KR20220135781A - 유의 종 근원 판별용 바이오 마커 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 저지 우유, 젖소 우유, 산양유의 식별(판별)용 바이오 마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 저지 우유 및 홀스타인우유, 산양유를 쉽고 빠르고 정확하게 판별할 수 있는바, 고가의 염기서열분석기기 없이 신규 분석법을 확립할 수 있으며 한우 및 수입우 개체 또는 시료 조직에 한정된 분석 분야를 넘어 우유 및 유제품의 품질 분석과 유통단속에 활용될 수 있는 장점을 가진다.

Description

유의 종 근원 판별용 바이오 마커 및 이의 용도{Biomarkers for Species origin identification of milk and uses thereof}

본 발명은 저지 우유, 젖소 우유, 산양유의 식별(판별)용 바이오 마커 및 이의 용도에 관한 것이다.

생활 수준의 향상에 따라 유제품에 대한 소비자들의 요구도 단순히 양적인 측면에서 안정성과 품질 위주로 변화하고 있으며, 특히 생산지(브랜드) 그리고 생산에서 소비에 이르는 유통과정의 신뢰성을 중요하게 생각하고 있다. 이런 변화에 따라 국내, 국내에서 유통되는 소고기에 대해서는 생산 이력제를 실시하여 개체번호, 생산지, 생산자 등 다양한 정보를 표시함으로써 축산물의 신뢰성을 높이고 있지만 우유 및 유제품에 대한 부분은 이에 미치지 못하고 있다.

저지(Jersey)는 영국의 섬 Jersey Island의 명칭으로 이곳의 소 Jersey cow는 영국 왕실용 우유를 생산하기 위해 특별히 개량된 젖소이며 저지 우유는 일반적으로 알려진 홀스타인 젖소(Holstein cow)의 우유보다 보다 칼슘, 미네랄 함량이 높아 영양학적으로 매우 우수한 품질을 갖는다(Lim 등, 2020)

영유아의 경우 빈번하게 발생하는 장염의 후유증으로 유당불내증이 있다. 장염 후 증후군이라고도 표현하며 소장 내 흡수를 담당하는 세포에서 유당 분해 효소가 있는 부분이 많이 손상되기 때문이며, 이때 장세포가 재생되는 시간을 주기 위해 한시적으로 무유당 또는 저유당 분유를 먹이기도 한다. 일반 우유 또는 분유에 비해 칼로리가 상대적으로 적기 때문에 과거에는 장염 증후군 이후에 한시적으로 사용하였으나 최근에는 영양소가 높으면서도 유당 불내증을 극복할 수 있는 산양유의 수요가 점차 증가하고 있다.

멜라노코틴 1 수용체 (melanocortin 1 receptor;MC1R) 유전자의 염기서열 분석을 통한 판별 방법은 수입육과 국내산 젖소육을 한우육으로 불법 둔갑시키는 등의 불법 유통을 근절하기 위해 쇠고기의 품종 구별에 활용된바 있다.

멜라노코틴 1 수용체 (melanocortin 1 receptor;MC1R)는 멜라닌의 확산 및 합성을 자극하는 호르몬 수용체이며 멜라닌 세포 내에 황색 또는 적색과 연관된 페오멜라닌(phaeomelanin)과 갈색 또는 흑색과 관여된 유멜라닌(eumelanin)의 색소 합성 조절에 중요한 역할을 한다. 멜라닌의 형성은 타이로시나제(tyrosinase) 효소의 농도에 따라 페오멜라닌(phaeomelanin)과 유멜라닌(eumelanin) 의 생성에 차이를 보이며 타이로시나제(tyrosinase) 활성은 확장(extension;E) 좌위를 지정하는 α-MSH 와 MC1R에 의해 조절된다 (Klungland 등, 1995; Cone 등, 1996).

MC1R 유전자의 분석과 관련하여, MC1R 유전자를 이용한 한우육의 판별과 관련하여 관련 선행 기술들이 일부 확인되는 바가 있다. 예를 들어, 대한민국특허출원 제10-2001-008523호 “한우 및 젖소고기의 판별을 위한 디엔에이 표지인자판별방법”은 MC1R 유전자의 99번 및 104번 아미노산에 해당하는 코돈을 MspA1I 와 BsrFI 제한효소를 이용하여 PCR 증폭 산물의 제한효소 절단 형태에 따른 패턴차이로 한우육과 젖소육의 구분을 제시하고 있다.

그러나 우유 및 유제품에 대해서 품종과 관련된 특허가 등록된 적이 없으며 관련 연구 또한 사례를 찾아보기 힘들다.

이에 본 발명자들은 상기 문제들을 해소하기 위하여 예의 노력하였다.

그 결과, 포유동물의 모색 유전에 관여하는 MC1R 유전자의 단일염기다형성 위치를 분석함으로써 저지 우유 및 홀스타인 젖소 우유를 판별하는 방법을 완성하였다. 구체적으로, MC1R 유전자의 99번째 아미노산을 암호화하는 코돈에 해당하는 296번째 염기의 단일염기다형성 여부를 분석하기 위해 CCG 염기 서열을 갖는 코돈을 인식하는 프라이머, 소와 산양의 종 특이적 프라이머를 사용하여 시중에 유통되는 우유 및 산양유 의 종 근원을 판별할 수 있는 프라이머; 이를 이용한 우유 및 산양유의 판별용 조성물; 키트 및 이를 이용한 우유 및 산양유를 판별하는 방법을 완성하였다.

대한민국특허출원 제10-2001-008523호

본 발명의 목적은 소의 MC1R 유전자의 99번째 아미노산 코돈의 단일염기다형성 부위(SNP; single nucleotide polymorphism)와 특이적으로 결합하는 우유 종 근원 판별을 위한 프라이머, 단일염기다형성 마커를 검출할 수 있는 제제 및 우유와 산양유의 판별을 위한 소 특이적 프라이머, 산양 특이적 프라이머를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머를 이용하여 저지 우유, 홀스타인 젖소 우유 및 산양유의 판별방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,

본 발명은 (a) 검체 시료 또는 이로부터 분리된 핵산 시료를 준비하는 단계; 및

(b) 상기 검체 시료 또는 이로부터 분리된 핵산 시료를 템플릿으로 하여 서열번호 4의 및 서열번호 5로 표시되는 프라이머 쌍; 서열번호 6 및 서열번호 7로 표시되는 프라이머 쌍; 및 서열번호 8 및 서열번호 9로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 다중-중합효소연쇄 반응을 수행하는 단계;를 포함하는, 유(乳)의 종 근원 판별 방법을 제공한다.

다수의 저지 우유와 홀스타인 젖소 우유를 대상으로 MC1R(melanocortin 1 receptor) 유전자의 염기서열을 분석한 결과, 99번째 아미노산을 코딩하는 코돈이 저지 우유의 경우 CTG 호모형이나, 홀스타인 젖소 우유의 경우 CCG 호모형임을 확인하였다. 이에 따라 홀스타인 젖소 우유의 코돈 부위와 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머를 선택하여 염기특이적 중합효소연쇄반응(AS-PCR;allele specific PCR)을 수행함으로써 저지 우유와 홀스타인 젖소 우유를 판별할 수 있음을 확인하였다. 또한 소의 종 내에서 공통적으로 존재하는 유전자 부위 및 산양 종 내에서 공통적으로 존재하는 유전자 부위를 각각 분석하여 종 특이적 프라이머 세트를 이용한 중합효소연쇄반응을 통해 우유와 산양유를 판별할 수 있음을 확인하였고 이를 토대로 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명에 따른, 종 근원 판별 방법은 검체 또는 이의 시료로부터 손쉽게 유(乳)의 종 근원을 판별할 수 있는 장점을 가진다. 특히, 저지 우유 및 홀스타인우유, 산양유를 쉽고 빠르고 정확하게 판별할 수 있는바, 고가의 염기서열분석기기 없이 신규 분석법을 확립할 수 있다. 또한, 한우 및 수입우 개체 또는 시료 조직에 한정된 분석분야를 넘어 우유 및 유제품의 품질 분석과 유통단속에 활용될 수 있다.

본 발명은 MC1R 유전자의 99번째 아미노산을 암호화하는 코돈의 단일염기다형성 부위를 분석하기 위하여 CCG 염기서열을 갖는 코돈을 인식하는 서열번호 4 및 서열번호 5의 프라이머와 우유 및 산양유의 종 근원 판별을 해 종 특이적인 염기서열에 결합하는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 프라이머를 동시에 사용하여 우유의 품종과 함께 산양유를 판별하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 상기 “판별”은 대상, 예컨대 가축, 또는 이로부터의 시료, 예를 들어 우유, 산양유, 유제품을 이용하여 해당 우유, 산양유, 또는 유제품의 종류를 판단하고 판정할 수 있는 정보를 제공하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 판별은 유(乳)가 유래되는 종의 근원을 판별하는 것을 의미할 수 있다.

본 발명에서 유는 소를 포함하여, 염소, 양, 산양 등 젖을 생산할 수 있는 다양한 종의 가축으로부터 생산되는 분비 물질을 포함한다.

유는 종(소, 염소, 산양, 양 등) 및 품종 [홀스테인, 저지(Jersey) 등]에 따라 그 구성 성분 및 이의 맛이 상이하다.

우유를 생산할 수 있는 소는 예를 들어, 홀스타인(Holstein)종, 저지종(Jersey; 브레톤, 노르만디), 건지(Guernsey)종, 에어셔(ayrshire)종 등 가축으로 사육되는 소 등을 포함하며, 본 발명에 따르면 우유생산을 목적으로 하는 공지된 모든 소를 포함한다.

본 발명에 따른 구체적 실시양태에 따르면, 유의 종 근원 판별 방법을 위한 종의 대상은 소 및 산양일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 구체적 실시양태에 따르면, 유의 종 근원 판별 방법을 위한 품종의 대상은 홀스테인 및 저지(Jersey)을 포함한다.

또한, 본 발명에 따른 구체적 실시양태에 따르면 유의 종 근원 판별 방법은 소, 산양을 구별하면서 소의 품종으로 홀스테인 및 저지(Jersey)을 구별한다. 즉, 저지(Jersey) 종 근원 유, 홀스테인(Holstein) 종 근원 유 또는 산양(Goat) 근원 유에 관한 종 근원 판별 방법일 수 있다.

본 발명의 유의 종 근원 판별 방법은 (a) 검체 시료 또는 이로부터 분리된 핵산 시료를 준비하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따르면 검체 시료를 직접 이용하거나 이로부터 분리된 핵산 시료를 이용할 수 있다.

상기 시료를 준비하는 단계에 있어서 시료 수득의 부위는 특별히 한정된 것은 아니며, 일례로, 검체 시료로 우유, 산양유, 및 기타 유제품으로부터 직접 분석 가능하다. 보다 구체적으로, 다양한 형태의 유 형태를 모두 포함할 수 있으며, 비멸균 유, 저온 살균 유, 초고온 멸균 유, 고온 멸균 유, 농축 유, 분유 등을 포함하는 유의 비가공 및 가공 형태를 의미한다.

또한, 검체 시료로부터 분리된 핵산 시료를 이용할 수 있다. 본 발명의 일례로, 출발물질이 gDNA인 경우 gDNA의 분리는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있으며, 출발물질이 mRNA인 경우에는 역전사효소를 이용하여 cDNA로 합성될 수도 있다. 본 발명에 따르면, 조직으로부터 DNA를 추출할 수 있는 상업적 키트를 제한없이 사용할 수 있으며, 본 발명의 일실시양태에 의하면 Genomic DNA Prep Kit 를 사용하여 제조사의 지침에 따라 DNA를 수득하였다.

본 발명의 유의 종 근원 판별 방법은 (b) 상기 검체 시료 또는 이로부터 분리된 핵산 시료를 템플릿으로 하여 서열번호 4의 및 서열번호 5로 표시되는 프라이머 쌍; 서열번호 6 및 서열번호 7로 표시되는 프라이머 쌍; 및 서열번호 8 및 서열번호 9로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 다중-중합효소연쇄 반응을 수행하는 단계;를 포함한다.

본 발명에 따른 상기 프라이머 쌍은 아래 서열번호 4 내지 9로 나타낼 수 있다:

MC1R Forward primer (서열번호 4) : acgtgctggagacggcagtcattcc

MC1R Reverse primer (서열번호 5): tgtcacaacactgtggtaccgcagg

COX1_Bovidae Forward primer(서열번호 6): tcatcaataggctcattcatttcc

COX1_Bovidae Reverse primer(서열번호 7): tttgtcgtggttaagtctacagtc

COX1_ Goral Forward primer(서열번호 8): gctggtatagtaggaaccgccc

COX1_Goral Reverse primer(서열번호 9): tagatttggtcatctccgagtaga

상기 프라이머 서열은 PCR을 수행하기 위한 적합한 서열로써 서열의 일부 또는 전부를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 본 발명의 유의 종 근원 판별 방법은 1) 소와 산양 각각으로부터 유래되는 유(乳)의 종류를 구별해주는 COX1을 기초로 하는 프라이머 쌍들과 2) 소의 품종을 구별하여 주는 MC1R을 기초로 하는 프라이머쌍을 포함하여 다중-중합효소연쇄반응을 수행하여 소와 산양 근원(유래)의 유를 구별할 뿐만 아니라 소의 품종에 관한 분석 정보까지 제공을 한다.

구체적으로, 서열번호 4 및 서열번호 5의 프라이머쌍을 이용하는 경우 소의 품종으로 홀스테인 및 저지(Jersey)에 관한 품종 근원 정보를 제공한다. 본 발명에 따른 프라이머 서열을 이용하는 경우, 홀스타인 우유에서 296C 유전자형의 증폭산물인 200bp의 PCR product를 얻음으로써 품종에 관한 구별 정보를 제공한다. 이러한 서열번호 4 및 서열번호 5의 프라이머쌍은 염기 특이적 중합효소연쇄반응(AS-PCR;allele specific PCR)에 적합하다.

구체적으로, 서열번호 6 및 서열번호 7의 프라이머쌍; 및 서열번호 8 및 서열번호 9의 프라이머쌍을 이용하는 경우 소와 산양 유래 유에 대한 근원 구별 정보를 제공한다. 본 발명에 따른 프라이머 서열을 이용하는 경우, 산양유에서는 산양 특이적 증폭산물인 86bp의 PCR product를 확인하고, 소에서는 소 특이적 증폭산물인 113bp의 PCR product를 확인함으로써 위 각각 두 종 유래 유에 관한 정보를 제공한다.

구체적으로, 서열번호 4 및 서열번호 5의 프라이머쌍; 서열번호 6 및 서열번호 7의 프라이머쌍; 및 서열번호 8 및 서열번호 9의 프라이머쌍을 이용하는 경우, 소와 산양 유래 유에 대한 구별 정보와 함께 소의 품종에 관한 정보를 함께 제공한다. 본 발명의 프라이머 쌍의 조합을 이용하면, 저지 우유에서는 소 특이적 증폭산물인 113bp의 PCR product를 확인할 수 있고, 홀스타인 우유에서는 소 특이 증폭산물인 113bp 및 296C 유전자형의 증폭산물인 200bp의 PCR product를 확인할 수 있고, 산양유에서는 산양 특이적 증폭산물인 86bp의 PCR product를 확인할 수 있다. 이에 따라, 유의 구체적 정보를 판별할 수 있다.

본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 PCR 산물을 전기영동한 후 저지 우유는 113bp의 소 특이적 증폭 산물; 홀스타인 젖소 우유는 200bp의 296-C 유전자형 증폭 산물과 113bp의 소 특이적 증폭 산물; 산양유는 86bp의 산양 특이적 증폭산물이 생성된다.

위 정보 제공에 있어서 구별되는 크기를 가지는 PCR product를 이용함으로서 다중-중합효소연쇄 반응법에 적합한 세트를 구성하였다.

본 발명의 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시된다. 프라이머는 유전자 증폭 반응(amplification reactions)에 이용된다. 본 명세서에서 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다.

일반적인 PCR과는 달리 유전자형을 분석하는 Allele specific PCR은 단 하나의 염기차이에 의해 증폭 유무가 결정되어야 하기 때문에 PCR 반응조건의 설정 난이도가 매우 높으며, 이를 바탕으로 한 번의 반응 시 다수의 유전자 좌위를 특이적으로 증폭하는 Multiplex Allele specific PCR은 핵심 단백질인 핵산중합효소 (DNA polymerase), 완충용액 (Buffer), 프라이머의 길이 및 서열 변형, 중합효소 연쇄 반응의 조건 등이 매우 까다롭고 정확하게 설정되어야 한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제"란, 시료에 포함된 해당 SNP를 확인하는 방법에 사용되는 제제를 의미하는데, 바람직하게는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅(Northern blotting), 유전자 칩 분석법 등의 방법에 사용되는 표적 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체가 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

명세서에서 사용되는 용어 "프라이머"는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 구체적으로는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정된다. 용어 "어닐링" 또는 "프라이밍"은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.

본 발명의 방법을 프라이머를 이용하여 실시하는 경우에는, 다중-중합효소연쇄 반응을 실시하여 분석 대상에서 타겟 유전자들을 동시에 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 시료에서 추출한 DNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 '클레나우(Klenow)' 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소 등이 예시적으로 사용된다.

중합효소연쇄 반응을 실시할 때에는 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 반응에 필요한 성분들의 과량은, 반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg²⁺와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 필요하다. 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다.

본 발명에 있어서 어닐링은 타겟 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

다중-중합효소연쇄 반응은 94-95℃에서 주형 DNA를 전 변성시킨 후, 변성(denaturation); 결합(annealing); 및 증폭(extension)의 사이클을 거친 후, 최종적으로 72℃에서 연장(elongation)시키는 일반적인 PCR 반응 조건에서 수행될 수 있다. 상기에서 변성 및 증폭은 94-95℃ 및 72℃에서 각각 수행될 수 있으며, 어닐링은 60 내지 67℃ 에서 수행될 수 있다. 각 단계의 시간과 싸이클 수는 당업계에 일반적으로 행해지는 조건에 따라 정해질 수 있다.

당업계에서 널리 공지된 방법에 따라 다중-중합효소연쇄 반응 산물의 DNA를 크기별로 분리할 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 진단 방법은 (c) 다중-중합효소연쇄 반응 산물을 크기별로 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다.

바람직하게는 아가로스 겔(agarose gel) 또는 폴리아크릴아미드 전기영동 또는 형광분석장치에 의해 확인할 수 있다. 이 때, 형광분석장치를 이용하기 위해서는 당업계에 공지된 형광 다이(dye)를 붙인 프라이머쌍을 이용하여 상기 (b)단계에서 PCR을 수행한다. PCR 증폭 결과는 바람직하게는 아가로스 겔 전기영동에 의해 확인할 수 있다. 전기영동 후 에디듐 브로마이드 (ethidium bromide) 염색으로 전기영동 결과를 분석할 수 있다. 일반적인 PCR 수행 및 그 결과 분석 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.

또한, 다중 리얼타임(multiplex real-time) PCR로 한 번의 실시간 PCR 반응으로 여러 개의 원하는 유전자를 동시에 증폭시켜, 이를 이용하여 동시에 검출하고 확인할 수도 있다.

상기 분리된 다중-중합효소연쇄 반응의 산물을 기초로 유의 품종 분석/구별에 관한 구체적 정보를 제공할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 멀티플렉스 PCR 반응 조건은 95℃에서 15분 1회 진행하고, 95℃에서 20초와 60℃에서 40초 및 72℃에서 60초를 35회 반복한 후, 72℃에서 3분 1회 진행될 수 있다.

또한, 본 발명의 일실시예에 있어서, 분리된 핵산 분자를 사용하는 대신 우유 또는 산양유가 직접 사용될 수 있다.

본 발명에 따르면, 서열번호 4 및 서열번호 5의 프라이머 세트를 이용한 PCR 산물이 증폭되었을 때 홀스타인 젖소 우유로 판단하며 증폭산물이 확인되지 않을 경우 저지 우유로 판단한다.

또한, 서열번호 6 및 서열번호 7의 프라이머 세트를 이용한 PCR 산물이 증폭되었을 때 소 품종으로부터 유래한 우유로 판단한다.

또한, 서열번호 8 및 서열번호 9의 프라이머 세트를 이용한 PCR 산물이 증폭되었을 때 산양 품종으로부터 유래한 산양유로 판단한다.

본 발명은 서열번호 4 및 서열번호 5의 프라이머 쌍을 포함하는 유의 종 근원 판별용 조성물을 제공한다.

본 발명은 서열번호 6 및 서열번호 7로 표시되는 프라이머 쌍; 및 서열번호 8 및 서열번호 9로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는 우유 및 산양유의 종 근원 판별용 조성물을 제공한다.

본 발명은 서열번호 4의 및 서열번호 5로 표시되는 프라이머 쌍; 서열번호 6 및 서열번호 7로 표시되는 프라이머 쌍; 및 서열번호 8 및 서열번호 9로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는 유의 종 근원 판별용 조성물을 제공한다.

본 발명은 서열번호 4 및 서열번호 5의 프라이머 쌍을 포함하는 우유의 종 근원 판별용 키트를 제공한다.

본 발명은 서열번호 6 및 서열번호 7로 표시되는 프라이머 쌍; 및 서열번호 8 및 서열번호 9로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는 우유 및 산양유의 종 근원 판별용 키트를 제공한다.

본 발명은 서열번호 4의 및 서열번호 5로 표시되는 프라이머 쌍; 서열번호 6 및 서열번호 7로 표시되는 프라이머 쌍; 및 서열번호 8 및 서열번호 9로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는 유의 종 근원 판별용 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 키트 또는 조성물은 검체/시료의 종 및/또는 품종이 어떠한 종류인지 특이적으로 구별이 가능하며 신속하면서 편리하게 구별 및 정보 제공을 할 수 있는 유용한 지표를 제공함으로써 우수한 효과를 나타낸다.

상기 키트는 프라이머들을 하나의 튜브에 포함하는 것을 특징으로 하는 키트이다. 상기 키트는 예를 들어, 버퍼, DNA 중합효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 타겟 증폭 PCR 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있으며, 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함하는 것도 가능하다.

이러한 키트를 이용하면, 공통의 PCR 조건을 가지고 본 발명에서 제작한 3종의 프라이머 세트들을 포함하여, 다중-중합효소 연쇄반응을 실시하여 1회 PCR을 수행함으로써 검체로부터 구체적 구별 정보를 제공하는 것이 가능하다.

본 발명의 프라이머 세트를 이용하는 경우 저지 우유 및 홀스타인우유, 산양유를 쉽고 빠르고 정확하게 판별할 수 있는바, 고가의 염기서열분석기기 없이 신규 분석법을 확립할 수 있다. 또한, 한우 및 수입우 개체 또는 시료 조직에 한정된 분석분야를 넘어 우유 및 유제품의 품질 분석과 유통단속에 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 MC1R 유전자의 296번째 염기위치를 포함하는 컨센서스 서열(consensus sequence) 정보 및 프라이머 결합 위치이다. (NCBI: AF445642.1)
도 2는 소 특이적 프라이머 위치를 포함하는 소의 COX1 유전자 컨센서스 서열((consensus sequence) 정보이다. (NCBI: NC_006853.1)
도 3은 산양 특이적 프라이머 위치를 포함하는 산양의 COX1 유전자 컨센서스 서열(consensus sequence)정보이다. (NCBI: MG742694.1)
도 4는 우유 원액, 원액 원심 분리 후 상층액, Boiling 및 원심분리 후 상층액 및 gDNA를 사용하여 멀티플렉스 PCR을 진행한 결과이다.
도 5는 저지 원유, 홀스타인 원유, 산양유 원유를 대상으로 실험을 진행한 멀티플렉스 PCR 결과이다.
도 6은 시중에 유통되고 있는 일반 우유, 저지 우유, 산양유를 대상으로 실험을 진행한 멀티플렉스 PCR 결과 이다.
도 7은 저지 원유와 시중에 유통되고 있는 저지 우유 및 일반 우유를 대상으로 MC1R 유전자의 99번째 아미노산 코돈에 해당하는 296번째 염기서열을 비교 정렬한 결과이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

<실시예>

재료

저지 원유 (서울우유 연구소), 산양유 원유 (임실), 시중 유통 우유 및 산양유, One-Step 2X multiplex PCR Mix (Misogene), oligonucleotide (cosmpgenetech), 50 ~ 500mM Tris-HCl (pH 9.0), 1 ~ 10mM MgCl2, 10 ~ 500mM (NH4)2SO4, 0.001 ~ 0.1% BSA, Hot start DNA polymerase (2.5U/ul), Genomic DNA Prep Kit (Nanohelix), HPLC water (Merck)

실시예 1: DNA 준비

DNA의 추출은 Nanohelix 사의 Genomic DNA Prep Kit (Cat No. GCTN200)을 사용하였다. DNA의 정량 분석은 Spectrophometer ND-1000(Nanodrop, USA)을 이용하였으며, 260 - 280nm에서 흡광도를 측정하여 DNA의 농도 및 순도를 확인하였다. 추출한 DNA는 멸균 증류수를 이용하여 모두 20 ng/ul로 보정한 후 실험 사용 전까지 -20℃에 보관하였다.

실시예 2: 다중 중합효소연쇄반응(Multiplex PCR) 수행을 위한 프라이머 디자인

상기 실시예 1에서 추출된 DNA를 증폭하기 위하여 NCBI에 등록된 소의 MC1R(Bostaurus melanocortin 1 receptor, AF445642.1, 서열번호 1), 소의 COX1(Cytochrome C oxidase subunit 1, NC_006853.1, 서열번호 2) 및 산양의 COX1(Cytochrome C oxidase subunit 1, MG742694.1, 서열번호 3) 유전자를 인식하도록 프라이머를 디자인하였다.

관련 서열에 관한 구체적 정보와 증폭 산물에 관한 정모를 도 1 내지 도 3에 나타내었다. 도 1, 2, 또는 3 각각은 MC1R(Bostaurus melanocortin 1 receptor, AF445642.1), 소의 COX1(Cytochrome C oxidase subunit 1, NC_006853.1) 또는 산양의 COX1(Cytochrome C oxidase subunit 1, MG742694.1) 의 증폭 대상 산물 및 관련 서열에 관한 정보를 구체적으로 나타낸다.

상기 프라이머 서열은 서열번호 4 내지 9로 나타내었다. 서열번호 4~9의 전체 염기서열에 대한 프라이머를 합성(㈜코스모진텍)하였다. 각각의 프라이머의 정보 및 증폭 산물의 크기 등의 정보는 하기 [표 1]에서 자세히 나타내었다.

우유 및 산양유 판별용 프라이머 정보

서열번호	이름	프라이머 서열 (5` to 3`)	증폭 사이즈 (bp)
4	296C-F	ACGTGCTGGAGACGGCAGTCATTCC(서열번호 4)	200
5	296C-R	TGTCACAACACTGTGGTACCGCAGG(서열번호 5)
6	Bovine-F	TCATCAATAGGCTCATTCATTTCC(서열번호 6)	113
7	Bovine-R	TTTGTCGTGGTTAAGTCTACAGTC(서열번호 7)
8	Goral-F	GCTGGTATAGTAGGAACCGCCC(서열번호 8)	86
9	Goral-R	TAGATTTGGTCATCTCCGAGTAGA(서열번호 9)

상기 디자인된 서열을 Multiplex PCR을 위한 프라이머 서열로 사용하였다.

실시예 3: 우유의 상이한 상태로부터 분리된 DNA를 기초로 하는 PCR 진행 확인

저지 우유 원액, 원액 원심 분리 후 상층액, Boiling 및 원심분리 후 상층액 및 우유에서 분리한 gDNA를 사용하여 위 서열번호 4-9를 이용하여 하기 조건 하에 PCR을 수행하였다.

PCR 반응액은 Template 2 ul (20ng/ul의 gDNA, 원액, 상층액 중 택1), One-step 2X multiplex PCR Mix 10 ul, primer mixture 3 ul를 혼합한 후 멸균된 증류수를 첨가하여 최종 20 ul가 되도록 준비하였다. 최적화된 PCR 반응 온도 및 시간은 95℃에서 15 분 1회, 95℃에서 20초와 60℃에서 40초 및 72℃에서 60초를 35회 반복한 후 72℃에서 3분 1회 진행하는 것으로 결정하였다. 최종 반응 산물의 확인을 위해 5ul의 반응 산물을 3% 아가로스 젤에 로딩하여 250V에서 30분간 전기영동을 진행한 후 UV trans-illuminator로 결과를 확인하였다.

도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 우유 원액 뿐만 아니라, 상층액, Boiling된 상층액 등을 이용하는 경우에도 동등한 수준으로 PCR 산물이 확인되었다. 저지 우유를 대상으로 진행한 실험이므로 소 특이적 증폭산물인 113bp의 PCR product가 확인되었으며 홀스테인 특이적인 200bp의 PCR product 및 산양 특이적 86 bp의 PCR product는 확인되지 않았다. 상기 결과로부터 본 발명에 따른 프라이머가 다양한 조건의 우유에 대해 사용 가능하며 gDNA를 사용한 실험결과와 동등함을 확인하였다.

실시예 4: Multiplex PCR 조건 설정 및 우유 판별 확인

<4-1> PCR condition 설정

PCR 반응액은 genomic DNA 2 ul (20ng/ul), One-step 2X multiplex PCR Mix 10 ul, 혼합된 primer mixture 3 ul를 혼합한 후 멸균된 증류수를 첨가하여 최종 20 ul가 되도록 준비하였다. 최적화된 PCR 반응 온도 및 시간은 95℃에서 15 분 1회, 95℃에서 20초와 60℃에서 40초 및 72℃에서 60초를 35회 반복한 후 72℃에서 3분 1회 진행하는 것으로 결정하였다. 최종 반응 산물의 확인을 위해 5ul의 반응 산물을 3% 아가로스 젤에 로딩하여 250V에서 30분간 전기영동을 진행한 후 UV trans-illuminator로 결과를 확인하였다.

(1) Multiplex PCR 결과 (1회차)

저지우유 2종, 홀스타인우유, 이담-산양우유, 푸름숲-산양유, 큰고을-산양유에 대하여 위 조건 하에 Multiplex PCR을 수행하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 상기 실험에 있어서는 우유 원액으로부터 분리된 DNA를 사용하여 실험을 수행하였다.

도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 저지 우유에서는 소 특이적 증폭산물인 113bp의 PCR product를 확인할 수 있었고, 홀스타인 우유에서는 소 특이적 증폭산물인 113bp 및 296C 유전자형의 증폭산물인 200bp의 PCR product를 확인할 수 있었다. 또한, 산양유에서는 산양 특이적 증폭산물인 86bp의 PCR product를 확인할 수 있었다.

(2) Multiplex PCR 결과 (2회차)

시중에서 판매되고 있는 다양한 우유들에 대하여도 동일 결과를 확보할 수 있는지 확인하기 위하여, 12종의 우유에 대하여 관련 실험을 수행하였다.

구체적으로, 상업적으로 판매되고 있는 서울우유, 영국우유, 부산우유, 연세우유, 건국우유, 파스퇴르우유, 남양우유, 매일우유, 푸룸숲농장산양유, 큰고을농원 산양유, 이담산양유의 총 12종의 샘플을 구하고, 우유 원액으로부터 추출된 DNA를 이용하였다.

위 조건 하에 Multiplex PCR을 수행하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에서 정확히 확인되는 바와 같이, 저지 우유에서는 소 특이적 증폭산물인 113bp의 PCR product를 확인할 수 있었고, 홀스타인 우유에서는 소 특이적 증폭산물인 113bp 및 296C 유전자형의 증폭산물인 200bp의 PCR product를 확인할 수 있었다. 또한, 산양유에서는 산양 특이적 증폭산물인 86bp의 PCR product를 확인할 수 있었다.

<4-2> 염기서열분석 및 다중서열비교정렬 결과

저지 우유와 홀스타인 우유의 실험 결과에 대한 교차검증을 위해 저지 우유와 홀스타인 우유에서 회수한 genomic DNA를 대상으로 99번째 아미노산 코돈 위치를 포함하는 MC1R 유전자 부위를 증폭하여 클로닝을 진행하였고 염기서열분석은 ㈜코스모진텍에 의뢰하였다.

그 결과 도 7에서 나타낸 바와 같이, 저지 우유(시료번호1~7)에서는 99번째 아미노산 코돈에 해당하는 염기서열이 CTG 인 반면, 홀스타인 우유(8~14)에서는 CCG 임을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명의 프라이머 쌍을 이용한 멀티플렉스 PCR 결과에서 CCG 코돈을 인식하여 증폭산물이 확인되는 실험결과와 일치한다.

상기 결과로부터 본 발명에 따른 Multiplex PCR용 프라이머 세트들이 저지우유, 홀스타인우유 및 산양우유 구별에 우수한 효과를 나타냄을 확인하였다. 특히, 고가의 염기서열분석기기 없이 Multiplex PCR을 통해 쉽고 빠르게 유의 종류를 분류할 수 있다는 점에서 큰 장점을 지닌다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> MisoGene Corp. <120> Biomarkers for Species origin identification of milk and uses thereof <130> 1 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1770 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MC1R <400> 1 ctaccgcggc ccggtaaggc aggaggtccc cacaggacag gaggaggcaa gcggcccaga 60 aatgtctgcc tgtgggcaac cgcacatcca gggaagaggt ggggaggcgg actgagaaca 120 gaagagcgaa gccgcgccca gagggctggc cccataagct tggggccatg cctgggccga 180 catttgtcca gccagggagg ggaggtgtga ggcccctccc aggggagcca tgagttgagc 240 aggaccctga gagcaagcac cccttcctgc tccctgcggg acgatgcctg cacttggctc 300 ccagaggcgg ctgctgggtt cccttaactg cacgccccca gccaccctcc ccttcaccct 360 ggcccccaac cggacggggc cccagtgcct ggaggtgtcc atccctgacg ggctctttct 420 cagcctgggg ctggtgagtc tcgtggagaa cgtgctggta gtggctgcca ttgccaagaa 480 ccgcaacctg cactccccca tgtactactt tatctgctgc ctggctgtgt ctgacttgct 540 ggtgagcgtc agcaacgtgc tggagacggc agtcatgcyg ctgctggagg ccggtgtcct 600 ggccacccag gcggccgtgg tgcagcagct ggacaatgtc atcgacgtgc tcatctgcgg 660 atccatggtg tccagcctct gcttcctggg tgccattgct gtggaccgct acatctccat 720 cttctacgcc ctgcggtacc acagtgttgt gacactgccc cgagcgtgga ggatcattgc 780 ggccatctgg gtggccagca tcctcaccag cctgctcttc atcacctact acaaccacaa 840 ggtcatcctg ctgtgcctcg ttggcctctt catagctatg ctggccctga tggccgtcct 900 ctacgtccac atgctggccc gggcctgcca gcatgcccgg ggcattgccc ggctccagaa 960 gaggcagcgc cccattcatc agggctttgg cctcaagggc gctgccaacc tcaccatcct 1020 gctgggcgtc ttcttcctct gctggggccc cttcttcctg cacctctcgc tcatcgtcct 1080 ctgcccccag caccccacct gtggctgcat cttcaagaac ttcaacctct tcctggccct 1140 catcatttgc aacgccattg tggaccccct catctatgcc ttccgcagcc aggagctccg 1200 gaagacgctc caagaggtgc tgcagtgctc ctggtgaggg tggcagtgcc gtcgtgtgcc 1260 ccaggcctgt gaggccaggg cagtcccttg acaaagagga tcggctagac catccctgaa 1320 ggtgagggtg cacaggcctt tggggcctga gaggggaatc tcaggactct ccaggaggct 1380 gtgcagaatg aggaggctgg ggagatggtg gggcatggcc tcccacacct agaaaggagg 1440 gcccccaccc ctccatctgg ggccccactc tggggccggt gcccacaccc caccccaccc 1500 aaagctgtgg gaagtcccgc tccaaggact tcatgaccag cacaggagga ggtggggccc 1560 acagtggggg gcttttctct tctaacgctc tgtggtgact gggagccggg ctcagcccgt 1620 ctgccagcag cacatgcatt cggcagacac cccagccagg cctgctctgg ggaaccagca 1680 gccaatatgc aggctccagg gccaggaagc agtgcagcag tattaataaa cgtgatgctt 1740 ggtgcaacct caaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1770 <210> 2 <211> 1545 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX1_Bovine <400> 2 atgttcatta accgctgact attctcaacc agccataaag atattggtac cctttatcta 60 ctatttgatg cttgggccgg tatagtagga acagctctaa gccttctaat tcgcgctgaa 120 ttaggccaac ccggaactct gctcggagac gaccaaatct acaacgcagt tgtaaccgca 180 cacgcatttg taataatctt cttcatagta ataccaatca taattggagg attcggtaac 240 tgacttgttc ccctaataat tggtgctccc gatatagcat ttccccgaat aaataatata 300 agcttctgac tcctccctcc ctcattccta ctactcctcg catcctctat agttgaagct 360 ggggcaggaa caggctgaac cgtgtaccct cccttagcag gcaacctagc ccatgcagga 420 gcttcagtag atctaaccat tttctcttta cacttagcag gagtttcctc aattttagga 480 gccatcaact tcattacaac aattatcaac ataaagcccc ccgcaatgtc 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1380 tccctaacag cagttatact aatagttttc atcatctgag aagcatttgc atctaaacga 1440 gaagtcttga ctgtagactt aaccacgaca aatctagaat gattaaacgg atgccctcca 1500 ccatatcaca catttgaaga acccacctat gttaacctaa aataa 1545 <210> 3 <211> 666 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX1_Goral <400> 3 tacctcctat ttggtgcctg agctggtata gtaggaaccg ccctaagcct attaattcgc 60 gctgaactag gccaacccgg gactctactc ggagatgacc aaatctacaa cgtaattgta 120 accgcacatg catttgtaat aatttttttc atagtaatgc ctattatgat gggaggattt 180 ggtaattgac tagtcccctt aataattgga gcccctgata tagccttccc ccggataaac 240 aatataagct tttgactcct ccccccctcc ttcttattac tcctagcatc ctctatagtc 300 gaagccggag caggaacggg ttgaaccgta taccctcccc tagcaggcaa cttagcccac 360 gcaggagcct cagtagacct gactattttc tctctacact tggcaggtgt ctcctcaatt 420 ttaggagcca ttaattttat tacaactatt attaacataa aaccccctgc aatatcacaa 480 taccaaaccc ccctattcgt gtgatctgta ctgatcactg ccgtactact cctcctctca 540 ctccccgtat tagcagccgg aattacaata ctgctaacag accgaaacct gaacacaacc 600 ttctttgacc cagcaggagg aggagaccct attttatatc aacacctatt ctgattcttt 660 ggacac 666 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 296C-F <400> 4 acgtgctgga gacggcagtc attcc 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 296C-R <400> 5 tgtcacaaca ctgtggtacc gcagg 25 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bovine-F <400> 6 tcatcaatag gctcattcat ttcc 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bovine-R <400> 7 tttgtcgtgg ttaagtctac agtc 24 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Goral-F <400> 8 gctggtatag taggaaccgc cc 22 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Goral-R <400> 9 tagatttggt catctccgag taga 24

Claims (5)

1. (a) 검체 시료 또는 이로부터 분리된 핵산 시료를 준비하는 단계; 및
   (b) 상기 검체 시료 또는 이로부터 분리된 핵산 시료를 템플릿으로 하여 서열번호 4의 및 서열번호 5로 표시되는 프라이머 쌍; 서열번호 6 및 서열번호 7로 표시되는 프라이머 쌍; 및 서열번호 8 및 서열번호 9로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 다중-중합효소연쇄 반응을 수행하는 단계;를 포함하는, 유(乳)의 종 근원 판별 방법.
2. 제1항에 있어서, 유의 종 근원 판별 방법은 저지(Jersey) 종 근원 우유, 홀스테인(Holstein) 종 근원 우유 또는 산양(Goat) 근원 우유에 관한 종 근원 판별 방법인, 유의 종 근원 판별 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 검체 시료는 비멸균 유, 저온 살균 유, 초고온 멸균 유, 고온 멸균 유, 농축 유 및 분유로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 유의 종 근원 판별 방법.
4. 제1항에 있어서, 서열번호 4 및 서열번호 5의 프라이머쌍은 홀스테인 및 저지(Jersey)에 관한 품종 근원 판별 정보를 제공하며,
   서열번호 6 및 서열번호 7의 프라이머쌍; 및 서열번호 8 및 서열번호 9의 프라이머쌍은 소와 산양에 관한 종 근원 판별 정보를 제공하는 것인, 유의 종 근원 판별 방법.
5. 서열번호 4의 및 서열번호 5로 표시되는 프라이머 쌍; 서열번호 6 및 서열번호 7로 표시되는 프라이머 쌍; 및 서열번호 8 및 서열번호 9로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는 유의 종 근원 판별용 키트.

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