CN103484539A - 一组用于早疫病原菌茄链格孢菌多样性分析的微卫星引物 - Google Patents

一组用于早疫病原菌茄链格孢菌多样性分析的微卫星引物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一组用于早疫病原菌茄链格孢菌多样性分析的微卫星引物，并提供了利用该组引物进行多样性及群体遗传结构分析的方法。该组引物是从基因组文库筛选设计的。该组引物PCR扩增产物稳定、多态性好，可用于多样性及群体遗传结构的分析。

Description

一组用于早疫病原菌茄链格孢菌多样性分析的微卫星引物
技术领域
本发明属于植物保护领域，具体涉及一组用于早疫病原菌茄链格孢菌多样性分析的微卫星引物，可应用于马铃薯早疫病原菌茄链格孢菌群体遗传多样性分析。 
背景技术
马铃薯是继水稻、小麦和玉米之后的世界第四大粮食作物，由茄链格孢菌（Alternaria solani Sorauer）引起的马铃薯早疫病在世界各地马铃薯种植区均有发生。早疫病菌在马铃薯生长期可反复多次侵染，以分生孢子形式在薯块或土壤中越冬。目前在我国某些地区有越来越严重的趋势，给当地马铃薯生产造成了巨大损失。 
微卫星DNA又称SSR(Simple sequence repeat)简单序列重复，是以几个碱基(一般为1-6个)为重复单位组成的简单串联重复序列，由核心序列和侧翼序列组成，其核心序列呈串联重复排列，由于重复单元的数目不同而使微卫星呈现出多态性。由于微卫星寡核苷酸的重复次数在同一物种的不同基因型间差异很大，因而SSR标记呈现出多态性。相对于其他标记, SSR标记共显性, 多态性高, 特别是具有分类学专化性等特点, 是植物病原菌的种类鉴定、无毒基因鉴定与作图、起源与进化、传播与流行研究等最理想的分子标记之一。 到目前为止，国际上还没有一套用以分析茄链格孢菌遗传结构的微卫星引物。 
发明内容
本发明的目的在于提供用于马铃薯早疫病原菌茄链格孢菌群体遗传多样性分析的微卫星引物，并进一步给出了应用该引物的PCR测定方法。 
一组用于早疫病原菌茄链格孢菌多样性分析的微卫星引物，其特征在于微卫星引物的核苷酸序列及指标参数如表1所示： 
表1茄链格孢菌微卫星引物及对应的指标参数
Figure 2013103854061100002DEST_PATH_IMAGE001
其中，所述的微卫星引物用于马铃薯早疫病菌茄链格孢菌群体遗传结构分析。包括以下步骤：基因组总DNA提取；PCR扩增；聚丙烯酰胺电泳检测；用popgen3.2进行等位基因数、有效等位基因数、基因多样性等分析。
本发明的优点是提供了一组应用于茄链格孢菌多样性分析的微卫星引物，具有PCR扩增结果稳定，多态性高等特点，有很好的应用价值。 
具体实施方式
以下为本发明的具体实施例，进一步说明本发明，但本发明不仅限于此。 
实施例1
1、引物合成：从早疫病原菌茄链格孢菌的基因组文库中筛选出多态性丰富的微卫星引物，应用DNA合成仪合成7对引物，序列如下：
Figure 710613DEST_PATH_IMAGE002
2、基因组总DNA提取：采用“植物基因组总DNA 快速提取试剂盒”购自BIOMIGA 公司，产品货号GD2611：具体操作参照产品说明书。
 1)       将茄链格孢菌菌株在新鲜培养基上培养，收集菌丝约100mg。 
 2)       取粉状干燥组织，放于研钵，加入950μL Buffer P1，常温下研磨至无明显颗粒状悬浮物。 
 3)       将研磨后混合液全部转移到2mL离心管，加入10μL β-巯基乙醇，瞬时涡旋后置于65℃水浴锅，水浴10min，期间颠倒混匀几次（如果需要去除RNA，在水浴前加入5μL RNase A）。 
 4)       加入140μL Buffer P2，涡旋震荡混匀。在13000rpm下离心10min。 
 5)       小心吸取上清至一新的2mL离心管中，避免吸起沉淀，加入0.5倍体积的P3混匀后，加入混合液0.5倍体积的无水乙醇，充分颠倒混匀。 
 6)       将一个DNA吸附柱插入2mL收集管，将样品液倒入吸附柱中，12000rpm下离心30s，倒掉废液，将吸附柱重新插入收集管。 
 7)       将吸附柱放入一个新的收集管中，加入650μL DNA Wash Buffer,12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱重新插入收集管。 
 8)       加入450μL DNA Wash Buffer漂洗，离心后倒掉废液，将吸附柱重新插入收集管中。 
 9)       13000rpm开盖离心1min。 
 10)    将吸附柱插入1.5mL离心管，先吸附柱中加入150μL Elution Buffer，室温静置2min。13000rpm离心1min洗脱DNA。 
 11)    收集DNA，-20℃保存。 
3、聚合酶链式反应（PCR) 
以提取的总DNA为模板，进行PCR扩增，反应体系包括：
Figure 715542DEST_PATH_IMAGE001
反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1 min，循环35次；72℃延伸5 min。PCR产物4℃保存。
聚丙烯酰胺电泳检测：2%预丙烯酰胺凝胶，上样量为1uL PCR产物和6×buffer的混合上样液，电泳缓冲液为0.5×TBE，150V恒压下电泳约5小时。 
银染：将胶块放入盛有300mL 0.1%AgNO3 溶液盘内浸泡15min，然后将胶块取出放入盛有400mL 2%NaOH + 2mL甲醛溶液的盘内，摇晃大约10~15min，充分染色至条带明显。 
结果分析：将获得的图谱每群体在所有的位点的条带构成一个01矩阵。用popgen3.2进行等位基因数、有效等位基因数、基因多样性等分析,参数信息见表2。 
表2  7个微卫星位点的相关信息 
Figure 440803DEST_PATH_IMAGE004
用本发明的引物对103个马铃薯早疫病菌茄链格孢菌基因组DNA进行扩增，遗传多样性分析结果表明每个微卫星位点的等位基因数目从3到14个不等，平均等位基因数目为5个，基因多样性的范围从0.11到0.87。由此说明，本发明的微卫星引物可以用于早疫病原菌茄链格孢菌多样性和群体遗传结构分析。
茄链格孢菌微卫星引物 
Figure 2013103854061100002DEST_PATH_IMAGE005

Claims (3)

1.一组用于早疫病原菌茄链格孢菌多样性分析的微卫星引物，其特征在于微卫星引物的核苷酸序列为：
PA1F：TATTTCAGCAGGGCAAATCC，PA1R：ATGGACTCCGTCACCTTGTC；
PA2F：CAATCGTGATGTCGTTACGG，PA2R：TCGCGCACTGTCTCTCTCTA；
PA3F：GACGTTCGCTTCAAACCATT，PA3R：AGTCAGCGTGGTTCTGACCT；
PA4F：AGCTGTGAGGGCAGCAGTAT，PA4R：TTCGGGTTGAAGTAACTGGC；
PA5F：CTCATCCAGCAGATTCGACA，PA5R：AAGGCTTGGGAAAGAGAGGA；
PA6F：CACTTCCCTACGCAGGTAGC，PA6R：TCGTCTCGCAATTACTCGTG；
PA7F：AGCTGTGAGGGCAGCAGTAT，PA7R：AGTCAGCGTGGTTCTGACCT。
2.根据权利要求1所述的一组用于早疫病原菌茄链格孢菌多样性分析的微卫星引物，其特征在于所述的微卫星引物的指标参数为：
引物PA1重复基序为（TGC）6，溶解温度Tm为58℃，扩增片段大小为190-202bp；
引物PA2重复基序为（GTC）9，溶解温度Tm为58℃，扩增片段大小为238-268bp；
引物PA3重复基序为（GTC）5，溶解温度Tm为58℃，扩增片段大小为189-195bp；
引物PA4重复基序为（GTC）5，溶解温度Tm为58℃，扩增片段大小为197-203bp；
引物PA5重复基序为（ATC）5，溶解温度Tm为60℃，扩增片段大小为235-253bp；
引物PA6重复基序为（CA）6，溶解温度Tm为58℃，扩增片段大小为218-224bp；
引物PA7重复基序为（GTC）5，溶解温度Tm为60℃，扩增片段大小为156-168bp。
3.根据权利要求1、2所述的一组用于早疫病原菌茄链格孢菌多样性分析的微卫星引物，其特征在于：该组微卫星引物用于马铃薯早疫病菌茄链格孢菌群体遗传结构分析。
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