DE19821114A1 - Methode zur Identifizierung und Darstellung interindividueller DNA-Sequenzunterschiede - Google Patents
Methode zur Identifizierung und Darstellung interindividueller DNA-SequenzunterschiedeInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft eine Methode zur Identifizierung und Darstellung interindividueller DNA-Sequenzunterschiede. Sie ist dadurch gekennzeichnet, daß man DOLLAR A - die genomische DNA der zu untersuchenden Individuen isoliert, DOLLAR A - Segmente der zu vergleichenden Gene, genomischen Regionen, Genome definiert, DOLLAR A - diese Segmente mittels PCR unter Verwendung hochspezifischer Oligonukleotide gezielt isoliert und in einer ausreichenden Anzahl von Kopien herstellt. DOLLAR A - eine simultane Sequenzierung aller gewonnenen Gensegmente, die nun als PCR-Produkte vorliegen, durchführt, DOLLAR A - das dadurch entstehende Gemisch von Terminationsreaktionen, das die individuellen Sequenzen aller Gensegmente enthält, anschließend auf einem Sequenziergel elektrosphoretisch trennt und DOLLAR A - mittels direkter Transferelektrophorese auf eine Membran überträgt, DOLLAR A - anschließend durch Hybridisierung der Membran mit einem markierten, hochspezifischen Oligonukleotid die individuellen Sequenzen eines bestimmten Gensegmentes aus dem unsprünglichen Gemisch sichtbar macht, DOLLAR A diesen Vorgang so oft wiederholt, bis alle Gensegmente aus dem ursprünglichen Pool detektiert sind DOLLAR A - und anschließend durch Image-Analyse interindividuelle DNA-Sequenzunterschiede detektiert, und durch mathematische Aufarbeitung ein Genprofilmuster erstellt und auswertet.
Description
Die Erfindung betrifft eine Methode zur Identifizierung und Darstellung interindividueller
DNA-Sequenzunterschiede. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Molekularbiologie, die Medizin,
die Biologie die Veterinärmedizin, die Agrarwirtschaft und die Ökobiologie.
Nach der erstmaligen Sequenzierung eines menschlichen Referenzgenoms, die im Jahre 2005
abgeschlossen sein wird, nach der Dokumentierung gesamtgenomischer Sequenzen verschiedenster
Modellorganismen und Bakterien sowie der Sequenzierung aller Gene des Menschen und anderer
Species wird die vergleichende Untersuchung individueller genetischer und genomischer
Variabilität einer der Schwerpunkte der nächsten Ära der Genomforschung ("Postgenomics")
werden. Sie stellt eine "via regia" zur Erforschung von Gesamtgen- und Genomprofilen dar, die
instrumentell für die Identifizierung von Varianten bzw. Gensegmenten ist, die an der Pathogenese
von Erkrankungen beteiligt sind, und die Variabilität physiologischer und psychologischer
Merkmale mitbedingen. Es ist deshalb entscheidend, zum gegenwärtigen Zeitpunkt entsprechende
methodische Ansätze zu entwickeln, die die vergleichende Sequenzierung mit geringerem Aufwand
ermöglichen, und zugleich eine Ausgangsbasis für die zukünftige Entwicklung noch wesentlich
effizienterer Methoden schaffen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Methode der vergleichenden Sequenzierung von
DNA-Zielfragmenten als virtuelle Analyse-Einheiten von Genen und Genomen auf der Basis eines
Multiplexing-Prinzipes zu entwickeln.
Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert.
Diese Erfindung stellt eine Form der "targeted genome analysis" dar. Sie beruht auf dem
Grundprinzip der von Church und Kieffer-Higgins beschriebenen "Multiplex Sequenziermethode"
(EP 303 459), das für die de novo Sequenzierung genomischer Sequenzen ausgearbeitet ist.
Die erfindungsgemäße PCR-basierte Multiplex Sequenziermethode stellt jedoch konzeptionell und
inhaltlich eine vollkommene Neuentwicklung dar (vgl. Abb. 1 und Abb. 1b). Die
erfindungsgemäße Multipex-PCR-Sequenziermethode ist hingegen spezifisch für die
Identifizierung von Sequenzunterschieden in multiplen Kopien bekannter Sequenz konzipiert. Das
Verfahren zur Klonselektion, -amplifikation und Tagging ist vollkommen neu entwickelt worden.
Auch basiert die neue Methode nicht auf der Verwendung von Hybrid-DNA, die unerläßliche
Grundlage des Church-Verfahrens ist.
Die neue Methode konzentriert sich in dieser neudefinierten Form auf multiple, PCR-generierte
Kopien von definierten genomischen Zielregionen-/Kandidatengensegmenten, deren simultane
Sequenzierung in einem einzigen Sequenziervorgang stattfindet, auch die hochspezifische
Detektierung individueller Sequenzen ein- und desselben, definierten Segments aus einem Gemisch
multipler Reaktionen/segmentspezifischer Sequenzen, und auf die Identifizierung interindividueller
DNA-Sequenzunterschiede zwischen individuellen Genen durch Gruppierung basenspezifischer
individueller Terminationsreaktionen und Detektion von Sequenzunterschieden unmittelbar durch
visuelle Inspektion (vgl. Abb. 2). Eine hohe Qualität der "Images" und damit die Voraussetzung für
die Identifizierung von Sequenzunterschieden ist durch eine hohe Spezifität der Oligonukleotide
auf PCR-, Sequenzier-, und Detektionsebene gegeben. Der Gesamtvorgang der "Multiplex PCR
Sequenzierung" beinhaltet folgende methodische/technologische Segmente:
Basis für Multiplex-Sequenzierung ist nicht Hybrid-DNA, die ein beliebig fragmentiertes
genomisches DNA-Fragment enthält, sondern durch hochspezifische Oligonukleotide selektierte
DNA-Zielfragmente; "tags" sind nicht extern synthetisierte Oligos und Bestandteil des Vektors,
ebenso sind "sequencing primer hybridizing regions" nicht Bestandteil des Vektors, sondern
integraler Bestandteil des genomischen Zielfragmentes; DNA Sequenzinterpretation durch
Parallelisierung vielfacher individueller Terminationsreaktionen derselben Base zur unmittelbaren
Identifizierung von DNA Sequenzunterschieden als zusätzliche und fehlende Banden mittels
visueller Inspektion unmittelbar identifiziert werden (Abb. 2).
- a) Die Dissektion ("Zergliederung") eines Gens, Genoms, oder jeder genomischen Zielregion von Interesse in DNA-Segmente, die Templates für die Amplifizierung mittels PCR darstellen. Unterschiedliche Ansätze zur Aufteilung in DNA-Segmente/PCR-Fragmente sind a) overlapping design (Abb. 3), b) staggered design (Abb. 4), c) virtual dissection at the sequencing level (Abb. 5). Die Art der Zergliederung und damit der Multiplex-Faktor bzw. die Ausschöpfung der Kapazität der Methode steht in Zusammenhang mit der genomischen Organisation und Größe des Gens, der Anzahl sich nichtüberlappender Gensegmente und dem Umfang des geplanten Sequenziervorhabens (Anzahl der Gene bzw. Genome), sowie technischen Gesichtspunkten wie dem multifunktionalen Gebrauch von Oligonukleotiden als PCR-Primer, Sequenzierprimer, und "Probes".
- b) Die Amplifizierung multipler, N DNA-Segmente pro Individuum; diese kann separat für jedes Segment stattfinden (oder z. B. durch Amplifizierung großer Segmente, die mehrere Sequenziersegmente, auch virtuelle Gensegmente genannt, beinhalten, vgl. Abb. 5), oder simultan durch Multiplex PCR. Die Vereinigung multipler, N PCR-Produkte pro Individuum. Erzeugung multipler einsträngiger "Templates" mittels irreversibler Biotin-Streptavidin-Kopplung unter Verwendung von "magnetic beads" aus einem Gemisch von PCR-Produkten. Hier bestehen Modifikationsmöglichkeiten der Separierung der beiden DNA-Stränge; es könnten auch biotinylierte Terminationsreaktionen magnetisch separiert werden.
- c) Die Reinigung jedes PCR-Produktes ist möglich auf enzymatischem Wege, durch Säulen, Vakuumsysteme etc.; es kommen also unterschiedliche Reinigungsmethoden in Betracht.
- d) Die simultane Durchführung von multiplen, N Sequenzierreaktionen mittels Einsatz multipler, N Sequenzierprimer unterschiedlicher Nukleotidkomposition, die jeweils hochspezifisch an ein bestimmtes genomisches Fragment binden. Im Falle daß per Design dieselbe DNA-Sequenz zwei benachbarten PCR-Fragmenten gemeinsam sein sollte (d. h. daß der Sequenzierprimer zugleich an zwei benachbarte Fragmente binden könnte), wird die Konzentration der Sequenzierprimer verdoppelt (vgl. auch Abb. 3). Die Multiplex Sequenzierung erfolgt mittels der Dideoxy-Methode nach Sanger et al. (74 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 5463, 1977) unter Verwendung von T7/Mn für die Sequenzierung einsträngiger DNA, bzw. Thermosequenase für "cycle sequencing", hier Detektion sowohl eines oder beider Stränge; Alternative: multiplexing auf der Gelebene; Vereinigung individueller Sequenzierreaktionen, Auflösung der Terminationsreaktionsgemische auf dem Gel; ebenso als Möglichkeit "coupled amplification und genomic sequencing" zu integrieren.
- e) Die direkte Transferelektrophorese (DTE) der Gemische von Terminationsreaktionen auf einen festen Träger, eine Nylonmembran, mittels eines computer-gesteuerten Gradienten der Transfergeschwindigkeit, um einen adäquaten Bandenabstand zur Detektion von Sequenzunterschieden zu erreichen. Fixierung der DNA an die Membran mittels UV-Licht durch Interkalation.
- f) Die sukzessive Detektion multipler individueller DNA-Sequenzen der jeweiligen PCR-Segmente mittels hochspezifischer Sonden, die mit 32P-ATP endmarkiert ist, oder Chemilumineszenz. Die dem Sequenzierprimer unmittelbar benachbarte Nukleotidsequenz dient als "tag", als "probe hybridizing region"; durch Nichtüberlappung der "tag" Sequenz mit der Sequenzierprimersequenz wird die Detektion unspezifischer Sequenz durch "mispriming" vermieden, und damit Hintergrundrauschen, das mit der Variantendetektion interferieren könnte.
- g) "Image-Analyse durch Mustererkennung". Ein spezifisches Ladeschema, welches die basenspezifischen Terminationsreaktionen von je 12 Individuen als Block gruppiert, können DNA-Sequenzunterschiede unmittelbar durch zusätzliche und/oder fehlende Banden identifiziert werden.
Die Methode dient zur Erarbeitung von spezifischen Genprofilmustern, die eine genetische
Differenzierung für das Risiko von Erkrankungen bzw. für die Ausprägung phänotypischer
Merkmale jeder Art in jeder Species zuläßt, aus einer großen Menge von Sequenzdaten bzw.
Sequenzvarianten (z. B. auch "single nucleotide polymorphisms"). Als Ausgangspunkt dienen
entweder zwei Gruppen, bestehend aus Erkrankten und Gesunden, oder zwei bezüglich des
untersuchten phänotypischen Merkmals differente Gruppen einer Species. Da beispielsweise die
Varianten in DNA-Sequenzbereichen, die sowohl die regulierenden als auch die kodierenden
Bereiche eines Kandidatengens umfassen, statistisch abhängig sind, werden die aus den
Sequenzvarianten eines Gens oder aus den Varianten verschiedener Gene und sonstiger genetischer
Marker gebildeten Sequenzprofile in Form von Geno- und/oder Haplotypen simultan ausgewertet.
Mit steigender Anzahl von Varianten ergibt sich bei maximaler Auflösung der Variabilität auf
DNA-Sequenzebene eine in der Regel statistisch nicht mehr zur Vorhersage auswertbare große
Anzahl von verschiedenen Geno- bzw. Haplotypen. Das Verfahren zielt auf die Reduktion der
Anzahl dieser verschiedenen Geno- bzw. Haplotypen durch Bildung von Geno- oder
Haplotypklassen nach unterschiedlichen Ähnlichkeitskriterien (Abstand der Geno- bzw.
Haplotypen im n-dimensionalen Raum (bei n untersuchten Varianten), Anzahl und Art der
Variantenaustausche zwischen den einzelnen Geno- bzw. Haplotypen, phylogenetischer Abstand
etc.) mittels statistischer Klassifizierungs- oder Fuzzy-Methoden. Ausgehend von der Idee, daß sich
Geno- bzw. Haplotypen nicht unterscheiden lassen, wenn die Varianten für die Differenzierung des
untersuchten Merkmals bzw. Risikos irrelevant sind, wird zur Klassenbildung beispielsweise eine
hierachische Clusteranalyse benutzt und die Veränderungen der Häufigkeitsverteilungen der
Haplo- bzw. Genotypen der beiden differenten phänotypischen Gruppen hinsichtlich der Klasseneinteilung
von einem Schritt zum anderen ausgenutzt. Schrittweise werden die jeweils ähnlichsten Geno- bzw.
Haplotypen in Geno- bzw. Haplotypklassen zusammengefaßt. Jeder Schritt ist durch eine
spezifische Fehlerquadratsumme, die sich aus den Abweichungen aller Variablenwerte zu den
betreffenden Clustermittelwerten in allen Clustern ergibt, charakterisiert. Mittels eines χ2-Testes
wird in jedem Schritt überprüft, ob sich die Häufigkeiten der Geno- bzw. Haplotypen in den auf der
jeweiligen Stufe gebildeten Geno- bzw. Haplotypklassen zwischen den beiden zu untersuchenden
Gruppen signifikant voneinander unterscheiden. Das Verfahren wird fortgeführt, bis alle
Haplo- bzw. Genotypen in zwei Klassen zusammengefaßt worden sind. Unter Berücksichtigung der
schrittweisen Frequenzveränderungen werden die Schritte mit den größten signifikanten
Haplo- bzw. Genotypfrequenzunterschieden zwischen den beiden untersuchten Gruppen zur
Klasseneinteilung der Haplo- bzw. Genotypen ausgenutzt. Durch Vergleich der in den Klassen
zusammengefaßten Haplo- bzw. Genotypen (Consensusmuster der Klassen) werden die für das
Merkmal oder Risiko relevanten Varianten in Form von genetischen Consensusprofilen abgeleitet.
Existiert kein Schritt mit signifikanten Frequenzunterschieden, so kann keine Aussage getroffen
werden.
Gegeben seien 30 Personen, die an einer Erkrankung A leiden (Gruppe A der Erkrankten), und
weitere 30 Personen, die keine Anzeichen für Erkrankung A tragen (Gruppe G der Gesunden),
wobei sich die Gruppen hinsichtlich anderer Merkmale nicht signifikant unterscheiden mögen. Von
allen 60 Personen und deren Eltern seien die individuellen DNA-Sequenzen eines zu
untersuchenden Kandidatengens beispielsweise mittels Multiplex-Sequenzierung bestimmt. An 4
verschiedenen Sequenzpositionen P1, P2, P3 und P4 möge eine Mutation auftreten. Es soll geklärt
werden, ob spezifische Haplotypprofile existieren, die mit der Krankheit assoziiert sind.
Für jede Person aus den beiden Gruppen A und G seien die beiden individuellen Haplotypprofile,
die durch die Angabe des Vorkommens der Mutation an P1, P2, P3 und P4 bezüglich einer
Referenzsequenz vollständig bestimmt werden, gegeben.
Es mögen unter allen 60 Personen die folgenden 6 verschiedenen Haplotypprofile existieren
(1: Variante wie in der Referenzsequenz; 2: Variante trägt die jeweilige Mutation):
Zum besseren Verständnis der jetzt folgenden Auswertung, die bezüglich der hierarchischen
Clusteranalyse und der Auswertung von Kontingenztafeln mittels des kommerziellen
Statistikprogramm-Paketes SPSS für Windows NT, Version 7. 5 einschließlich der
EXACT-Module vorgenommen wurde, sind in der Anlage zum Beispiel Auszüge des Ausdrucks von SPSS
enthalten.
Zur Prüfung von Häufigkeitsunterschieden des Vorkommens dieser 6 verschiedenen Haplotypen
(VAR000O1 = Nummer des Haplotyps) in den Gruppen A (VAR0002 = 1) und G (VAR0002 = 2)
wurde ein χ2-Test durchgeführt. Nach dem exakten Test (p = 0,14) kann die Gleichheit der
Verteilungen nicht abgelehnt werden.
Zur Klassifizierung dieser 6 Haplotypen wird anschließend eine hierarchische Clusteranalyse
durchgeführt. Als Distanzmaß wurde in diesem Beispiel die euklidische Distanz als einfachstes
Maß benutzt. Die Ergebnisse sind in der Anlage enthalten. Im Schritt 1 werden aus den 6
Haplotypen 3 Haplotypklassen gebildet, Klasse 1 aus Haplotypnummer 1 und 4, Klasse 2 aus den
Haplotypen Nummer 2 und 5 sowie Klasse 3 aus 3 und 6. Im 2. und für dieses Beispiel letzten
Schritt werden Haplotypklasse 1 und 2 zusammengefaßt. Die anschließende Prüfung von
Häufigkeitsunterschieden der verschiedenen Haplotypen in den Haplotypklassen des 1. Schrittes
ergibt einen signifikanten Unterschied (p = 0,017) zwischen der Gruppe der Erkrankten und der
Gesunden. Im letzten Schritt ist kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden neu
entstandenen Haplotypklassen des 2. Schrittes, die durch Vereinigung der Haplotypklassen des 1.
Schrittes entstanden sind, mehr zu beobachten.
Aus den Haplotypklassen des I. Schrittes werden Consensusprofile abgeleitet:
Aus dem paarweisen Vergleich der Häufigkeiten der Consensusprofile geht hervor, daß das
Consensusprofil *212 (*steht für 1 oder 2) mit der Erkrankung A assoziiert ist.
Die Erfindung kann im Wesen auch folgendermaßen beschrieben werden:
- 1. Methode zur Verwendung eines Sets von Oligonukleotiden, die mit gesamtgenomischer DNA und DNA-Zielfragmenten hybridisieren, um damit zugleich die gezielte und simultane Generierung multipler individueller Sequenzen durch Amplifikation, Sequenzierung, und Dekodierung eines Pools von genomischen Sequenzen durchzuführen.
- 2. Eine Methode zur simultanen Sequenzierung und Analyse von multiplen DNA-Zielfragmenten, die mittels PCR amplifiziert werden
- 3. Eine Methode wie unter 2. beschrieben erweitert auf alle Nukleinsäuren.
- 4. Eine Methode zur Identifizierung interindividueller DNA Sequenzunterschiede in Kandidatengenen oder jeder genomischen Zielregion, die Erkrankungen ursächlich zugrundeliegen, genetisches Risiko für eine Erkrankung tragen, oder mit interindividuell unterschiedlicher Ansprechbarkeit auf Medikamente, suchterzeugende Substanzen, oder endogene Liganden einhergehen.
- 5. Eine Methode wie unter 4. beschrieben, erweitert auf Pflanzengenome, bakterielle Genome, grundsätzlich Genome aller Spezies, so daß in den Bereichen Molekularbiologie, Medizin, Biologie, Verterinärmedizin, Agrarwissenschaften und Ökobiologie Aufschlüsse über die Entstehung unterschiedlicher Merkmale auf der Basis genetischer Variationen gewonnen werden können.
- 6. Eine Methode zur simultanen Generierung jedweder Nukleinsäuresequenzen und deren Varationsanalyse.
- 7. Ein spezifisches Verfahren zur Image-Generierung und Image-Analyse, die auf der Basis eines spezifischen Auftragsschemas der individuellen Terminationsreaktionen die unmittelbare Detektion von DNA Sequenzunterschieden, SNPs (single nucleotide polymorphisms), und Indel-Poly morphismen ermöglicht. Ein wesentliches Element der Images/Datenverwaltung liegt auch darin, daß Bandenmuster einer gegebenen Base eines definierten DNA-Segmentes als spezifisches Identifizierungsmuster für jedes Nukleinsäure-Segment dient.
- 8. Ein Verfahren, das es ermöglicht, DNA-Sequenzen multipler Individuen simultan in einem Gefäß und in einem Vorgang durchzuführen.
Gegenstand sind weiterhin Anlagen 1, 2 und 3.
Die erfindungsgemäße Multiplex-Sequenziermethode wurde in einem
15-Plex-Sequenzierungsprojekt verwendet. In analoger Weise können auch 20-, 40- und
55-Plex-Sequenzierprojekte durchgeführt werden.
Das Protokoll verwendet Mikrotiterplatten (96-wells) und Multichannel-Pipetten.
Die gegenwärtige modular aufgebaute Produktionslinie ist Mikrotiterplatten basiert und integriert
- 1. einen automatischen Pipettierroboter (Biomek 2000, Beckman);
- 2. PCR-Automaten (MJ Research 3)
- 3. ultradünne Gel-Direkttransfer-Elektrophorese (DTE)
- 4. semi-automatisierte parallele Hybridisierung
- 5. einem Phosphor-Fluor-Imager (Molecular Dynamics)
- 6. PCR-basierte Image-Analyse mittels "skilled pattern interpretation".
PCR-Primer wurden nach dem "staggered dissection" Prinzip ausgewählt (vgl. Abb. 1b)
ausgewählt. Sie erlauben die Amplifizierung mit einer annealing Temperatur von 60°C. Es wurde
das Programm Primerselect aus dem Dnastar-Paket verwendet.
Für die vergleichende Sequenzierung des kodierenden und komplementären Stranges wurden 15
PCR-Fragmente pro Individuum (14 genspezifische und 1 HLA-Fragment zur Kontrolle für den
kodierenden Strang und 15 genspezifische für den komplementären Strang) einzeln in einem
Perkin-Elmer 9600 oder MJ Research PCR-Automat amplifiziert.
Die Reaktionen enthielten 100 ng genomische DNA, 10 mM TrisHCl (pH 8,3), 1,5 mM MgCl2, 30
KCl, 200 µM von jedem Nukleosid-Triphosphat, 30 pmol von jedem Primer, 3 U Taq-Polymerase,
und Wasser in einem Endvolumen von 50 µl. Um unspezifische Polymerase-Aktivität zu
verhindern, wurde die Taq-Polymerase in 5 µl Einmal-Reaktionspuffer-Gemisch (10 mM TrisHCl
(pH 8,3), 1,5 mM MgCl2, 50 KCl), während eines Zeitintervalls von 4 min bei 88°C nachfolgend
einer anfänglichen Denaturierung von 94°C für 4 min zugegeben. Reaktionsansätze wurden für
30-35 Zyklen bei 94°C (15 sec), 60°C (15 sec) und 72°C (30 sec) oder bei 94°C (15 sec), 60°C
(30 sec) und 72°C (1 min) amplifiziert.
Die Amplifizierung wurde mittels eines 5 µl Aliquots aus dem PCR-Ansatz auf einem 2%
Agarosegel überprüft. 5'-biotinylierte Primer wurden als Antisense-Primer in dem beschriebenen
PCR-Protokoll verwendet, da das Multiplexing-Protokoll auf der Einzelstrangsequenzierung mittels
eines Festphasensystems basiert. Allen nachfolgend aufgeführten Schritten liegt eine Einheit von
24 oder einem vielfachen davon an DNA-Proben zugrunde, die einer oder mehreren
Membranen/Images entspricht.
Alle 15PCR-Produkte pro Induvidium, 10 µl von jedem entsprechen ungefähr 200 ng amplifizierter
PCR-DNA, wurden in einem Mikrotiter-Well zusammengefaßt, welche letztlich mindestens 150 µl
an PCR-Produkten enthielt. 24×4 15-Plex-Poole wurden anschließend über das 96-Well QIAvac
manifold-System (Qiagen) aufgereinigt. Die aufgereinigten Pools an PCR-Produkten wurden in
einem Volumen von 60 µl 1×TE im 96-well-Maßstab eluiert.
Für die Festphasen-Multiplex-Sequenzierung des kodierenden Strangs wurde einzelsträngige (es)
PCR-DNA mittels einer magnetischen Streptavidin/Biotin-Interaktion isoliert. Das 15-biotinylierte
PCR-Produkt enthaltende Eluat wurde mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 160 µl
aufgefüllt, mit einem gleichen Volumen an gewaschenen Magnetpartikeln versetzt, um ein
Gemisch an einzelsträngiger DNA-Matrizen für die Sequenzierung herzustellen. Parallel dazu
wurden die Magnetpartikel vorschriftsgemäß gewaschen (Dynal, Oslo). Das ursprüngliche
Protokoll wurde für die simultane Immobilisierung der 15 verschiedenen PCR-Produkte
dahingehend modifiziert, daß nur ungefähr ¼ (4× anstelle 15×) der vorgeschriebenen Menge an
Magnetpartikeln verwendet wurde.
Zusammengefaßt, 24×80 µl equivalent zu ca. 2×1 ml (800 µg) an Streptavidin-beschichteten
Magnetpartikeln wurden 2× in einer gleichen Menge an 1× Binde- und Wasch-(B & W) Puffer
gewaschen, in dem doppeltem Volumen 2× B & W-Puffer resuspendiert, und in 24 Aliquots a 160
µl auf eine 96-Well-Platte verteilt. Anschließend wurden die 160 µl an gepooltem und gereinigtem
PCR-Produkten mit einem gleichen Volumen gewaschener Magentpartikel versetzt und für 15 min
bei Raumtemperatur inkubiert. Das Aufschmelzen der DNA-Helices und die Trennung der
DNA-Stränge erfolgte vorschriftsmäßig; es wurden jedoch 4-5-fache Volumina an Puffer und Lösungen
verwendet um die 15-fache Menge an prozessierter PCR-DNA auszugleichen. Anschließend
wurden die Magnet-Partikel mit der an sie gebundenen esPCR-DNA in 60 µl Wasser resuspendiert.
Die Multiplex-Sequenzierreaktionen wurden mit der doppelten Menge an Reagenzien, verglichen
mit einer 15-fachen Menge an Reagenzien falls die Reaktionen einzeln prozessiert worden wären,
durchgeführt, mit der Ausnahme einer veränderten Menge der 15 verschiedenen
Sequenzier-Primer. Die doppelte Menge, 2 pmol von jedem Sequenzierprimer wurden in einer
Multiplex-Sequenzierreaktion verwendet.
15-Plex-Primer: jedes in einem Mikrotiter-Well befindliche Gemisch aus 15 Matrizen wurde mit 2
µl Primercocktail (2 pmol von jedem Primer) und 4 µl 5× Reaktionspuffer (75 mM NaCl, 40 mM
TrisHCl, pH 7,5) versetzt. Die annealing-Gemische mit einem Gesamtvolumen von 22 µl wurden
in einem Wasserbad 2 min bei 80°C erhitzt und anschließend für 20 min bei 37°C inkubiert. Die
Proben wurden kurz zentrifugiert und auf Eis abgekühlt. Vor dem Start der Sequenzierreaktion
wurden 8 µl Mangan-DTT-Gemisch (25 mM DTT, 3,75 mM isocitric-Säure, 1,25 mM MnCl2 in
Wasser), dem annealing-Gemisch zugesetzt, gefolgt durch die Zugabe von 4 µl verdünnter
Sequenase (0,5 U Sequenase für 15 Matrizen und 0,03 U IPPase in 1× TE) in einem Endvolumen
von 34 µl. Jeweils 7 µl dieser Gemische wurden mit jeweils 5 µl eines basenspezifischen
Nukleotid-Terminationsgemisches (100 µM von jedem dNTP, 1 µM von jedem ddNTP, in 25 mM
NaCl) versetzt und anschließend für 15 min bei 37°C inkubiert. Nach erfolgter Sequenzierreaktion
wurden die 96-Well-Platten kurzzeitig zentrifugiert und die Überstände durch magnetische
Abtrennung entfernt. Die Terminationsprodukte wurden eluiert, indem 5 µl Stopp-Lösung (95%
Formamid, 20 mM EDTA, 0,05% Bromphenol-Blau, 0,05% Xylen-cyanol FF) zugegeben wurden
und anschließend eine Erhitzung für 2 min bei 80°C erfolgte. Die Überstände, die die Gemische
der Sequenzierprodukte enthalten wurden erneut durch magnetische Trennung abgenommen, in
eine neue Mikrotiterplatte überführt und bei -20°C gelagert. Vor dem Auftragen wurden die
Proben für 2 min bei 80°C in einem Wasserbad denaturiert und sofort auf Eis abgeschreckt. Für
das Sequenziergel wurden von jeder Probe 1 µl aufgetragen.
Für die Sequenzierung des komplementären Stranges wurde eine 15-Plex-Cycle-Sequenzierung mit
2 µl, entsprechend ca. 40 ng von jedem PCR-Produkt, Thermo Sequenase, unter denen vom
Hersteller vorgegebenen Reaktionsbedingungen (Amersham) durchgeführt. Eine Ausnahme, der
ursprüngliche Sequenzier-Primer wurde durch ein Gemisch von 15 Primern (0,5 pmol/Primer)
ersetzt.
96 Proben (entsprechend den gepoolten Terminationsreaktionen von 24 Individuen), von jeder 1 µl,
wurden mit einer Hamilton-12-Kanal-Pipette (Hamilton, Reno, NV) auf ein ultradünnes, 0,125
mm, 5% Acrylamidgel aufgetragen, nach Größe bei 3150 V aufgetrennt und nach dem Protokoll
von Richterich und Church (1993) auf eine Nylonmembran (neutral), 1,2 µm Biodyne A, Pall,
32×45 cm übertragen. Der Transfer erfolgte Computer gestützt mittels einem modifizierten
Geschwindigkeitsgradienten von 11 cm/h für 80 min und 8 cm/h für 5 Stunden, weiches eine
optimale Auflösung der Sequenzierprodukte für die Image-Analyse mittels visueller Inspektion
erbrachte. Images, die eine direkte Identifizierung von Sequenzunterschieden verschiedener
individueller Gene durch visuelle Inspektion ermöglichen, wurden durch die Einführung eines
spezifischen Ladeprinzips generiert. Die Terminationsreaktion eines Gemisches einer gegebenen
Base G, T, A, C wurden in Blöcken von jeweils 12 Individuen geladen, um hierdurch die Detektion
von Mutationen durch die Identifizierung von zusätzlichen und/oder fehlenden Banden (skilled
pattern interpretation, vgl. Abb. 1a, 1b und 2) zu erreichen. Nach dem Transfer wurde die DNA
durch Bestrahlung mit UV-Licht fixiert.
Oligonukleotide mit einer Mindestlänge von 18 Nukleotiden und revers komplementär zu dem
Zielsegment, welches integraler Bestandteil des genomischen Zielfragmentes ist, wurden in
Portionen von 1 µl (2 pmol) mit [α-32P]dATP (6000Ci/mmol; NEN) und 1 µl (14 U Kalbsthymus
teminaler Desoxynukleotidyl-Transferase (USB) entsprechend den Vorgaben des Herstellers
endmarkiert. Nach Vorhybridisierung bei 42°C für mindestens 15 min, wurde eine 10 µl terminale
Transferasereaktion mit 8 ml Hybridisierungspuffer (7%SDS, 10% Polyethylenglykol (PEG),
0,25 M NaCl, 0,051% Phosphorsäure, 82 mM Na2HPO4×H2O, 10 mM EDTA, 32 mM NaOH;
auch als Prähybridisierungslösung zu verwenden) verdünnt, dem Volumen für die Hybridisierung
einer Membran. Ein bis zwei Membranen wurden in einer Glasröhre bei 42°C über Nacht,
mindestens für 4 h, hybridisert. Die Membranen wurden in Einheiten von 5 bei Raumtemperatur
mittels eines Automaten für die Membranwaschung (Umwelt- und Ingenieurtechnik GmbH,
Dresden) gewaschen, der 5 Waschschritte mit jeweils 1500 ml Waschlösung (1% SDS, 0,022%
Phosphorsäure, 69 mM Na2H2PO4×H2O, 5 mM EDTA, 32 mM NAOH) durchführte.
Nachfolgend wurde jede der Membranen mit Klarsichtfolie bedeckt. Nach Exposition zu einem
Molecular Dynamics Phosphor Fluor Imager Screen für 1 bis 20 h wurde die radioaktive Probe mit
Stripping-Puffer (0,2% SDS, 2 mM EDTA, pH 8,3) für 5-10 min bei 65°C mindestens 2×,
entfernt. Die Images wurden mittels eines Molecular Dynamics Phosphor Fluor Imagers eingelesen
und die Images-Files für die Genotypisierung auf einen PC transferiert.
Das humane µ-Opioid-Rezeptorgen inklusive seiner 5'-regulierenden, kodierenden und wichtiger
intronischer Sequenzen wurde in 250 Individuen vergleichend sequenziert. Die Gruppe der 250
untersuchten Individuen beinhaltete Süchtige mit einer Familiengeschichte, der Krankheit und
Kontrollen. Insgesamt wurden 1,7 Mbasen analysiert. Die Analyse der Daten zeigte, daß eine
spezifische Konstellation von Polymorphismen (Haplotyp) mit einer signifikant erhöhten Frequenz
in Individuen mit einer genetischen Disposition zu Drogenmißbrauch beobachtet wurde das
Projekt die folgenden Schritte:
- a) Klonierung der 5'-regulierenden und wichtiger intronischer Sequenzen, welches die vorher bekannte cDNA-Sequenzinformation (2162 bp) auf insgesamt 6968 bp erweiterte,
- b) Dissektion (Zergliederung) der gesamten genomischen Sequenz sowohl des kodierenden als auch des komplementären Stranges in PCR-Fragmente, 15-Plex-Sequenzierung beider Stränge. Generierung von zwei Sätzen a 11 Membranen, die pro Strang 1,7 Mbasen an vergleichender Sequenzinfomation enthalten, 15 Hybridisierungszyklen pro Membran, Auswertung von ca. 330 Images über "skilled pattern analysis"
- c) Determinierung des gesamten polymorphen Spektrums mit insgesamt 37 Varianten, Haplotyp-Analyse von 23 Varianten resultierend in zahlreichen individuellen Genprofilen, Derterminierung von allelischen Kategorien über simularity analyse.
- d) Identifizierung einer allelischen Kategorie in US-Amerikanern afrikanischer Abstammung, die mit der genetischen Disposition zu Drogenmißbrauch assoziiert ist.
Claims (20)
1. Methode zur Identifizierung, Darstellung und Auswertung sowie Interpretation interindividueller
DNA Sequenzunterschiede, dadurch gekennzeichnet, daß man
- - die genomische DNA der zu untersuchenden Individuen isoliert,
- - Segmente der zu vergleichenden Gene, genomischen Regionen, Genome definiert,
- - diese Segmente mittels PCR unter Verwendung hochspezifischer Oligonukleotide gezielt isoliert und in einer ausreichenden Anzahl von Kopien herstellt,
- - eine simultane Sequenzierung aller gewonnenen Gensegmente, die nun als PCR-Produkte vorliegen, durchführt,
- - das dadurch entstehende Gemisch von Terminationsreaktionen, das die individuellen Sequenzen aller Gensegmente enthält, anschließend auf einem Sequenziergel elektrophoretisch trennt und
- - mittels direkter Transferelektrophorese auf eine Membran überträgt,
- - anschließend durch Hybridisierung der Membran mit einem markierten, hochspezifischen Oligonukleotid die individuellen Sequenzen eines bestimmten Gensegmentes aus dem ursprünglichen Gemisch sichtbar macht,
- - diesen Vorgang sooft wiederholt, bis alle Gensegmente aus dem ursprünglichen Pool detektiert sind
- - und anschließend durch Image-Analyse interindividuelle DNA-Sequenzunterschiede detektiert, und durch mathematische Aufarbeitung ein Genprofilmuster erstellt und auswertet.
2. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie auf alle Nukleinsäuren angewendet
wird.
3. Methode nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß multiple Gensegmente eines
bestimmten Individuums simultan sequenziert werden, oder ein und dasselbe Segment simultan in
multiplen Individuen sequenziert werden.
4. Methode nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die simultane Sequenzierung mit
multiplen, hochspezifischen Sequenzierprimern durchgeführt wird, wobei die Anzahl der
Sequenzierprimer der Anzahl der Gensegmente entspricht.
5. Methode nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die simultane Sequenzierung mit
multiplen, hochspezifischen Sequenzierprimern durchgeführt wird, wobei die Anzahl der
Sequenzierprimer der Anzahl der virtuellen Gensegmente entspricht.
6. Methode nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß virtuelle Gensegmente dadurch
gekennzeichnet sind, daß sie Bestandteil eines mehrere Gensegmente umfassenden
PCR-Fragmentes sind.
7. Methode nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie für 20-30,
bevorzugt 24, Individuen, durchgeführt wird, so daß eine Membran die Sequenzen aller
Gensegmente der untersuchten Individuen enthält.
8. Methode nach einem Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß deine Membran nicht
nur die Sequenzen aller Gensegmente einzelner Individuen enthält, nämlich 20-30, bevorzugt 24,
Individuen enthält, sondern alternativ auch die Sequenzen eines Gensegmentes in multiplen
Individuen enthält.
9. Methode nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie 2-100×20-30, bevorzugt 24,
enthält.
10. Methode nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß spezifisch für den
Nukleinsäuresequenzvergleich die basenspezifischen Terminationsreaktionen von jeweils 12
Individuen nebeneinander angeordnet werden, so daß auf der Membran und schließlich auf dem
Image jeweils Blöcke von je 12 individuellen G-Reaktionen, und analog T-, A-, und C-Reaktionen
sichtbar werden.
11. Methode nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenzunterschiede unmittelbar
dargestellt werden.
12. Methode nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die
hochspezifischen Oligonukleotide radioaktiv oder mittels anderer Verfahren markiert sind.
13. Methode nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Sichtbarmachung definierter
DNA-Sequenzen aus dem Reaktionsgemisch dadurch erfolgt, daß die hochspezifischen
Oligonukleotide mit einer DNA-Sequenz hybridisiert, die integraler Bestandteil eines definierten
genomischen Zielsegmentes ist, und die sich an die Sequenzierprimerhybridisierungsregion
anschließt.
14. Methode nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Sichtbarmachung definierter
DNA-Sequenzen aus dem Reaktionsgemisch dadurch erfolgt, daß die hochspezifischen
Oligonukleotide mit einer DNA-Sequenz hybridisiert, die extern synthetisiert wurde und intergraler
Bestandteil des PCR- oder Sequenzierprimers ist.
15. Methode nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß Genprofilmuster,
die eine genetische Differenzierung für das Erkennungsrisiko bzw. für die Ausprägung
phänotypischer Merkmale jeder Art in jeder Species zulassen, durch Reduktion der Anzahl von
Geno- bzw. Haplotypen mittels Klassifizierungsverfahren unter Ausnutzung des
Häufigkeitsvergleichs von Geno- bzw. Haplotypen zweier verschiedener phänotypischer Gruppen
einer Spezies erstellt werden.
16. Verwendung eines definierten Sets von Oligonukleotiden für diagnostische Zwecke, wobei die
Oligonukleotide mit gesamtgenomischer DNA und DNA-Zielfragmenten hybridisieren, um damit
zugleich die gezielte und simultane Generierung multipler individueller Sequenzen durch
Amplifikation, Sequenzierung und Dekodierung eines Pools von genomischen Sequenzen
durchzuführen.
17. Verwendung der Methode gemäß der Ansprüche 1 bis 15 zur Identifizierung interindividueller
DNA Sequenzunterschiede in Kandidatengenen, Genomen oder jeder genomischen Zielregion, die
Erkrankungen ursächlich zugrundeliegen, genetisches Risiko für eine Erkrankung tragen, oder mit
interindividuell unterschiedlicher Ansprechbarkeit auf Medikamente, suchterzeugende Substanzen,
oder endogene Liganden einhergehen.
18. Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß Pflanzengenome, bakterielle
Genome, grundsätzlich Genome aller Spezies, so daß in den Bereichen Molekularbiologie,
Medizin, Biologie, Verterinärmedizin, Agrarwissenschaften und Ökobiologie Aufschlüsse über die
Entstehung unterschiedlicher Merkmale auf der Basis genetischer Variationen gewonnen werden
können.
19. Verwendung der Methode gemäß Ansprüche 1 bis 15 zur Image-Generierung und Image-Analyse,
die auf der Basis eines spezifischen Auftragsschemas der individuellen
Terminationsreaktionen die unmittelbare Detektion von DNA Sequenzunterschieden, SNPs (single
nucleotide polymorphisms), und Indel-Polymorphismen und der Images/Datenverwaltung indem
Bandenmuster einer gegebenen Base eines definierten DNA-Segmentes als spezifisches
Identifizierungsmuster für jedes Nukleinsäure-Segment dienen.
20. Verwendung der Methode gemäß Ansprüche 1 bis 15 um DNA-Sequenzen multipler Individuen
simultan in einem Gefäß und in einem Vorgang durchzuführen.
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