CN103773860B - 异色瓢虫特异性coi引物、含有该引物的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

异色瓢虫特异性coi引物、含有该引物的试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及异色瓢虫特异性COI引物以及含有该引物的检测试剂盒，根据异色瓢虫特有的mtDNA序列，设计了一对异色瓢虫特异性COI引物HaF3和HaR3（SEQ？ID？No.1和2），该对引物仅对异色瓢虫具有特异性扩增能力，扩增产物大小为197bp，质粒浓度检出限为1.193285577E+04，DNA浓度检出限为0.01171875ng/μL。本发明采用PCR技术，提高了检测准确性，节约了检测时间，所述试剂盒产品适于基层推广应用。

Description

异色瓢虫特异性COI引物、含有该引物的试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及异色瓢虫特异性COI引物、含有该引物的试剂盒及其检测方法。
背景技术
异色瓢虫Harmonia axyridis(Pallas)是昆虫纲，鞘翅目，瓢虫科的一种昆虫。分布广泛，捕食多种蚜虫、蚧虫、木虱、蛾类的卵及小幼虫等。异色瓢虫飞行扩散能力强，可在很大范围内搜寻寄主，迅速控制蚜虫等小个体害虫的种群数量，是一种有效进行生物防治的物种。由于成虫寿命长、取食量大，释放后可立即发挥对目标害虫的控制作用，并且随着成虫产卵和幼虫的孵化，其控制作用越来越强。我国曾用异色瓢虫防治松树的主要害虫日本松干蚧，取得了良好的效果。但有报道称异色瓢虫贪婪且极具攻击性，在田间不仅取食目标害虫，还捕食其他自然天敌，在许多引进国家（如美国）成为对当地天敌产生威胁的入侵物种。
异色瓢虫捕食同营养级天敌的现象称为集团内捕食作用，该作用对农田生态系统中不同物种的种群动态以及对害虫生物防治效果产生复杂而巨大的影响。随着研究的深入，发现常规常规的肠道解剖、行为观察等传统研究方法无法准确评估瓢虫集团内瓢虫之间的捕食作用。目前，尚未建立异色瓢虫特异性检测方法；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术具有特异性强、灵敏度高、简便快速等特点，在物种鉴定领域占据重要地位。
发明内容
本发明的目的是提供异色瓢虫特异性COI引物、含有该引物的试剂盒及其检测方法。
为了实现本发明目的，本发明根据异色瓢虫的线粒体DNA序列，设计一对异色瓢虫特异性COI引物，其包括：
正向引物HaF3：5'-AATTGTTACAGCTCATGCT-3’
反向引物HaR3：5’-CCCCTATTTCTACGATTG-3’。
本发明还提供含有引物HaF3和HaR3的用于检测异色瓢虫的试剂盒。所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液等中的至少一种。优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
本发明还提供所述引物HaF3和HaR3，以及含有引物HaF3和HaR3的试剂盒在检测异色瓢虫中的应用。
本发明还提供一种异色瓢虫的特异性快速PCR检测方法，包括以下步骤：
1）提取样品DNA；
2）以步骤1）提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物HaF3和HaR3进行PCR扩增反应；
3）分析PCR产物。
PCR反应体系以20μL计为：
PCR反应条件为：94℃4分钟；94℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，共40个循环，不用延伸。
对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若出现大小为197bp的DNA扩增条带（SEQ ID No.3），则判定样品为异色瓢虫。
本发明根据GenBank中公布的异色瓢虫线粒体COI基因序列（Accession No.KC135950），设计一对特异性COI引物，该引物特异性强，只对异色瓢虫具有扩增能力，而对其近源种、属瓢虫以及其他昆虫无扩增产物。采用本发明提供的方法和引物检测异色瓢虫，准确性高，可扩增出197bp大小的片段。PCR检测技术操作简单、快速、高效，一般可在4个小时内完成检测（视检测样本数而定），且具有较高的灵敏度，质粒浓度检出限为1.193285577E+04，DNA浓度检出限为0.01171875ng/μL。本发明方法在异色瓢虫检测/监测方面具有很高的实用价值，所述试剂盒产品适于基层推广应用。
附图说明
图1为本发明实施例1中异色瓢虫特异性引物HaF3/HaR3的PCR检测结果；其中，M：DNA分子量标准2000bp ladder；1-114为表1中序号所对应昆虫的扩增结果，-为阴性对照。
图2为本发明实施例2中异色瓢虫特异性引物HaF3/HaR3的DNA浓度梯度检测结果；其中，M：DNA分子量标准5000bp ladder；1-16为模板DNA浓度3ng/μL依次2倍稀释浓度梯度；-为阴性对照。
图3为本发明实施例2中异色瓢虫特异性引物HaF3/HaR3的质粒浓度梯度检测结果；其中，M：DNA分子量标准2000bp ladder；1-7为模板质粒浓度1.193285577E+07依次10倍稀释浓度梯度；-为阴性对照。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1引物HaF3/HaR3对异色瓢虫的扩增效果
1、异色瓢虫基因组的制备
将单头异色瓢虫放入1.5mL离心管中将其磨碎，用TIANampGenomic DNA Kit血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）（天根生物有限公司，北京）提取单头瓢虫基因组。将DNA溶液储于-20℃备用，进行PCR扩增时吸取1μL溶液作为DNA模板。
2、合成检测异色瓢虫的特异性COI引物
特异性COI引物序列如下：
HaF3:5'-AATTGTTACAGCTCATGCT-3'（SEQ ID No.1）
HaR3:5'-CCCCTATTTCTACGATTG-3'（SEQ ID No.2）
3、PCR扩增
反应体系为20μL，包括：10×EasyTaq缓冲液2.0μL、dNTP（2.5mM）0.4μL、EasyTaq DNA聚合酶（5U/μL）0.2μL、正、反向引物（10μM）各0.4μL、模板DNA1.0μL、ddH2O15.6μL。
PCR扩增程序：94℃预变性4分钟；94℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，共40个循环，不必延伸。
4、PCR产物鉴定
取10μL PCR扩增产物，用1%琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后，于凝胶成像系统中，根据扩增产物的大小判定。
5、结果
利用引物HaF3/HaR3，以异色瓢虫DNA为模板，以常见瓢虫以及其他昆虫种类（见表1）为对照进行PCR扩增，结果如图1所示，5、6泳道对应的异色瓢虫扩增出了197bp的目的条带，说明本发明的引物特异性强。回收上述197bp的目的条带，进行测序，其序列如SEQ ID No.3所示。
表1引物特异性检测中所涉及的昆虫种类
实施例2引物HaF3/HaR3对异色瓢虫最低检出量的测定
1、异色瓢虫模板DNA的制备
按实施例1提取单头异色瓢虫基因组DNA，然后原模板溶液（DNA溶液浓度为3ng/μL）以2倍进行递减梯度稀释至检测不出条带，取1μL作为PCR扩增的模板，直接加到PCR反应体系中，反应体系同实施例1中的描述。
利用引物HaF3/HaR3做最低检出量的测定，以不同稀释倍数的异色瓢虫基因组DNA为模板进行PCR扩增，DNA浓度检出限为0.01171875ng/μL（图2）。
2、异色瓢虫质粒的制备
按实施案例1对异色瓢虫基因组DNA进行扩增，扩增完毕后用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。利用Axygen琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒回收PCR产物，PCR产物经胶回收后克隆于pEasy-T3载体上（按试剂盒说明操作），重组质粒转化Trans1-T1感受态细胞，然后涂布于含有Ampicillin/X-gal/IPTG的LB平板上，37℃倒置培养15小时。经蓝白斑筛选后，挑取10个阳性克隆在含Amp的LB液体培养基中培养过夜，第二天用Axygen质粒提取试剂盒提取质粒，然后提取的质粒以10倍进行递减梯度稀释至检测不出条带，取1μL作为PCR扩增的模板，直接加到PCR反应体系中，反应体系同实施例1中的描述。
利用引物HaF3/HaR3做最低检出量的测定，以不同稀释倍数的异色瓢虫质粒浓度进行PCR扩增，模板质粒浓度检出限（拷贝数）为1.193285577E+04（图3）。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.异色瓢虫特异性COI引物，其特征在于，其包括：
正向引物HaF3：5'-AATTGTTACAGCTCATGCT-3’
反向引物HaR3：5’-CCCCTATTTCTACGATTG-3’。
2.含有权利要求1所述引物的用于检测异色瓢虫的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的至少一种。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
5.权利要求1所述引物或权利要求2-4任一项所述试剂盒在检测异色瓢虫中的应用。
6.异色瓢虫的特异性PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）提取样品DNA；
2）以步骤1）提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物HaF3和HaR3进行PCR扩增反应；
3）分析PCR产物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，PCR反应体系以20μL计为：
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR反应条件为：94℃4分钟；94℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，共40个循环。
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