
本发明提供的NPM1基因突变检测试剂盒采用的扩增反应步骤为：先95℃反应15min，进入循环，循环中先94℃反应0.5min，然后56℃反应0.5min，然后72℃反应1min为一个循环，共反应35个循环然后72℃反应7min，最后4℃保存。
本发明提供的NPM1基因突变检测试剂盒采用的测序反应步骤为：先94℃反应0.5min，然后50℃反应0.5min，然后60℃反应2.0min为一个循环，共反应24个循环。
具体实施方式
下面以几例检测到的新型突变样本为例对本发明做进一步说明。
(a)提取待检样本的DNA；
(b)用自行设计的用于检测NPM1基因12号外显子开放阅读框多种突变位点的扩增引物对步骤(a)中的待检样本DNA进行PCR扩增；
(c)用自行设计的用于检测NPM1基因12号外显子开放阅读框多种突变位点的测序引物对步骤(b)中扩增后的DNA进行测序；
(d)将步骤(c)中的测序结果与标准NPM1基因12号外显子开放阅读框进行比较，并进行序列分析，共找出两种新型突变，根据基因登陆号NM_002520：一种新型突变为在1016与1017位碱基之间插入ATCC，且1021与1022位碱基从AG置换为CC突变。一种新型突变为在1022与1023位碱基之间插入AGCC，且1026-1028位碱基从AGG置换为CCC突变。此两种突变在国际国内上均属首次报道。
Figure ISA00000628583000011
Figure ISA00000628583000021

Claims (6)

1.本发明提供NPM1基因突变检测方法，包括以下步骤：
(a)提取待检样本的DNA；
(b)用自行设计的用于检测NPM1基因12号外显子开放阅读框多种突变位点的扩增引物对步骤(a)中的待检样本DNA进行PCR扩增；
(c)用自行设计的用于检测NPM1基因12号外显子开放阅读框多种突变位点的测序引物对步骤(b)中扩增后的DNA进行测序；
(d)将步骤(c)中的测序结果与标准NPM1基因12号外显子开放阅读框进行比较，并进行序列分析，即可找出突变类型与突变位点。
2.本发明根据人5号染色体基因组序列登录号：NT_023133.13设计NPM1基因12号外显子开放阅读框相关引物如下，
NPM1基因12号外显子开放阅读框PCR扩增引物：
NPM1F：5’-TCGGGAGATGAAGTTGGAAGTA-3’(NT_023133.13：15648494～15648515)；
NPM1R：5’-CATTTATCAAACACGGTAGGGA-3’(NT_023133.13：15648943～15648964)；
NPM1基因12号外显子开放阅读框测序反应引物：
NPM1R2：5’-GGACAGCCAGATATCAACT-3’(NT_023133.13：15648899～15648917)。
3.本发明还提供NPM1基因突变检测试剂盒，包括：PCR AmplificationMixture；Primer(sense，antisense)、HotStarTaq酶、消化酶、Sequencing Mixture。
4.根据权利要求3述NPM1基因突变检测试剂盒，其特征在于NPM1基因突变检测试剂盒采用HotStarTaq DNA Polymerase作为热启动酶，扩增反应体系为：每50μl中含5μl的10倍扩增缓冲液、2μl浓度为25mM的Mg2+、2μl浓度为10mM的dNTPs、1.5μl浓度为10μM的正向引物、1.5μl浓度为10μM的反向引物、0.3μl的Taq DNA聚合酶、1μl的DNA模板、余量为mH2O，测序反应体系为：4μl的BigdyeV3.1、3μl的mH2O、1μl浓度为10μM的Sequencing引物(F，R)、2μl的PCR产物。
5.根据权利要求3述NPM1基因突变检测试剂盒，其特征在于NPM1基因突变检测试剂盒采用的扩增反应步骤为：先95℃反应15min，进入循环，循环中先94℃反应0.5min，然后56℃反应0.5min，然后72℃反应1min为一个循环，共反应35个循环然后72℃反应7min，最后4℃保存。
6.根据权利要求3述NPM1基因突变检测试剂盒，其特征在于NPM1基因突变检测试剂盒采用的测序反应步骤为：先94。℃反应0.5min，然后50。℃反应0.5min，然后60。℃反应2.0min为一个循环，共反应24个循环。
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