KR101296221B1 - 중합효소연쇄반응을 이용한 축종 판별방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용한 오리, 닭, 염소, 사슴, 돼지, 소, 양 및 말에서 선택되는 1종 이상의 축종 판별방법에 관한 것으로서, 1회의 PCR을 통해서도 상기 8종의 축종을 동시에 판별하는 것이 가능하기에, 식육의 축종 판별을 위한 노동력과 시간을 현저하게 절약할 수 있어 식육산업의 증진을 위해 유용하게 이용될 수 있다.

Description

중합효소연쇄반응을 이용한 축종 판별방법 {Method of identifying animal species using polymerase chain reaction}
본 발명은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용한 축종 판별방법에 관한 것으로서, 자세하게는 중합효소연쇄반응을 이용한 오리, 닭, 염소, 사슴, 돼지, 소, 양 및 말에서 선택되는 1종 이상의 축종 판별방법에 관한 것이다.
산업이 발달하고 소득이 높아질수록 많은 소비자들은 축산물을 포함하여 더 좋은 먹을거리를 선택하게 된다. 단백질 섭취를 위해 육류의 소비가 날로 증가하고 있지만, 알레르기 반응 또는 종교 등의 이유로 인해 육류 역시 다른 농산물처럼 가려먹어야 하는 소비자들도 있어, 축산물에 표시된 관련사항들을 면밀하게 살펴보고 제품을 구입하는 추세가 증가하고 있다.
또한, 속이거나 비의도적으로 잘못 표시된 육류제품, 저가의 육류 혼합, 불명료하거나 부적당한 제품, 사람과 동물 건강에 해로울 수 있는 특정 동물의 육류 유입에 의해서 야기될 수 있는 축산물의 안전성 검증과 부정유통을 예방할 검사방법이 사회적으로 필요로 되고 있다. 그래서 소비자들의 신뢰성과 제품의 안정성 확보를 위해 축산물가공품 관련 축종 표시를 객관적으로 검증할 수 있는 과학적인 검사법이 여러 연구자들에 의해서 개발되었다.
이에 따라 현재 국립수의과학검역원 축산물의 가공기준 및 성분규격의 식육판별법이 마련되어 있으나 국립수의과학검역원에서 고시한 축산물의 가공기준 및 성분규격에 채택된 식육판별법인 glycogen 검사법, 지방검사법, 자비법은 판별기준이 모호하거나 매우 주관적이다. 그리고 혈청학적 시험법인 한천겔면역확산법과 효소면역반응법 등은 특이적이고 민감하지만, 근연종에서 교차반응이 발생하는 문제가 있다. 또한, 식육의 단백질을 이용한 전기영동법, 액체크로마토그래피 등 여러 가지 분석법으로 축종 판별을 실시할 수 있지만, 단백질이 도축되고 나서 생물학적 활성이 사라져 세포 분류에 따라 특성이 달라지게 되며, 열과 압력 처리과정을 거치는 동안 변성되기 때문에 가공된 검체에서 축종 판별은 매우 까다로운 것으로 알려져 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위해, 소, 면양, 돼지 및 가금 등의 조직이나 혈액 등으로부터 미토콘드리아 DNA를 이용한 유전자 검사에 의한 식육의 축종판별법이 개발되었으나 RAPD-PCR(random amplified polymorphic DNA fingerprints-PCR), PCR-RFLP(PCR-restriction fragment length polymorphism) 방법을 이용하기 때문에 확인절차가 복잡하고 축종을 판별하는데 장시간이 소요되거나, 축종별 식별력이 낮다는 단점이 제기되었다(박종근 et al. 2007; Unseld et al. 1995).
이에, 본 발명자들은 오리, 닭, 염소, 사슴, 돼지, 소, 양 및 말의 미토콘드리아 유전자에 대한 종 특이성이 우수한 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 수행하여 축종 분별을 용이하게 할 수 있는 방법을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
한국등록특허 제1156093호에는 휘발성 화합물의 프로파일을 이용한 식육 품종 판별 방법이 개시되어 있어, 닭고기, 소고기, 돼지고기, 오리고기를 판별하는 방법이 개시되어 있기는 하지만 확인방법이 복잡하면서도 실험의 특성상 오차값의 편차가 커서 정확한 결과를 기대하기가 어렵다.
한국등록특허 제1209786호에서 소, 돼지, 닭, 오리, 면양, 산양, 말, 개, 칠면조 및 거위의 10종의 축종을 판별하는 방법을 확인하기는 했지만, 본 발명과는 다른 종류의 프라이머를 사용하고 있어 본 발명과는 기술구성이 다르다고 할 수 있을 뿐만 아니라 각 축종에 대한 DNA 밴드의 크기가 각 축종별로 비슷하여 4~5종 이상의 축종의 DNA가 혼합되었을 경우, 분석결과를 판독하는 것이 용이하지 않다.
또한, Matsunaga 등(Matsunaga et al. 1999)이 미토콘드리아 사이토크롬 B 유전자를 인식하는 1개의 전방 프라이머 및 각 축종별 6개의 후방 프라이머만을 이용하여 닭, 염소, 돼지, 소, 양 및 말의 축종을 판별하는 방법을 제시하기도 하였으나, 상기 방법에 개시된 프라이머들을 모두 혼합하여 PCR을 수행할 경우, 단 1종의 축종에 대한 DNA를 이용했음에도 불구하고, 다른 축종의 DNA를 이용한 것과 같은 결과가 나타나 축종별 판별 능력이 낮은 것으로 확인되었다.
한국등록특허 제1209786호 (축종 감별용 ＰＣＲ 또는 실시간 ＰＣＲ 프라이머 조성물, 이를 포함하는 축종감별용 ＰＣＲ 키트 및 이를 이용한 축종감별방법, 2012.12.03. 등록) 한국등록특허 제1156093호 (휘발성 화합물 프로파일을 이용한 식육 품종 판별 방법, 2012.06.07. 등록)
박종근 et al., 미토콘드리아 12S rRNA 유전자의 종 특이적 PCR-RFLP Fingerprint를 이용한 식육 원료의 판별, Korean J. Food Sci. Ani. Resour., 2007, 27(2), 209~215. Unseld et al., Identification of the species origin of highly processed meat products by mitochondrial DNA sequences, Genome Res., 1995, 4, 241-243. Matsunaga et al., A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay, Meat Science, 1999, 51, 143~148.
본 발명의 목적은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)을 이용한 축종 판별방법을 제공하는 데에 있으며, 자세하게는 중합효소연쇄반응을 이용한 오리, 닭, 염소, 사슴, 돼지, 소, 양 및 말에서 선택되는 1종 이상의 축종 판별방법을 제공하는 데에 있다.
오리의 12S rRNA 미토콘드리아 유전자(GenBank accession number EU755252.1 중의 Mitochondrion 12S rRNA gene),
닭의 12S rRNA 미토콘드리아 유전자(GenBank accession number AY235571.1 중의 Mitochondrion 12S rRNA gene),
염소의 12S rRNA 미토콘드리아 유전자(GenBank accession number GU229278.1 중의 Mitochondrion 12S rRNA gene),
사슴의 12S rRNA 미토콘드리아 유전자(GenBank accession number NC_016178.1 중의 Mitochondrion 12S rRNA gene),
돼지의 미토콘드리아 사이토크롬 B 유전자(GenBank accession number EF545590.1 중의 Mitochondrion cytochrome B gene),
소의 미토콘드리아 사이토크롬 B 유전자(GenBank accession number JN817351.1 중의 Mitochondrion cytochrome B gene),
양의 미토콘드리아 사이토크롬 B 유전자(GenBank accession number HE577850.1 중의 Mitochondrion cytochrome B gene) 및
말의 미토콘드리아 사이토크롬 B 유전자(GenBank accession number NC_001640.1 중의 Mitochondrion cytochrome B gene)
를 인식하는 서열번호 9~18의 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및,
상기 중합효소연쇄반응을 통해 증폭된 PCR 산물을 전기 영동하는 단계;를 포함하는 오리, 닭, 염소, 사슴, 돼지, 소, 양 및 말에서 선택되는 1종 이상의 축종 판별방법을 제공한다.
상기 서열번호 9~18의 프라이머 세트에는,
오리, 닭, 염소 및 사슴의 미토콘드리아 12S rRNA 유전자를 인식하는 서열번호 9의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 전방 프라이머;
돼지, 소, 양 및 말의 미토콘드리아 사이토크롬 B 유전자를 인식하는 서열번호 10의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 전방 프라이머;
오리의 12S rRNA 미토콘드리아 유전자를 인식하는 서열번호 11의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 후방 프라이머;
닭의 12S rRNA 미토콘드리아 유전자를 인식하는 서열번호 12의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 후방 프라이머;
염소의 12S rRNA 미토콘드리아 유전자를 인식하는 서열번호 13의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 후방 프라이머;
사슴의 12S rRNA 미토콘드리아 유전자를 인식하는 서열번호 14의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 후방 프라이머;
돼지의 미토콘드리아 사이토크롬 B 유전자를 인식하는 서열번호 15의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 후방 프라이머;
소의 미토콘드리아 사이토크롬 B 유전자를 인식하는 서열번호 16의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 후방 프라이머;
양의 미토콘드리아 사이토크롬 B 유전자를 인식하는 서열번호 17의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 후방 프라이머; 및,
말의 미토콘드리아 사이토크롬 B 유전자를 인식하는 서열번호 18의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 후방 프라이머;가 포함될 수 있다.
한편, 상기 PCR 산물을 전기 영동한 후, 각 축종별로 오리 148bp, 닭 231bp, 염소 315bp, 사슴 794bp, 돼지 400bp, 소 538bp, 양 665bp 및 말 1048bp의 1개 이상의 DNA 밴드가 생성되는 것을 통해 축종을 판별할 수 있다(bp:base pairs).
또한, 본 발명은 상기 서열번호 9 내지 18의 프라이머 세트를 포함하는 오리, 닭, 염소, 사슴, 돼지, 소, 양 및 말에서 선택되는 1종 이상의 축종 판별용 진단세트를 제공한다. 상기 진단세트에는 서열번호 9 및 10의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 전방 프라이머, 및, 서열번호 11 내지 18의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 역 프라이머가 추가될 수 있다.
이하, 본 발명을 자세하게 설명한다.
본 발명에서 이용하는 오리, 닭, 염소, 사슴, 돼지, 소, 양 및 말의 품종을 판별하기 위한 미토콘드리아 유전자의 염기서열은 하기 표 1~8에 개시된 것과 같으며, 각 유전자를 인식하는 프라이머가 결합하는 위치는 밑줄로 표시하였다. 각 프라이머는 오리, 닭, 염소 및 사슴에서는 하기 미토콘드리아 유전자에 포함된 12S rRNA 유전자를 인식하며, 돼지, 소, 양 및 말에서는 하기 미토콘드리아 유전자에 포함된 사이토크롬 B 유전자를 인식한다.
Figure 112013049110902-pat00001
Figure 112013049110902-pat00002
Figure 112013049110902-pat00003
Figure 112013049110902-pat00004
Figure 112013049110902-pat00005
Figure 112013049110902-pat00006
Figure 112013049110902-pat00007
Figure 112013049110902-pat00008
한편, 본 발명의 서열번호 9 내지 18 프라이머들의 염기서열은 하기 표 9와 같다.
Figure 112013049110902-pat00009
상기 ‘서열번호 9의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 전방 프라이머’ 및 ‘서열번호 11의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 역 프라이머’를 통해서는, 서열번호 1의 ‘오리의 미토콘드리아 유전자’에 포함된 ‘12S rRNA 유전자’를 인식할 수 있으며, 148bp의 DNA 밴드가 생성될 수 있다.
상기 ‘서열번호 9의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 전방 프라이머’ 및 ‘서열번호 12의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 역 프라이머’를 통해서는, 서열번호 2의 ‘닭의 미토콘드리아 유전자’에 포함된 ‘12S rRNA 유전자’를 인식할 수 있으며, 231bp의 DNA 밴드가 생성될 수 있다.
상기 ‘서열번호 9의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 전방 프라이머’ 및 ‘서열번호 13의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 역 프라이머’를 통해서는, ‘서열번호 3의 ‘염소의 미토콘드리아 유전자’에 포함된 ‘12S rRNA 유전자’를 인식할 수 있으며, 315bp의 DNA 밴드가 생성될 수 있다.
상기 ‘서열번호 9의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 전방 프라이머’ 및 ‘서열번호 14의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 역 프라이머’를 통해서는, 서열번호 4의 ‘사슴의 미토콘드리아 유전자’에 포함된 ‘12S rRNA 유전자’를 인식할 수 있으며, 794bp의 DNA 밴드가 생성될 수 있다.
상기 ‘서열번호 10의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 전방 프라이머’ 및 ‘서열번호 15의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 역 프라이머’를 통해서는, 서열번호 5의 ‘돼지의 미토콘드리아 유전자’에 포함된 ‘사이토크롬 B 유전자’를 인식할 수 있으며, 400bp의 DNA 밴드가 생성될 수 있다.
상기 ‘서열번호 10의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 전방 프라이머’ 및 ‘서열번호 16의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 역 프라이머’를 통해서는, 서열번호 6의 ‘소의 미토콘드리아 유전자’에 포함된 ‘사이토크롬 B 유전자’를 인식할 수 있으며, 538bp의 DNA 밴드가 생성될 수 있다.
상기 ‘서열번호 10의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 전방 프라이머’ 및 ‘서열번호 17의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 역 프라이머’를 통해서는, 서열번호 7의 ‘양의 미토콘드리아 유전자’에 포함된 ‘사이토크롬 B 유전자’를 인식할 수 있으며, 665bp의 DNA 밴드가 생성될 수 있다.
상기 ‘서열번호 10의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 전방 프라이머’ 및 ‘서열번호 18의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 역 프라이머’를 통해서는, 서열번호 8의 ‘말의 미토콘드리아 유전자’에 포함된 ‘사이토크롬 B 유전자’를 인식할 수 있으며, 1048bp의 DNA 밴드가 생성될 수 있다.
상기의 각 축종별 미토콘드리아 유전자와 프라이머를 이용하여 생성된 PCR 결과물의 DNA 밴드는 도 1을 참고하여 확인할 수 있다.
한편, 본 발명에서 제공되는 서열번호 9~18의 프라이머 세트를 포함하는 오리, 닭, 염소, 사슴, 돼지, 소, 양 및 말에서 선택되는 1종 이상의 축종 판별용 진단세트에는 PCR 반응버퍼, dNTP, Taq DNA 폴리머라제, 증류수, PCR용 튜브, 대조군용 오리, 닭, 염소, 사슴, 돼지, 소, 양 및 말의 DNA 샘플 등이 포함될 수 있다.
본 발명은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용한 오리, 닭, 염소, 사슴, 돼지, 소, 양 및 말에서 선택되는 1종 이상의 축종 판별방법에 관한 것으로서, 1회의 PCR을 통해서도 상기 8종의 축종을 동시에 판별하는 것이 가능하기에, 식육의 축종 판별을 위한 노동력과 시간을 현저하게 절약할 수 있어 식육산업의 증진을 위해 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 오리, 닭, 염소, 사슴, 돼지, 소, 양 및 말의 DNA와 각 프라이머와의 반응성을 PCR을 통해 확인한 전기영동 사진이다.
도 2는 표 12의 비교 대상 프라이머와 표 10의 본 발명의 프라이머를 이용한 PCR 결과를 비교하여 나타낸 전기영동 사진이다.
도 3의 상단 그림은 양의 DNA와 다른 축종의 1종 DNA가 혼합한 것을 이용하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 전기영동 사진이며, 도 3의 하단 그림은 2~8종의 축종의 DNA가 혼합된 것을 이용하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 전기영동 사진이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1. DNA 준비>
오리, 닭, 염소, 사슴, 돼지, 소, 양 및 말의 근육에서 DNA를 채취하였다. 조직에서 DNA의 추출은 스핀-컬럼 방식을 이용하여 실시하였다. PrimePrepTMGenomic DNA Isolation Kit(제넷바이오, K-3000)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 구체적으로 각 축종의 조직(50㎎)을 잘게 부순 후 TL 완충용액 200㎕와 프로테이나제 K(20㎎/㎖) 20㎕를 넣고 충분히 섞은 후 56℃에서 조직이 완전히 용해될 때까지 반응시켰다. 이 후, 조직이 완전히 용해되면 GB 완충용액 200㎕를 첨가하고 충분히 섞은 후 56℃에서 10분간 반응시켰다. 이 후 에탄올 200㎕를 넣고 잘 섞은 후 상기 혼합용액을 스핀-컬럼에 옮기고 10,000rpm에서 1분간 원심분리한 후 스핀-컬럼을 새로운 튜브에 옮겼다. 그 뒤 GW1 용액 500㎕를 첨가하여 10,000rpm에서 원심분리하고 상기 스핀-컬럼을 새로운 튜브로 옮겼다. 이 후 GW2 용액 500㎕를 첨가하여 10,000rpm에서 원심분리하고 상기 스핀-컬럼을 새로운 튜브로 옮겼다. 상기 스핀-컬럼을 12,000rpm에서 1분간 원심분리하고 GW2 용액을 완전히 제거한 후 새로운 1.5㎖ 튜브에 스핀-컬럼을 장착하고 GE 용출용액 200㎕를 첨가하고 10,000rpm에서 1분간 원심분리하여 DNA를 추출하였다. 그 뒤 추출된 DNA는 전기영동으로 확인하였다. 한편, 염소에서는 3마리의 개체에서 DNA 추출하였으며, 염소 DNA ①, ② 및 ③이라 하였다.
<실시예 2. 각 축종별 미토콘드리아 유전자의 증폭을 위한 PCR 수행>
상기 실시예 1에서 얻은 각 축종별 DNA를 증폭시키기 위하여 오리, 닭, 염소, 사슴, 돼지, 소, 양 및 말의 미토콘드리아 유전자를 인식하는 서열번호 9~18의 전체 염기서열을 포함하는 프라이머를 합성하였다.
* 오리 DNA 증폭용 프라이머 : GenBank accession number EU755252.1의 미토콘드리아 12S rRNA 유전자 증폭, 서열번호 9의 전방 프라이머와 서열번호 11의 후방 프라이머.
* 닭 DNA 증폭용 프라이머 : GenBank accession number AY235571.1의 미토콘드리아 12S rRNA 유전자 증폭, 서열번호 9의 전방 프라이머와 서열번호 12의 후방 프라이머.
* 염소 DNA 증폭용 프라이머 : GenBank accession number GU229278.1의 미토콘드리아 12S rRNA 유전자 증폭, 서열번호 9의 전방 프라이머와 서열번호 13의 후방 프라이머.
* 사슴 DNA 증폭용 프라이머 : GenBank accession number NC_016178.1의 미토콘드리아 12S rRNA 유전자 증폭, 서열번호 9의 전방 프라이머와 서열번호 14의 후방 프라이머.
* 돼지 DNA 증폭용 프라이머 : GenBank accession number EF545590.1의 미토콘드리아 사이토크롬 B 유전자 증폭, 서열번호 10의 전방 프라이머와 서열번호 15의 후방 프라이머.
* 소 DNA 증폭용 프라이머 : GenBank accession number JN817351.1의 미토콘드리아 사이토크롬 B 유전자 증폭, 서열번호 10의 전방 프라이머와 서열번호 16의 후방 프라이머.
* 양 DNA 증폭용 프라이머 : GenBank accession number HE577850.1의 미토콘드리아 사이토크롬 B 유전자 증폭, 서열번호 10의 전방 프라이머와 서열번호 17의 후방 프라이머.
* 말 DNA 증폭용 프라이머 : GenBank accession number NC_001640.1의 미토콘드리아 사이토크롬 B 유전자 증폭, 서열번호 10의 전방 프라이머와 서열번호 18의 후방 프라이머.
이 후, 각 프라이머들이 해당 축종에 대한 DNA만을 선택적으로 증폭할 수 있는지 확인하기 위해 PCR을 수행하였다.
Figure 112013049110902-pat00010
PCR을 위한 반응액은, 각 축종별 DNA 1㎕(10~100ng/㎕), 서열번호 9 또는 10의 전방 프라이머(10pM) 0.6㎕, 서열번호 11 내지 18에서 선택되는 1종의 후방 프라이머(10pM) 0.6㎕, 10X 반응버퍼 2㎕(제넷바이오, G-7000), 10mM dNTP 2㎕, Taq DNA 폴리머라제 프리믹스(HS Prime Taq Premix 2x(제넷 바이오, G-7100), 10㎕를 첨가하고 멸균 증류수를 첨가하여 총 20㎕로 부피를 조정하였다. 한편, 염소의 DNA는 실시예 1에서 추출한 것 중 DNA ①을 사용하였다. PCR 반응은 하기 표 11의 조건으로 수행하였다.
Figure 112013049110902-pat00011
즉, 95℃에서 10분간 예비 변성을 시킨 후, 95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 1분씩 30 사이클을 반응한 후, 72℃에서 5분간 최종 신장반응을 수행하였다. 그 뒤 증폭된 PCR 산물을 1.8% 아가로즈 겔에서 확인하였으며, 이에 대한 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1을 참고하면, 오리의 프라이머는 오리의 DNA만을 증폭하는 것으로 나타났으며, 이와 동일하게 다른 축종의 프라이머도 역시 해당되는 축종에 대한 DNA만을 증폭하는 것으로 나타났다(오리 148bp, 닭 231bp, 염소 315bp, 사슴 794bp, 돼지 400bp, 소 538bp, 양 665bp 및 말 1048bp의 DNA 밴드 생성). 이를 통해 본 발명의 프라이머가 각 축종에 대한 특이적 판별력이 우수한 것으로 확인되었다.
<실시예 3. 본 발명 프라이머와 비교 대상 프라이머를 이용한 PCR 결과 비교 확인>
한편, 본 발명의 프라이머의 각 축종에 대한 판별 능력을 비교하기 위해 하기 표 12의 조건으로 기존에 개시된 'Matsunaga 등(Matsunaga et al. 1999)'의 프라이머를 합성하여 실시예 2의 프라이머들을 이용한 조건과 동일하게 PCR을 수행하였다. 이 때, 본 발명 프라이머와 비교대상 프라이머에 대해, 양과 염소에 대한 DNA를 이용하여 PCR을 수행하였으며, 각 결과를 도 2에서 비교확인하였다.
Figure 112013049110902-pat00012
상기 표 12를 참고할 때, 각 축종별 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍은 하기와 같다.
* 표 12를 이용한 닭 DNA 증폭용 프라이머 : GenBank accession number AY235571.1의 미토콘드리아 사이토크롬 B 유전자 증폭, 비교-All-F의 전방 프라이머와 비교-Gallus-R의 후방 프라이머.
* 표 12를 이용한 염소 DNA 증폭용 프라이머 : GenBank accession number GU229278.1의 미토콘드리아 사이토크롬 B 유전자 증폭, 비교-All-F의 전방 프라이머와 Capra-R의 후방 프라이머.
* 표 12를 이용한 돼지 DNA 증폭용 프라이머 : GenBank accession number EF545590.1의 미토콘드리아 사이토크롬 B 유전자 증폭, 비교-All-F의 전방 프라이머와 비교-Pig-R의 후방 프라이머.
* 표 12를 이용한 소 DNA 증폭용 프라이머 : GenBank accession number JN817351.1의 미토콘드리아 사이토크롬 B 유전자 증폭, 비교-All-F의 전방 프라이머와 비교-Cattle-R의 후방 프라이머.
* 표 12를 이용한 양 DNA 증폭용 프라이머 : GenBank accession number HE577850.1의 미토콘드리아 사이토크롬 B 유전자 증폭, 비교-All-F의 전방 프라이머와 비교-Sheep-R의 후방 프라이머.
* 표 12를 이용한 말 DNA 증폭용 프라이머 : GenBank accession number NC_001640.1의 미토콘드리아 사이토크롬 B 유전자 증폭, 비교-All-F의 전방 프라이머와 비교-Horse-R의 후방 프라이머.
상기 표 12의 비교대상 프라이머를 이용하면 닭 227bp, 염소 157bp, 돼지 398bp, 소 274bp, 양 331bp 및 말 439bp의 DNA 밴드를 갖는 PCR 결과물을 얻을 수 있다.
한편, 이 비교실험의 PCR 수행시, DNA 대신 물을 넣어 DNA 무처리군을 대조군으로 이용하였고, 염소의 경우, 각기 다른 3개의 개체에서 추출한 DNA(DNA ①, ② 및 ③)를 이용하였다.
또한 본 발명 프라이머 뿐만 아니라 비교 대상 프라이머에서도, 모든 축종의 DNA 증폭용 프라이머 혼합물을 제조하여 PCR을 수행하였는데, 본 발명 프라이머의 경우, 표 10에 개시된 서열번호 9 및 10의 전방 프라이머, 서열번호 11 내지 18의 후방 프라이머가 모두 혼합된 것을 사용하였으며, 비교 대상 프라이머의 경우, All-F의 전방 프라이머, Gallus-R, Capra-R, Pig-R, Cattle-R, Sheep-R, Horse-R의 모든 후방 프라이머가 혼합된 것을 사용하였다. 전방 프라이머 또는 후방 프라이머의 농도는 모두 10pM 상태인 것을 0.6㎕씩 사용하였으며, 전후방 프라이머들이 모두 혼합된 경우, 1.2㎕로 부피를 맞추어 사용하였다. 비교 프라이머 혼합물에 첨가된 각각의 프라이머 농도는 하기의 내용과 같다. All-F의 전방 프라이머 0.4pmol/㎕, 후방 프라이머 Gallus-R 1.2pmol/㎕, Capra-R 0.08pmol/㎕, Pig-R 0.24pmol/㎕, Cattle-R 0.24pmol/㎕, Sheep-R 1.2pmol/㎕, Horse-R 0.8pmol/㎕를 사용하였다.
도 2의 결과를 참고하면, 본 발명의 프라이머들은 양과 염소의 판별을 명확하게 할 수 있지만, 비교대상 프라이머를 사용한 경우에는 모든 프라이머들이 혼합되어 사용했을 경우에는 양과 염소의 DNA 판별이 어려운 것으로 확인된다.
<실시예 3. 본 발명 프라이머 혼합물 및 8총 축종의 DNA를 이용한 PCR 결과 확인>
실시예 2와 동일한 조건으로 PCR을 수행하되, 프라이머는 실시예 3에서 사용된 본 발명의 모든 축종의 DNA 증폭용 프라이머를 사용하였으며, 8종 축종의 DNA가 1종 이상 혼합된 DNA를 이용하여 PCR을 수행하였다. 이 때, 염소의 DNA는 실시예 1에서 추출한 것 중 DNA ①을 사용하였다. 상기 PCR 결과물의 DNA 전기영동 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3의 상단 그림을 참고하면, 양의 DNA와 다른 축종의 1종 DNA가 혼합한 것을 이용하여 PCR을 수행한 결과, 각 축종에 해당되는 DNA 밴드가 선명하게 확인되며, 다른 적절하지 못한 DNA 밴드는 나타나지 않는 것을 알 수 있다. 또한 도 3의 하단 그림을 참고하면, 2~8종의 축종의 DNA가 혼합된 것을 이용하여 PCR을 수행한 결과, 역시 각 축종에 해당되는 DNA 밴드가 선명하게 나타나는 것을 알 수 있다(각 축종별로 오리 148bp, 닭 231bp, 염소 315bp, 사슴 794bp, 돼지 400bp, 소 538bp, 양 665bp 및 말 1048bp의 DNA 밴드가 생성됨).
따라서, 상기 결과들을 통해 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 1번의 PCR을 수행하는 것만으로도 오리, 닭, 염소, 사슴, 돼지, 소, 양 및 말의 축종이 혼합된 식육감별을 용이하게 할 수 있는 것으로 확인되었다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (6)

  1. 오리의 12S rRNA 미토콘드리아 유전자(GenBank accession number EU755252.1 중의 Mitochondrion 12S rRNA gene),
    닭의 12S rRNA 미토콘드리아 유전자(GenBank accession number AY235571.1 중의 Mitochondrion 12S rRNA gene),
    염소의 12S rRNA 미토콘드리아 유전자(GenBank accession number GU229278.1 중의 Mitochondrion 12S rRNA gene),
    사슴의 12S rRNA 미토콘드리아 유전자(GenBank accession number NC_016178.1 중의 Mitochondrion 12S rRNA gene),
    돼지의 미토콘드리아 사이토크롬 B 유전자(GenBank accession number EF545590.1 중의 Mitochondrion cytochrome B gene),
    소의 미토콘드리아 사이토크롬 B 유전자(GenBank accession number JN817351.1 중의 Mitochondrion cytochrome B gene),
    양의 미토콘드리아 사이토크롬 B 유전자(GenBank accession number HE577850.1 중의 Mitochondrion cytochrome B gene) 및
    말의 미토콘드리아 사이토크롬 B 유전자(GenBank accession number NC_001640.1 중의 Mitochondrion cytochrome B gene)
    를 인식하는 서열번호 9~18의 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및,
    상기 중합효소연쇄반응을 통해 증폭된 PCR 산물을 전기 영동하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 오리, 닭, 염소, 사슴, 돼지, 소, 양 및 말에서 선택되는 1종 이상의 축종 판별방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 9~18의 프라이머 세트에는,
    오리, 닭, 염소 및 사슴의 미토콘드리아 12S rRNA 유전자를 인식하는 서열번호 9의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 전방 프라이머;
    돼지, 소, 양 및 말의 미토콘드리아 사이토크롬 B 유전자를 인식하는 서열번호 10의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 전방 프라이머;
    오리의 12S rRNA 미토콘드리아 유전자를 인식하는 서열번호 11의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 후방 프라이머;
    닭의 12S rRNA 미토콘드리아 유전자를 인식하는 서열번호 12의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 후방 프라이머;
    염소의 12S rRNA 미토콘드리아 유전자를 인식하는 서열번호 13의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 후방 프라이머;
    사슴의 12S rRNA 미토콘드리아 유전자를 인식하는 서열번호 14의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 후방 프라이머;
    돼지의 미토콘드리아 사이토크롬 B 유전자를 인식하는 서열번호 15의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 후방 프라이머;
    소의 미토콘드리아 사이토크롬 B 유전자를 인식하는 서열번호 16의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 후방 프라이머;
    양의 미토콘드리아 사이토크롬 B 유전자를 인식하는 서열번호 17의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 후방 프라이머; 및,
    말의 미토콘드리아 사이토크롬 B 유전자를 인식하는 서열번호 18의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 후방 프라이머;가 포함되는 것을 특징으로 하는 오리, 닭, 염소, 사슴, 돼지, 소, 양 및 말에서 선택되는 1종 이상의 축종 판별방법.
  3. 제1항에 있어서,
    PCR 산물을 전기 영동한 후, 각 축종별로 오리 148bp, 닭 231bp, 염소 315bp, 사슴 794bp, 돼지 400bp, 소 538bp, 양 665bp 및 말 1048bp의 1개 이상의 DNA 밴드가 생성되는 것을 통해 축종을 판별하는 것을 특징으로 하는 오리, 닭, 염소, 사슴, 돼지, 소, 양 및 말에서 선택되는 1종 이상의 축종 판별방법.
  4. 오리의 12S rRNA 미토콘드리아 유전자(GenBank accession number EU755252.1 중의 Mitochondrion 12S rRNA gene),
    닭의 12S rRNA 미토콘드리아 유전자(GenBank accession number AY235571.1 중의 Mitochondrion 12S rRNA gene),
    염소의 12S rRNA 미토콘드리아 유전자(GenBank accession number GU229278.1 중의 Mitochondrion 12S rRNA gene),
    사슴의 12S rRNA 미토콘드리아 유전자(GenBank accession number NC_016178.1 중의 Mitochondrion 12S rRNA gene),
    돼지의 미토콘드리아 사이토크롬 B 유전자(GenBank accession number EF545590.1 중의 Mitochondrion cytochrome B gene),
    소의 미토콘드리아 사이토크롬 B 유전자(GenBank accession number JN817351.1 중의 Mitochondrion cytochrome B gene),
    양의 미토콘드리아 사이토크롬 B 유전자(GenBank accession number HE577850.1 중의 Mitochondrion cytochrome B gene) 및
    말의 미토콘드리아 사이토크롬 B 유전자(GenBank accession number NC_001640.1 중의 Mitochondrion cytochrome B gene)
    를 인식하는 서열번호 9~18의 프라이머 세트.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 오리, 닭, 염소 및 사슴의 미토콘드리아 12S rRNA 유전자(Mitochondrion 12S rRNA gene)를 인식하는 서열번호 9의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 전방 프라이머;
    돼지, 소, 양 및 말의 미토콘드리아 유전자 중에서, 미토콘드리아 사이토크롬 B 유전자(Mitochondrion cytochrome B gene)를 인식하는 서열번호 10의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 전방 프라이머;
    오리의 12S rRNA 미토콘드리아 유전자를 인식하는 서열번호 11의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 후방 프라이머;
    닭의 12S rRNA 미토콘드리아 유전자를 인식하는 서열번호 12의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 후방 프라이머;
    염소의 12S rRNA 미토콘드리아 유전자를 인식하는 서열번호 13의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 후방 프라이머;
    사슴의 12S rRNA 미토콘드리아 유전자를 인식하는 서열번호 14의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 후방 프라이머;
    돼지의 미토콘드리아 사이토크롬 B 유전자를 인식하는 서열번호 15의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 후방 프라이머;
    소의 미토콘드리아 사이토크롬 B 유전자를 인식하는 서열번호 16의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 후방 프라이머;
    양의 미토콘드리아 사이토크롬 B 유전자를 인식하는 서열번호 17의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 후방 프라이머; 및,
    말의 미토콘드리아 사이토크롬 B 유전자를 인식하는 서열번호 18의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 후방 프라이머;가 포함되는 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
  6. 제4항 또는 제5항의 프라이머 세트를 포함하는 오리, 닭, 염소, 사슴, 돼지, 소, 양 및 말에서 선택되는 1종 이상의 축종 판별용 판별용 진단 키트.
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