CN112795665A - 一种牛源性成分的lamp检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种牛源性成分的LAMP检测方法，包括以下步骤：a)设计合成引物；所述引物由上游内部引物FIP、下游内部引物BIP、上游外部引物F3和下游外部引物B3组成，所述引物的碱基序列如SEQ ID No：1～4；b)制备牛属北美野牛、奶牛、牦牛、水牛的DNA稀释液；c)配制LAMP反应体系并设定反应条件；d)进行LAMP方法特异性检测；e)进行LAMP方法灵敏度检测。本发明建立的方法具有快速、高效、灵敏、准确等优点，在动物源性成分食品监管和检验检疫工作中有实际应用价值，尤其适用于基层实验室和现场检测的推广和应用。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及动物源性成分特异性的检测方法，具体涉及LAMP方法检测牛源性成分的引物和方法。
背景技术
由于价格、宗教、健康等原因，许多国家要求肉类及其制品类的食品标签必须真实明确地标出肉类来源，禁止掺假行为，以保护消费者的利益，但是市场上混淆肉类品种的现象仍然非常普遍，主要是在高价肉类中掺杂低价肉类，如牛肉、羊肉中掺杂猪肉、鸭肉等。2013年，在瑞典、英国和法国部分牛肉制品中发现了马肉，德国也宣布发现疑似此类情况，引发了消费者强烈反感，欧盟要求所有成员国对加工牛肉制品开展DNA抽检，以消除对“马肉风波”的忧虑。因此建立快速、准确的食品动物源成分安全检测技术，能够为消费者利益和生命安全提供技术保障。
动物源性成分的鉴定方法主要包括蛋白质鉴定(放射免疫法、色谱法等)和分子生物学鉴定(PCR方法等)两大类。应用蛋白质鉴定方法时，当肉类经过切碎、蒸煮、熏烤等加工过程后，肉中蛋白质结构通常被破坏，物种特有的蛋白质或抗原决定部位也遭到破坏。所以，通过蛋白质鉴定方法鉴别肉类品种的可靠性较差。相比之下，检测DNA的鉴定方法更可靠，因为DNA在所有组织细胞中都一样，不用考虑DNA是从肌肉、脂肪还是其他组织中提取的。由于分子生物学鉴定中的PCR法反应时间短，具有较高的灵敏度、特异性和可操作性，目前已成为肉制品种属鉴别最常用的方法，但普通PCR法扩增后需要凝胶电泳进行结果分析，所用染液EB为强致癌物质，因此存在一定的操作安全隐患，并且还存在非特异性扩增导致的假阳性问题。常规的动物源性成分的检测主要采用普通PCR方法和TaqMan实时荧光定量PCR方法。普通PCR方法由于操作繁琐、耗时长、易污染环境等缺点已逐渐被TaqMan实时荧光定量PCR取代。TaqMan实时荧光定量PCR灵敏度高、特异性好，但需昂贵的荧光PCR仪和配套的试剂，不能普遍适用于检验检疫一线的基层实验室和现场检测。
环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是由日本学者Notomi研发的基因诊断技术，该方法针对目的基因的6个区段设计引物，提高了检测的特异性，同时该方法的扩增效率较普通PCR高，很大程度地提高了灵敏度。因此可以应用该技术尝试实现多靶标的动物源性成分的现场快速检测，而不需要依赖额外复杂的实验设备及其他条件，有很大的实际应用前景。
LAMP技术以其特异性强、灵敏度高、快速、准确和操作简便等优点，现已应用于致病微生物、病毒、寄生虫的鉴定，转基因和动物源成分检测等多方面。目前对于这一技术的运用有对于微生物病原体的检验上，如大肠杆菌、沙门氏菌、分支杆菌、口蹄疫病毒等。Denschlag等人用该技术检测了致突镰刀菌的Hyd5，Qingchao Li等验证了应用LAMP技术转基因水稻中的cry1Ab基因优于qPCR方法，刘少宁等建立了一种能够快速区分出绵羊肉中掺入狐狸源性成分的环介导等温扩增方法，徐淑菲等根据羊cytB基因设计特异性引物，动物GenieⅡ等温扩增荧光检测系统，建立了检测羊源性成分的LAMP方法。目前关于动物源性成分LAMP检测技术的应用多数是针对单靶标检测的，且大部分方法是基于线粒体DNA靶序列的，而同一细胞中线粒体的拷贝数不定，该技术的高灵敏度可能会导致无论反应工作与否都得到阳性结果，因此有必要建立基于牛属共有基因组DNA序列的LAMP检测方法。
但是，目前依然尚无关于LAMP方法检测牛源性成分的报道或者专利。因此有必要建立对牛源性成分的LAMP检测技术。
发明内容
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种对牛源性成分的LAMP检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)设计合成引物和荧光探针；所述引物的序列如SEQ ID No：1～4所示；
b)制备北美野牛、奶牛、牦牛、水牛，共4种牛属不同品种的DNA稀释液；
c)配制LAMP反应体系并设定反应条件；
d)进行LAMP方法特异性检测；
e)进行LAMP方法灵敏度检测。
优选地，步骤a)中，所述合成的引物浓度均为10μmol/L。
优选地，步骤b)中，所述DNA稀释液的浓度为20ng/μL。
优选地，步骤c)中，所述LAMP反应体系的配置方法为：将2μL的DNA稀释液加入到23μL反应体系中；所述23μL的反应体系包括以下体积含量的各组分：
LAMP反应条件为：65℃扩增反应1h，1个循环；80℃使酶失活5min、4℃降温5min，1个循环。
优选地，步骤d)中，阳性样品为4种牛，分别是北美野牛、奶牛、牦牛和水牛，阴性样品为18种不同的动物和植物，分别是猪、绵羊、山羊、驴、马、骡子、猫、鼠、鸡、鸭、鹅、水稻、拟南芥、玉米、大豆、小麦、大麦和棉籽，并用ddH2O设置阴性对照。
优选地，步骤e)中，先将牦牛DNA模板稀释成7个浓度梯度(20ng/μL、10ng/μL、2ng/μL、1ng/μL、0.2ng/μL、0.02ng/μL、0.002ng/μL)，再用LAMP方法进行灵敏度测试。
优选地，对步骤d)中的扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，200V，25min。2％琼脂糖凝胶电泳出梯状条带的为牛属不同品种的样品，无条带的为其他样品或空白对照。
优选地，对步骤e)中的扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，200V，25min。出现梯状条带对应的最低拷贝数就是该检测方法的检测下限(limit of detection，LOD)。
本发明的创新特征是：
本发明将LAMP检测技术应用于牛源性成分的检测，针对牛基因组的共有序列，应用特异性引物，在恒温条件下或简易的恒温装置中，仅用一个小时左右即可有效地完成检测任务，结果判定简单。检测时间短、成本低、特异性好是本检测方法的特点，在含动物源性成分食品管理和检验检疫实际工作中有广阔的应用前景，尤其适用于基层一线实验室和现场检测的推广和应用，此外还可作为实时荧光PCR的有效补充。
附图说明
图1是牛源性成分LAMP特异性检测的跑胶结果图。图中，泳道M，DL2000 DNAmarker；泳道1，北美野牛；泳道2，奶牛；泳道3，牦牛；泳道4，水牛；泳道5，猪；泳道6，绵羊；泳道7，山羊；泳道8，驴；泳道9，马；泳道10，骡子；泳道11，猫；泳道12，鼠；泳道13，鸡；泳道14，鸭；泳道15，鹅；泳道16，水稻；泳道17，拟南芥；泳道18，玉米；泳道19，大豆；泳道20，小麦；泳道21，大麦；泳道22，棉籽；泳道23，空白对照。
图2是牛源性成分LAMP的灵敏度跑胶结果。图中，泳道M，DL2000DNA marker；泳道1，20ng/μL；泳道2，10ng/μL；泳道3，2ng/μL；泳道4，1ng/μL；泳道5，0.2ng/μL；泳道6，0.02ng/μL；泳道7，0.002ng/μL；泳道8，空白对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
下列实施例中未注明具体条件或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用仪器或者试剂未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：LAMP方法的特异性检测
1、合成具有以下核苷酸序列的引物，本实施例引物及荧光探针的浓度都为10μM/L。
以上引物的核苷酸序列是基于牛基因组DNA共有序列设计，通过该设计就可以精确检测牛源性成分；
2、提取制备18种不同的动物和植物，即猪、绵羊、山羊、驴、马、骡子、猫、鼠、鸡、鸭、鹅、水稻、拟南芥、玉米、大豆、小麦、大麦和棉籽的DNA。采用常规的DNA提取手段，并将其稀释至20ng/μL。
3、配制反应体系：即将2μL的DNA稀释液加入到23μL反应体系中，所述23μL的反应体系包括以下组分：
反应体系中MgSO4、Thermol Mg2+free Buffer缓冲液和Bst DNA聚合酶均购自美国纽英伦生物技术公司；dNTPs购自上海申能博彩公司。
4、LAMP特异性检测
根据上述LAMP反应体系，将18种不同的动物和植物，即猪、绵羊、山羊、驴、马、骡子、猫、鼠、鸡、鸭、鹅、水稻、拟南芥、玉米、大豆、小麦、大麦和棉籽，在上述LAMP反应的条件下对产物进行扩增。用ddH2O设置阴性对照。
LAMP反应条件：65℃扩增反应1h，1个循环；80℃使酶失活5min、4℃降温5min，1个循环。本实施例中采用的是ABI Veriti 96Well定性PCR扩增仪(美国应用生物系统公司)。
在本实施例中，邀请3位人员参与协同实验验证。每位人员均重复三次实验，每个实验设置三个重复。并要求他们均用ddH2O设置阴性对照。
5、观察实验结果
将扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，200V，25min。2％琼脂糖凝胶电泳出梯状条带的为牛属不同品种的样品，无条带的为其他样品或空白对照。本实例中采用的是DY-501型核酸电泳仪(上海精密科学仪器有限公司)，UVP Biodoc-It220凝胶成像一体机(美国Spring公司)。
从图1可知，只有牛属的泳道出现梯状条带，其他物种以及空白对照均无条带，而三个协同实验的验证结果均与本实验一致，说明建立的LAMP方法具有良好的特异性，可用于牛属不同种特异性检测。
实施例2：LAMP方法的灵敏度检测
1、引物合成、牛的DNA提取见实例1。
2、制备牦牛DNA模板稀释梯度
将模板用ddH2O依次稀释成7个浓度梯度(20ng/μL、10ng/μL、2ng/μL、1ng/μL、0.2ng/μL、0.02ng/μL、0.002ng/μL)。
3、将上述5个浓度梯度进行LAMP扩增，并用ddH2O设置阴性对照。配置LAMP反应条件见实例1。
在本实施例中，邀请3位人员参与协同实验验证。每位人员均重复三次实验，每个实验设置三个重复。并要求他们均用ddH2O设置阴性对照。
4、观察实验结果
将扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，200V，25min。2％琼脂糖凝胶电泳出梯状条带对应的最低拷贝数就是LOD值。
图2显示，除了空白对照没有条带外，其他泳道均出现梯状条带；而协同实验的结果与本实验均一致。说明本实验建立的LAMP方法的灵敏度极高，达到了0.002ng/μL。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。
Claims (7)
1.一种牛源性成分的LAMP检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)设计合成引物；所述引物由上游内部引物FIP、下游内部引物BIP、上游外部引物F3和下游外部引物B3组成，所述引物的碱基序列如SEQ ID No：1～4；
b)制备18种不同的动物和植物，即猪、绵羊、山羊、驴、马、骡子、猫、鼠、鸡、鸭、鹅、水稻、拟南芥、玉米、大豆、小麦、大麦和棉籽的DNA稀释液；
c)配制LAMP反应体系并设定反应条件；
d)进行LAMP方法特异性检测；
e)进行LAMP方法灵敏度检测。
2.根据权利要求1所述的牛源性成分的LAMP检测方法，其特征在于，步骤b)中，所述DNA稀释液的浓度为20ng/μL。
3.根据权利要求1所述的牛源性成分的LAMP检测方法，其特征在于，步骤c)中，所述LAMP反应体系的配置方法为：将2μL的DNA稀释液加入到23μL反应体系中；
所述23μL的反应体系包括以下体积含量的各组分：
LAMP反应条件为：65℃扩增反应1h，1个循环；80℃使酶失活5min、4℃降温5min，1个循环。
4.根据权利要求1所述的牛源性成分LAMP特异性检测方法，其特征在于，步骤d)中，阳性样品为4种不同品种的牛，分别是北美野牛、奶牛、牦牛和水牛，阴性样品为18种不同的动物和植物，分别是猪、绵羊、山羊、驴、马、骡子、猫、鼠、鸡、鸭、鹅、水稻、拟南芥、玉米、大豆、小麦、大麦和棉籽，并用ddH2O设置阴性对照。
5.根据权利要求1所述的牛源性成分LAMP灵敏度检测方法，其特征在于，步骤e)中，先将牦牛DNA模板稀释成7个浓度梯度(20ng/μL、10ng/μL、2ng/μL、1ng/μL、0.2ng/μL、0.02ng/μL、0.002ng/μL)，再用LAMP方法进行灵敏度测试。
6.根据权利要求1所述的牛源性成分LAMP特异性检测方法，其特征在于，对步骤d)中的扩增产物首先进行2％琼脂糖凝胶电泳，200V，25min。2％琼脂糖凝胶电泳出梯状条带的为牛属的样品，无条带的为其他样品或空白对照。
7.根据权利要求1所述的牛源性成分LAMP灵敏度检测方法，其特征在于，对步骤e)中的扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，200V，25min。出现梯状条带对应的最低拷贝数就是该检测方法的检测下限(limit of detection，LOD)。
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| CN110055340A (zh) * | 2019-04-11 | 2019-07-26 | 中国农业大学 | 一种食品中牛源成分快速检测方法及试剂盒 |
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2021
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