CN113215281A - 同时检测肉及肉制品中五种动物源成分的pcr检测引物、试剂盒和方法 - Google Patents

同时检测肉及肉制品中五种动物源成分的pcr检测引物、试剂盒和方法 Download PDF

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CN113215281A CN202110654144.9A CN202110654144A CN113215281A CN 113215281 A CN113215281 A CN 113215281A CN 202110654144 A CN202110654144 A CN 202110654144A CN 113215281 A CN113215281 A CN 113215281A
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Abstract

本发明提供了同时检测肉及肉制品中五种动物源成分的PCR检测引物、试剂盒和利用上述试剂盒来鉴别肉及肉制品中猪牛羊鸡鸭源成分的方法。本发明根据羊鸭牛猪鸡物种特有序列设计引物扩增特异性序列片段，与传统方法比较，速度快成本低，结果简单明了，可靠性更高，特异性强；同时确认了该方法的检出限：猪0.0005ng/μL；牛、羊≤0.005ng/μL；鸭、鸡≤0.05ng/μL，检出限低，灵敏度高，为各食品检验机构提供了方法指导和技术支持，对于食品中畜源性成分的检测具有重要意义。

Description

同时检测肉及肉制品中五种动物源成分的PCR检测引物、试剂 盒和方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及同时快速检测肉及肉其制品中不同物种来源成分的PCR检测引物、试剂盒和方法，具体涉及一种同时快速检测肉及肉制品中是否具有猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉五种成分的检测方法及PCR检测引物、试剂盒。
背景技术
肉制品是人体蛋白质和微量元素的重要来源。我国是肉制品的生产和消费大国，肉制品在居民食品消费中占有很大比例。目前全球的肉制品的品质及安全状况令人担忧，如涮羊肉、羊肉锅仔、羊肉串、牛肉干等都深受消费者的喜爱，而出于不同因素导致猪肉价格显著上涨的情况也时有发生，因此常有不法商贩利用检测手段的不足将廉价的例如鸡鸭源成分掺入或者完全替代羊肉、牛肉及猪肉销售，从中获取暴利。这不仅损害了消费者的利益，而且存在食品营养价值和安全等问题。
目前，国内外报道的肉类鉴别的主要方法包括传统感官鉴别、免疫学方法、核酸检测方法，以及近年发展的如生物芯片、近红外光谱分析技术和质谱分析技术等。免疫学方法利用抗体对蛋白的识别来区别肉类品种，与传统鉴别技术相比，虽然较灵敏可靠，但缺陷也明显，如重复性差，各种肉类特异性抗体成本高且难以制备，易出现假阳性结果，特别是加工过程中蛋白易受到破坏和分解，导致检查结果易出现假空白等。近年发展的生物芯片、近红外光谱分析技术和质谱分析等技术存在一些暂时无法有效解决或客观存在的缺点，如成本高、需频繁维护和改进模型等原因，该类检测技术短期内仍无法有效推广应用。因此，建立快速、准确、灵敏的低成本PCR肉源检测技术是严格监测市场上肉制品安全的基础和关键之一。
现有技术中，PCR肉源检测已有相关报道，但现有的检测引物的对某些肉源的检出限还比较高，特别是鸡鸭成分，因为这两类廉价肉源常被掺入比较昂贵的肉成分中，如果检出限较高，当肉源成分含量很低时就会产生假阴性结果，因此需要进一步的优化，尤其是针对廉价肉源成分的检出限，应当尽量降低。另外，现有引物多针对不同基因来源片段，包括常规功能基因，由于包含内含子等易变异片段，同物种不同亚种之间差异较大，极大影响了检测结果的可靠性。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供了同时检测肉及肉制品中五种动物源成分的PCR检测引物、试剂盒和方法，特别是一种用于快速检测牛肉、羊肉、猪肉等及其制品中是否由相应成分组成或掺杂鸡鸭源性成分的PCR快速检测方法，本发明提供的PCR引物可以显著降低检出限，猪的检出限可达到0.0005ng/μL；牛、羊检出限≤0.005ng/μL；鸭、鸡检出限可达到0.05ng/μL，提高了检测质量水平。
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可用于多个物种来源如牛、羊、猪、鸭、鸡的肉及肉制品中检测来源成分的PCR鉴定方法，适用于上述动物肉制品掺假的快速检测及鉴定。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：
同时检测肉及肉制品中五种动物源成分的PCR检测引物，所述五种动物源成分为猪、牛、羊、鸡、鸭源成分，所述引物为五组特异性引物，其序列如下：
羊源特异性引物：
上游引物F:CAAAATTATTCGCCAGAGTACTACCG
下游引物R:CTCCATAGGTTACACCTTGACCTAACGTC
鸭源特异性引物：
上游引物F:GATCAAAATGCAACTAAGCTGTCGC
下游引物R:GGCAAGGGGCGGTTGGGTTG
牛源特异性引物：
上游引物F:CCCTCTAGGTTGTTAAAACTAAGAGGAGCT
下游引物R:GTTTGGGTCTTAGCTATAGTGCGTCG
猪源特异性引物：
上游引物F:ACGGTAGCTCATAACGCCTTGCTC
下游引物R:TGAATTGGCAAGGGTTGGTAAGGTC
鸡源特异性引物：
上游引物F:CAAAAGGAGCAGGTATCAGGCACACT
下游引物R:CCTTGACCTGTCTTATTAGCGAGGG。
本发明还提供同时检测肉及肉制品中五种动物源成分的PCR检测试剂盒，所述试剂盒中的特异性引物的序列如下：
羊源特异性引物：
上游引物F:CAAAATTATTCGCCAGAGTACTACCG
下游引物R:CTCCATAGGTTACACCTTGACCTAACGTC
鸭源特异性引物：
上游引物F:GATCAAAATGCAACTAAGCTGTCGC
下游引物R:GGCAAGGGGCGGTTGGGTTG
牛源特异性引物：
上游引物F:CCCTCTAGGTTGTTAAAACTAAGAGGAGCT
下游引物R:GTTTGGGTCTTAGCTATAGTGCGTCG
猪源特异性引物：
上游引物F:ACGGTAGCTCATAACGCCTTGCTC
下游引物R:TGAATTGGCAAGGGTTGGTAAGGTC
鸡源特异性引物：
上游引物F:CAAAAGGAGCAGGTATCAGGCACACT
下游引物R:CCTTGACCTGTCTTATTAGCGAGGG。
进一步，所述检测试剂盒的组成如下：
10μL体系：由5.0μL的2×Taq Plus Master Mix、上下游引物的终浓度各为1μM、1.0μg待测模板DNA，以ddH2O补足体系。
2×Taq Plus Master Mix是市售的PCR聚合酶预混液，可直接购买得到。
本发明还提供一种利用上述试剂盒来鉴别肉及肉制品中猪牛羊鸡鸭源成分的方法，所述方法为：
提取待测肉及其制品样品的DNA作为PCR模板，利用同时检测肉及肉制品中五种动物源成分的PCR检测试剂盒中的五组特异性引物作为扩增引物，进行多重PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现231bp的特异DNA条带，则检出羊源性成分，反之则否；若电泳结果出现290bp的特异DNA条带，则检出鸭源性成分，反之则否；若电泳结果出现341bp的特异DNA条带，则检出牛源性成分，反之则否；若电泳结果出现481bp的特异DNA条带，则检出猪源性成分，反之则否；若电泳结果出现610bp的特异DNA条带，则检出鸡源性成分，反之则否。
所述多重PCR扩增的反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环。
进一步，鉴别肉及肉制品中猪牛羊鸡鸭源成分的方法包括如下步骤：
(1)提取待测肉及其制品样品的DNA作为PCR模板；
(2)利用同时检测肉及肉制品中五种动物源成分的PCR检测试剂盒中的五组特异性引物作为扩增引物，进行多重PCR扩增，PCR扩增的反应体系如下：
由5.0μL的2×Taq Plus Master Mix、上下游引物各为10μM、1.0μg待测模板DNA，以ddH2O补足10μL体系；
所述多重PCR扩增的反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；
(3)PCR扩增产物进行电泳检测：
取待检测的PCR产物1-2μL，用2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，若电泳结果出现231bp的特异DNA条带，则检出羊源性成分，反之则否；若电泳结果出现290bp的特异DNA条带，则检出鸭源性成分，反之则否；若电泳结果出现341bp的特异DNA条带，则检出牛源性成分，反之则否；若电泳结果出现481bp的特异DNA条带，则检出猪源性成分，反之则否；若电泳结果出现610bp的特异DNA条带，则检出鸡源性成分，反之则否。
本发明中，扩增的羊DNA序列为231bp，序列如下，如SEQ ID NO：11所示：Ovisaries，GenBank NO：MN882069.1(位置：539-769bp)
Figure BDA0003111927880000061
扩增的鸭DNA序列为290bp，序列如下，如SEQ ID NO：12所示：
Anas platyrhynchos，GenBank NO：MK770342.1(位置：1462-1751bp)
Figure BDA0003111927880000062
扩增的牛DNA序列为341bp，序列如下，如SEQ ID NO：13所示：
Bos taurus，GenBank NO：MN714218.1(位置：507-847bp)
Figure BDA0003111927880000063
扩增的猪DNA序列为481bp，序列如下，如SEQ ID NO：14所示：
Sus scrofa，GenBank NO：MH603005.1(位置：1480-1960bp)
Figure BDA0003111927880000064
Figure BDA0003111927880000071
扩增的鸡DNA序列为610bp，序列如下，如SEQ ID NO：15所示：
Gallus gallus，GenBank NO：MK163565.1(位置：1400-2009bp)
Figure BDA0003111927880000072
进一步，所述步骤(1)中，所述提取待测肉及其制品样品的DNA可按以下步骤进行：
取10-50mg肉或肉制品于2mL离心管中，用剪刀剪碎，加入630μL的STE和70μL的10％SDS，充分混匀，再加入15-20μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分颠倒混匀，于55℃水浴中消化至澄清；在离心管中加入700μLTris饱和酚，颠倒混匀，4℃，12,000rpm离心15min；混合液分三层，小心吸取上层澄清液于另一离心管中，加入500μL氯仿，摇晃混匀，4℃，12,000rpm离心10min，混合液分二层，重复本操作一次；小心吸取上层澄清液于另一离心管中，加入1mL纯酒精，颠倒混匀数次，常温沉降10min；4℃，12,000rpm离心10min，弃上清，加入1mL75％的酒精，悬浮沉淀，4℃，12,000rpm离心5min，弃上清，常温晒干或置于烘箱中，10分钟，管底沉淀即基因组DNA，加100μLTE缓冲液溶解；
所述的TE缓冲液(pH 8.0)：2mL 1M Tris-HCl(pH 8.0)，0.2mL 0.5M EDTA(pH8.0)，以高纯水定容至1000mL，高温高压灭菌，常温保存。
所述的10％SDS：称10g SDS溶于高纯水中，68℃溶解，定容至100mL，0.22μm滤膜过滤除菌，常温保存。
所述的STE：5mL 1M Tris-HCl(pH 8.0)，20mL 0.5M EDTA(pH 8.0)，20mL 0.5MNaCl溶液，10mL 10％SDS，并以高纯水定容至100mL。
55℃水浴消化时，不同物种以及生熟肉之间消化时间不同，可根据不同情况适当调整，最终消化至澄清即可。
进一步，所述步骤(3)中，PCR扩增产物进行电泳检测可按以下步骤进行：
将待检测的PCR产物1-2μL和上样染料Loading Buffer以5:1比例混合，均匀点样在2％琼脂糖凝胶上；将电泳槽电压设定为110V，跑胶时间设为30～40min(可根据条带位置适当调整)；电泳完成后将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪上进行成像分析。
所述的TAE缓冲液配制：将242g Tris与37.2g Na2EDTA·2H2O加入800mL ddH2O中，充分搅拌溶解，加入57.1mL的醋酸，充分混匀，加去离子水定容至1L，得50×TAE，室温保存，用时按比1:50例以ddH2O稀释。
本发明以线粒体基因12S rRNA作为靶基因，分别选取5个物种保守性好、特异性高的序列片段，设计物种特异性引物对，通过PCR实现快速扩增，结果可通过电泳进行辨认。本发明的引物对可利用本领域技术人员公知的化学合成方法进行DNA合成技术来获得。
本发明的有益效果在于：本发明进行了反应的特异性验证，证明了引物设计的种间特异性和种内保守性，可靠性高，特异性强，确保该反应能特异性检测出肉及肉制品中的牛羊猪鸭鸡源成分，至少在这5种肉及肉制品中不会出现假阳性；灵敏度检验确认了该方法可以检测出0.05ng以下的DNA含量；显著降低了检出限，猪的检出限可达到0.0005ng/μL；牛、羊检出限≤0.005ng/μL；鸭、鸡检出限可达到0.05ng/μL，提高了检测质量水平；为各食品检验机构提供了方法指导和技术支持，对于食品中畜源性成分的检测具有重要意义。
本发明生熟肉均可检测，在2.5h内就可以完成检测，且与以往方法相比反应体系小，试剂用量少，具有快速省时且成本低的优点。本发明选用线粒体基因12S rRNA作为靶基因，12S基因无内含子，且保守性极高，不同亚种之间鲜有差异，因此，全部基于12S基因设计的鉴别引物可靠性也更高。
附图说明
图1为引物特异性检验，各肉样基因组和各引物排列组合PCR扩增结果，泳道说明如下：羊引物为a组6个泳道，其中am为阴性对照，a1为羊基因模板，a2为鸭基因模板，a3为牛基因模板，a4为猪基因模板，a5为鸡基因模板；鸭引物为b组6个泳道，其中bm为阴性对照，b1为羊基因模板，b2为鸭基因模板，b3为牛基因模板，b4为猪基因模板，b5为鸡基因模板；牛引物为c组6个泳道，其中cm为阴性对照，c1为羊基因模板，c2为鸭基因模板，c3为牛基因模板，c4为猪基因模板，c5为鸡基因模板；猪引物为d组6个泳道，其中dm为阴性对照，d1为羊基因模板，d2为鸭基因模板，d3为牛基因模板，d4为猪基因模板，d5为鸡基因模板；鸡引物为e组6个泳道，其中em为阴性对照，e1为羊基因模板，e2为鸭基因模板，e3为牛基因模板，e4为猪基因模板，e5为鸡基因模板。
注：M，marker 2000。
图2为使用本方法扩增混合肉样基因组样品的凝胶电泳图，其中：泳道1，羊引物；泳道2，鸭引物；泳道3，牛引物；泳道4，猪引物；泳道5，鸡引物；M，Marker 2000。
图3为灵敏度检测结果图，混合模板DNA中所含每个物种DNA浓度(ng/μL)为：泳道M：Marker2000；泳道1：1.0；泳道2：0.5；泳道3：0.05；泳道4：0.005；泳道5：0.0005；泳道6：0％(阴性对照，不加基因组，加TE)；泳道7：(阴性对照，只加酶、ddH2O、引物，不加基因组与TE)
具体实施方式：
以下通过具体实验例来对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。
实施例1
(1)样品DNA提取
分别取羊、鸭、牛、猪、鸡30mg肉样于2mL离心管中，用剪刀剪碎，加入630μL的STE和70μL的10％SDS，充分混匀，再加入15-20μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分颠倒混匀，于55℃水浴中消化至澄清(不同物种以及生熟肉之间消化时间不同，可根据不同情况适当调整)；在离心管中加入700μL Tris饱和酚，颠倒混匀，4℃，12,000rpm离心15min；混合液分三层，小心吸取上层澄清液于另一离心管中，加入500μL氯仿，摇晃混匀，4℃，12,000rpm离心10min，混合液分二层，重复本操作一次；小心吸取上层澄清液于另一离心管中，加入1mL纯酒精，颠倒混匀数次，常温沉降10min；4℃，12,000rpm离心10min，弃上清，加入1mL75％的酒精，悬浮沉淀，4℃，12,000rpm离心5min，弃上清，常温晒干或置于烘箱中，10分钟，管底沉淀即基因组DNA，加100μL TE缓冲液溶解；以TE做空白对照，用微量核酸、蛋白浓度测定仪测定所提取DNA的浓度及纯度。
(2)PCR扩增
将PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行PCR扩增，得到扩增产物。
所述的PCR扩增反应体系为10μL体系：由5.0μL的2×Taq Plus Master Mix、上下游羊引物终浓度各为1μM、1.0μg模板DNA，以ddH2O补足体系。
PCR扩增反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环。
(3)扩增产物电泳检测
称取适量琼脂糖，加到盛有1×TAE的三角瓶中，使其终浓度达到2％，用微波炉将其完全溶解；待凝胶溶液冷却至50～60℃时，加入核酸染色液EB至终浓度为0.5μg/mL，缓慢同方向转动三角瓶使其混合均匀，待不烫手时将其轻轻倒入已插好梳子的制胶槽中，室温下放置；待胶凝固后，小心将梳子垂直拔出；将制好的凝胶放入水平电泳槽中(已加入1×TAE电泳缓冲液)，注意查看点样孔背面是否完整，避免发生漏样；将待检测的PCR产物1-2μL和上样染料Loading Buffer以5:1比例混合均匀点样；将电泳槽电压设定为110V，跑胶时间设为30min(可根据条带位置适当调整)；电泳完成后将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪上进行成像分析。如图1所示，泳道a1即羊肉样品PCR结果，条带单一明亮，而其余(am，a2-a5)肉样样品无条带即不能扩增其他物种的基因组，说明羊引物特异性好，在所选肉样中不会出现假阳性。
实施例2
(1)样品DNA提取
分别取羊、鸭、牛、猪、鸡30mg肉样于2mL离心管中，用剪刀剪碎，加入630μL的STE和70μL的10％SDS，充分混匀，再加入15-20μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分颠倒混匀，于55℃水浴中消化至澄清(不同物种以及生熟肉之间消化时间不同，可根据不同情况适当调整)；在离心管中加入700μL Tris饱和酚，颠倒混匀，4℃，12,000rpm离心15min；混合液分三层，小心吸取上层澄清液于另一离心管中，加入500μL氯仿，摇晃混匀，4℃，12,000rpm离心10min，混合液分二层，重复本操作一次；小心吸取上层澄清液于另一离心管中，加入1mL纯酒精，颠倒混匀数次，常温沉降10min；4℃，12,000rpm离心10min，弃上清，加入1mL75％的酒精，悬浮沉淀，4℃，12,000rpm离心5min，弃上清，常温晒干或置于烘箱中，10分钟，管底沉淀即基因组DNA，加100μL TE缓冲液溶解；以TE做空白对照，用微量核酸、蛋白浓度测定仪测定所提取DNA的浓度及纯度。
(2)PCR扩增
将PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行PCR扩增，得到扩增产物。
所述的PCR扩增反应体系为10μL体系：由5.0μL的2×Taq Plus Master Mix、上下游鸭引物终浓度各为1μM、1.0μg模板DNA，以ddH2O补足体系。
PCR扩增反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环。
(3)扩增产物电泳检测
称取适量琼脂糖，加到盛有1×TAE的三角瓶中，使其终浓度达到2％，用微波炉将其完全溶解；待凝胶溶液冷却至50～60℃时，加入核酸染色液EB至终浓度为0.5μg/mL，缓慢同方向转动三角瓶使其混合均匀，待不烫手时将其轻轻倒入已插好梳子的制胶槽中，室温下放置；待胶凝固后，小心将梳子垂直拔出；将制好的凝胶放入水平电泳槽中(已加入1×TAE电泳缓冲液)，注意查看点样孔背面是否完整，避免发生漏样；将待检测的PCR产物1-2μL和上样染料Loading Buffer以5:1比例混合均匀点样；将电泳槽电压设定为110V，跑胶时间设为30min(可根据条带位置适当调整)；电泳完成后将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪上进行成像分析。如图1所示，泳道b2即鸭肉样品PCR结果，条带单一明亮，而其余(bm，b1，b3-b5)肉样样品无条带即不能扩增其他物种的基因组，说明鸭引物特异性好，在所选肉样中不会出现假阳性。
实施例3
(1)样品DNA提取
分别取羊、鸭、牛、猪、鸡30mg肉样于2mL离心管中，用剪刀剪碎，加入630μL的STE和70μL的10％SDS，充分混匀，再加入15-20μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分颠倒混匀，于55℃水浴中消化至澄清(不同物种以及生熟肉之间消化时间不同，可根据不同情况适当调整)；在离心管中加入700μL Tris饱和酚，颠倒混匀，4℃，12,000rpm离心15min；混合液分三层，小心吸取上层澄清液于另一离心管中，加入500μL氯仿，摇晃混匀，4℃，12,000rpm离心10min，混合液分二层，重复本操作一次；小心吸取上层澄清液于另一离心管中，加入1mL纯酒精，颠倒混匀数次，常温沉降10min；4℃，12,000rpm离心10min，弃上清，加入1mL75％的酒精，悬浮沉淀，4℃，12,000rpm离心5min，弃上清，常温晒干或置于烘箱中，10分钟，管底沉淀即基因组DNA，加100μL TE缓冲液溶解；以TE做空白对照，用微量核酸、蛋白浓度测定仪测定所提取DNA的浓度及纯度。
(2)PCR扩增
将PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行PCR扩增，得到扩增产物。
所述的PCR扩增反应体系为10μL体系：由5.0μL的2×Taq Plus Master Mix、上下游牛引物终浓度各为1μM、1.0μg模板DNA，以ddH2O补足体系。
PCR扩增反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环。
(3)扩增产物电泳检测
称取适量琼脂糖，加到盛有1×TAE的三角瓶中，使其终浓度达到2％，用微波炉将其完全溶解；待凝胶溶液冷却至50～60℃时，加入核酸染色液EB至终浓度为0.5μg/mL，缓慢同方向转动三角瓶使其混合均匀，待不烫手时将其轻轻倒入已插好梳子的制胶槽中，室温下放置；待胶凝固后，小心将梳子垂直拔出；将制好的凝胶放入水平电泳槽中(已加入1×TAE电泳缓冲液)，注意查看点样孔背面是否完整，避免发生漏样；将待检测的PCR产物1-2μL和上样染料Loading Buffer以5:1比例混合均匀点样；将电泳槽电压设定为110V，跑胶时间设为30min(可根据条带位置适当调整)；电泳完成后将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪上进行成像分析。如图1所示，泳道c3即牛肉样品PCR结果，条带单一明亮，而其余(cm，c1，c2，c4，c5)肉样样品无条带即不能扩增其他物种的基因组，说明牛引物特异性好，在所选肉样中不会出现假阳性。
实施例4
(1)样品DNA提取
分别取羊、鸭、牛、猪、鸡30mg肉样于2mL离心管中，用剪刀剪碎，加入630μL的STE和70μL的10％SDS，充分混匀，再加入15-20μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分颠倒混匀，于55℃水浴中消化至澄清(不同物种以及生熟肉之间消化时间不同，可根据不同情况适当调整)；在离心管中加入700μL Tris饱和酚，颠倒混匀，4℃，12,000rpm离心15min；混合液分三层，小心吸取上层澄清液于另一离心管中，加入500μL氯仿，摇晃混匀，4℃，12,000rpm离心10min，混合液分二层，重复本操作一次；小心吸取上层澄清液于另一离心管中，加入1mL纯酒精，颠倒混匀数次，常温沉降10min；4℃，12,000rpm离心10min，弃上清，加入1mL75％的酒精，悬浮沉淀，4℃，12,000rpm离心5min，弃上清，常温晒干或置于烘箱中，10分钟，管底沉淀即基因组DNA，加100μL TE缓冲液溶解；以TE做空白对照，用微量核酸、蛋白浓度测定仪测定所提取DNA的浓度及纯度。
(2)PCR扩增
将PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行PCR扩增，得到扩增产物。
所述的PCR扩增反应体系为10μL体系：由5.0μL的2×Taq Plus Master Mix、上下游猪引物终浓度各为1μM、1.0μg模板DNA，以ddH2O补足体系。
PCR扩增反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环。
(3)扩增产物电泳检测
称取适量琼脂糖，加到盛有1×TAE的三角瓶中，使其终浓度达到2％，用微波炉将其完全溶解；待凝胶溶液冷却至50～60℃时，加入核酸染色液EB至终浓度为0.5μg/mL，缓慢同方向转动三角瓶使其混合均匀，待不烫手时将其轻轻倒入已插好梳子的制胶槽中，室温下放置；待胶凝固后，小心将梳子垂直拔出；将制好的凝胶放入水平电泳槽中(已加入1×TAE电泳缓冲液)，注意查看点样孔背面是否完整，避免发生漏样；将待检测的PCR产物1-2μL和上样染料Loading Buffer以5:1比例混合均匀点样；将电泳槽电压设定为110V，跑胶时间设为30min(可根据条带位置适当调整)；电泳完成后将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪上进行成像分析。如图1所示，泳道d4即猪肉样品PCR结果，条带单一明亮，而其余(dm，d1-d3，d5)肉样样品无条带即不能扩增其他物种的基因组，说明猪引物特异性好，在所选肉样中不会出现假阳性。
实施例5
(1)样品DNA提取
分别取羊、鸭、牛、猪、鸡30mg肉样于2mL离心管中，用剪刀剪碎，加入630μL的STE和70μL的10％SDS，充分混匀，再加入15-20μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分颠倒混匀，于55℃水浴中消化至澄清(不同物种以及生熟肉之间消化时间不同，可根据不同情况适当调整)；在离心管中加入700μL Tris饱和酚，颠倒混匀，4℃，12,000rpm离心15min；混合液分三层，小心吸取上层澄清液于另一离心管中，加入500μL氯仿，摇晃混匀，4℃，12,000rpm离心10min，混合液分二层，重复本操作一次；小心吸取上层澄清液于另一离心管中，加入1mL纯酒精，颠倒混匀数次，常温沉降10min；4℃，12,000rpm离心10min，弃上清，加入1mL75％的酒精，悬浮沉淀，4℃，12,000rpm离心5min，弃上清，常温晒干或置于烘箱中，10分钟，管底沉淀即基因组DNA，加100μL TE缓冲液溶解；以TE做空白对照，用微量核酸、蛋白浓度测定仪测定所提取DNA的浓度及纯度。
(2)PCR扩增
将PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行PCR扩增，得到扩增产物。
所述的PCR扩增反应体系为10μL体系：由5.0μL的2×Taq Plus Master Mix、上下游鸡引物终浓度各为1μM、1.0μg模板DNA，以ddH2O补足体系。
PCR扩增反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环。
(3)扩增产物电泳检测
称取适量琼脂糖，加到盛有1×TAE的三角瓶中，使其终浓度达到2％，用微波炉将其完全溶解；待凝胶溶液冷却至50～60℃时，加入核酸染色液EB至终浓度为0.5μg/mL，缓慢同方向转动三角瓶使其混合均匀，待不烫手时将其轻轻倒入已插好梳子的制胶槽中，室温下放置；待胶凝固后，小心将梳子垂直拔出；将制好的凝胶放入水平电泳槽中(已加入1×TAE电泳缓冲液)，注意查看点样孔背面是否完整，避免发生漏样；将待检测的PCR产物1-2μL和上样染料Loading Buffer以5:1比例混合均匀点样；将电泳槽电压设定为110V，跑胶时间设为30min(可根据条带位置适当调整)；电泳完成后将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪上进行成像分析。如图1所示，泳道e5即鸡肉样品PCR结果，条带单一明亮，而其余(em，e1-e4)肉样样品无条带即不能扩增其他物种的基因组，说明鸡引物特异性好，在所选肉样中不会出现假阳性。
实施例6
(1)样品DNA提取
将羊、鸭、牛、猪、鸡肉按照等比例搅碎混匀混合，取50mg于2mL离心管中，用剪刀剪碎，加入630μL的STE和70μL的10％SDS，充分混匀，再加入15-20μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分颠倒混匀，于55℃水浴中消化至澄清(不同物种以及生熟肉之间消化时间不同，可根据不同情况适当调整)；在离心管中加入700μLTris饱和酚，颠倒混匀，4℃，12,000rpm离心15min；混合液分三层，小心吸取上层澄清液于另一离心管中，加入500μL氯仿，摇晃混匀，4℃，12,000rpm离心10min，混合液分二层，重复本操作一次；小心吸取上层澄清液于另一离心管中，加入1mL纯酒精，颠倒混匀数次，常温沉降10min；4℃，12,000rpm离心10min，弃上清，加入1mL75％的酒精，悬浮沉淀，4℃，12,000rpm离心5min，弃上清，常温晒干或置于烘箱中，10分钟，管底沉淀即基因组DNA，加100μL TE缓冲液溶解；以TE做空白对照，用微量核酸、蛋白浓度测定仪测定所提取DNA的浓度及纯度。
(2)PCR扩增
将PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行PCR扩增，得到扩增产物。
所述的PCR扩增反应体系为10μL体系：由5.0μL的2×Taq Plus Master Mix、上下游引物终浓度各为1μM、1.0μg混合模板DNA，以ddH2O补足体系。
五种引物对分别单独对混合肉样品模板DNA进行PCR扩增。
PCR扩增反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环。
(3)扩增产物电泳检测
称取适量琼脂糖，加到盛有1×TAE的三角瓶中，使其终浓度达到2％，用微波炉将其完全溶解；待凝胶溶液冷却至50～60℃时，加入核酸染色液EB至终浓度为0.5μg/mL，缓慢同方向转动三角瓶使其混合均匀，待不烫手时将其轻轻倒入已插好梳子的制胶槽中，室温下放置；待胶凝固后，小心将梳子垂直拔出；将制好的凝胶放入水平电泳槽中(已加入1×TAE电泳缓冲液)，注意查看点样孔背面是否完整，避免发生漏样；将待检测的PCR产物1-2μL和上样染料Loading Buffer以5:1比例混合均匀点样；将电泳槽电压设定为110V，跑胶时间设为30min(可根据条带位置适当调整)；电泳完成后将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪上进行成像分析。如图2所示，各引物均只能扩增出对应基因组的PCR产物，大小符合要求，无其它条带，说明该方法可在混合样品中检测出相应成分成分，且不会受其它物种来源的干扰，特异性好。
实施例7灵敏度实验
分别取羊、鸭、牛、猪、鸡30mg肉样于2mL离心管中，用剪刀剪碎，加入630μL的STE和70μL的10％SDS，充分混匀，再加入15-20μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分颠倒混匀，于55℃水浴中消化至澄清(不同物种以及生熟肉之间消化时间不同，可根据不同情况适当调整)；在离心管中加入700μL Tris饱和酚，颠倒混匀，4℃，12,000rpm离心15min；混合液分三层，小心吸取上层澄清液于另一离心管中，加入500μL氯仿，摇晃混匀，4℃，12,000rpm离心10min，混合液分二层，重复本操作一次；小心吸取上层澄清液于另一离心管中，加入1mL纯酒精，颠倒混匀数次，常温沉降10min；4℃，12,000rpm离心10min，弃上清，加入1mL75％的酒精，悬浮沉淀，4℃，12,000rpm离心5min，弃上清，常温晒干或置于烘箱中，10分钟，管底沉淀即基因组DNA，加100μL TE缓冲液溶解；以TE做空白对照，用微量核酸、蛋白浓度测定仪测定所提取DNA的浓度及纯度。
将5个物种基因组浓度都用TE稀释至5ng/μL，并等体积混合，得到的单个物种的基因组浓度为1ng/μL，再用TE将混合的基因组分别稀释至0.5ng/μL，0.05ng/μL，0.005ng/μL，0.0005ng/μL，阴性对照为TE缓冲液。
(2)PCR扩增
将PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行PCR扩增，得到扩增产物。
所述的PCR扩增反应体系为10μL体系：由5.0μL的2×Taq Plus Master Mix、每对引物上下游终浓度均为10μM、1.0μL模板DNA，以ddH2O补足体系。
所述的多重PCR扩增反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环。
(3)扩增产物电泳检测
称取适量琼脂糖，加到盛有1×TAE的三角瓶中，使其终浓度达到2％，用微波炉将其完全溶解；待凝胶溶液冷却至50～60℃时，加入核酸染色液EB至终浓度为0.5μg/mL，缓慢同方向转动三角瓶使其混合均匀，待不烫手时将其轻轻倒入已插好梳子的制胶槽中，室温下放置；待胶凝固后，小心将梳子垂直拔出；将制好的凝胶放入水平电泳槽中(已加入1×TAE电泳缓冲液)，注意查看点样孔背面是否完整，避免发生漏样；将待检测的PCR产物1-2μL和上样染料Loading Buffer以5:1比例混合均匀点样；将电泳槽电压设定为110V，跑胶时间设为30min(可根据条带位置适当调整)；电泳完成后将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪上进行成像分析。
灵敏度实验结果如图3所示，图3中，混合模板DNA中所含每个物种DNA浓度(ng/μL)为：泳道M：Marker 2000；泳道1：1.0；泳道2：0.5；泳道3：0.05；泳道4：0.005；泳道5：0.0005；泳道6：0％(阴性对照，不加基因组，加TE)；泳道7：(阴性对照，只加酶、ddH2O、引物，不加基因组与TE)
图3结果中，泳道5可看出猪的481bp条带，表明猪的检出限最低，可达0.0005ng/μL；泳道4可看见羊(231bp)、牛(341bp)、猪(481bp)条带，因此牛、羊的检出限≤0.005ng/μL；泳道3上所有条带都清晰可见，因此鸭、鸡的检出限≤0.05ng/μL。以上检出限都显著高于文献报道。
序列表
<110> 宁波大学
<120> 同时检测肉及肉制品中五种动物源成分的PCR检测引物、试剂盒和方法
<141> 2021-06-11
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
caaaattatt cgccagagta ctaccg 26
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
ctccataggt tacaccttga cctaacgtc 29
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
gatcaaaatg caactaagct gtcgc 25
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
ggcaaggggc ggttgggttg 20
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 5
ccctctaggt tgttaaaact aagaggagct 30
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 6
gtttgggtct tagctatagt gcgtcg 26
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 7
acggtagctc ataacgcctt gctc 24
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 8
tgaattggca agggttggta aggtc 25
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 9
caaaaggagc aggtatcagg cacact 26
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 10
ccttgacctg tcttattagc gaggg 25
<210> 11
<211> 231
<212> DNA
<213> Ovis aries
<400> 11
caaaattatt cgccagagta ctaccggcaa cagcccgaaa ctcaaaggac ttggcggtgc 60
tttataccct tctagaggag cctgttctat aatcgataaa ccccgataaa cctcaccaat 120
ccttgctaat acagtctata taccgccatc ttcagcaaac cctaaaaaag ggacaaaagt 180
aagctcaata ataacacata aagacgttag gtcaaggtgt aacctatgga g 231
<210> 12
<211> 290
<212> DNA
<213> Anas platyrhynchos
<400> 12
gatcaaaatg caactaagct gtcgcaagca caagatgcac ctaaacacac catcaagatg 60
atcttagaaa ctagcgatta atttgaaccc acgaaagcca gggcccaaac tgggattaga 120
taccccacta tgcctggccc taaatcttga tacttaccct accgaagtat ccgccagaga 180
actacgagca caaacgctta aaactctaag gacttggcgg tgccctaaac ccacctagag 240
gagcctgttc tgtaatcgat gatccacgat caacccaacc gccccttgcc 290
<210> 13
<211> 341
<212> DNA
<213> Bos taurus
<400> 13
ccctctaggt tgttaaaact aagaggagct ggcatcaagc acacaccctg tagctcacga 60
cgccttgctt aaccacaccc ccacgggaaa cagcagtgac aaaaattaag ccataaacga 120
aagtttgact aagttatatt aattagggtt ggtaaatctc gtgccagcca ccgcggtcat 180
acgattaacc caagctaaca ggagtacggc gtaaaatgtg ttaaagcacc acaccaaata 240
gggttaaatt ctaaccaagc tgtaaaaagc catgattaaa ataaaaataa atgacgaaag 300
tgaccctaca gtagccgacg cactatagct aagacccaaa c 341
<210> 14
<211> 481
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 14
acggtagctc ataacgcctt gctcaaccac acccccacgg gaaacagcag tgataaaaat 60
taagccatga acgaaagttt gactaagtta tattaattag agttggtaaa tctcgtgcca 120
gccaccgcgg tcatacgatt aacccaaatt aatagatcca cggcgtaaag agtgtttaag 180
aaaaaaaaac cacaatagag ttaaattata actaagctgt aaaaagccct agttaaaata 240
aaataaccca cgaaagtgac tctaataatc ctgacacacg atagctagga cccaaactgg 300
gattagatac cccactatgc ctagccctaa acccaaatag ttacataaca aaactattcg 360
ccagagtact actcgcaact gcctaaaact caaaggactt ggcggtgctt cacatccacc 420
tagaggagcc tgttctataa tcgataaacc ccgatagacc ttaccaaccc ttgccaattc 480
a 481
<210> 15
<211> 610
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 15
caaaaggagc aggtatcagg cacactcagc agtagcccaa gacgccttgc ttaagccaca 60
cccccacggg tactcagcag taattaacct taagcaataa gtgtaaactt gacttagcca 120
tagcaaccca gggttggtaa atcttgtgcc agccaccgcg gtcatacaag aaacccaaat 180
caatagctac ccggcgtaaa gagtggccac atgttatctg caccagctaa gattaaaatg 240
caaccaagct gtcataagcc taagatccac ctaaacccaa cccaaatcca tcttagccta 300
aacgattaat tttaacccac gaaagctagg acccaaactg ggattagata ccccactatg 360
cctagcccta aatctagata cctcccatca cacatgtatc cgcctgagaa ctacgagcac 420
aaacgcttaa aactctaagg acttggcggt gccccaaacc cacctagagg agcctgttct 480
ataatcgata atccacgatt cacccaacca ccccttgcca gcacagccta cataccgccg 540
tcgccagccc acctctaatg aaagaacaac agtgagctca atagcccctc gctaataaga 600
caggtcaagg 610

Claims (6)

1.同时检测肉及肉制品中五种动物源成分的PCR检测引物，所述引物为五组特异性引物，其序列如下：
羊源特异性引物：
上游引物F:CAAAATTATTCGCCAGAGTACTACCG
下游引物R:CTCCATAGGTTACACCTTGACCTAACGTC
鸭源特异性引物：
上游引物F:GATCAAAATGCAACTAAGCTGTCGC
下游引物R:GGCAAGGGGCGGTTGGGTTG
牛源特异性引物：
上游引物F:CCCTCTAGGTTGTTAAAACTAAGAGGAGCT
下游引物R:GTTTGGGTCTTAGCTATAGTGCGTCG
猪源特异性引物：
上游引物F:ACGGTAGCTCATAACGCCTTGCTC
下游引物R:TGAATTGGCAAGGGTTGGTAAGGTC
鸡源特异性引物：
上游引物F:CAAAAGGAGCAGGTATCAGGCACACT
下游引物R:CCTTGACCTGTCTTATTAGCGAGGG。
2.同时检测肉及肉制品中五种动物源成分的PCR检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒中的特异性引物的序列如下：
羊源特异性引物：
上游引物F:CAAAATTATTCGCCAGAGTACTACCG
下游引物R:CTCCATAGGTTACACCTTGACCTAACGTC
鸭源特异性引物：
上游引物F:GATCAAAATGCAACTAAGCTGTCGC
下游引物R:GGCAAGGGGCGGTTGGGTTG
牛源特异性引物：
上游引物F:CCCTCTAGGTTGTTAAAACTAAGAGGAGCT
下游引物R:GTTTGGGTCTTAGCTATAGTGCGTCG
猪源特异性引物：
上游引物F:ACGGTAGCTCATAACGCCTTGCTC
下游引物R:TGAATTGGCAAGGGTTGGTAAGGTC
鸡源特异性引物：
上游引物F:CAAAAGGAGCAGGTATCAGGCACACT
下游引物R:CCTTGACCTGTCTTATTAGCGAGGG。
3.如权利要求2所述的同时检测肉及肉制品中五种动物源成分的PCR检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒的组成如下：
10μL体系：5.0μL的2×Taq Plus Master Mix、上下游引物的终浓度各为1μM、1.0μg待测模板DNA，以ddH2O补足体系。
4.利用权利要求2或3所述的试剂盒来鉴别肉及肉制品中猪牛羊鸡鸭源成分的方法，所述方法为：
提取待测肉及其制品样品的DNA作为PCR模板，利用同时检测肉及肉制品中五种动物源成分的PCR检测试剂盒中的五组特异性引物作为扩增引物，进行多重PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现231bp的特异DNA条带，则检出羊源性成分，反之则否；若电泳结果出现290bp的特异DNA条带，则检出鸭源性成分，反之则否；若电泳结果出现341bp的特异DNA条带，则检出牛源性成分，反之则否；若电泳结果出现481bp的特异DNA条带，则检出猪源性成分，反之则否；若电泳结果出现610bp的特异DNA条带，则检出鸡源性成分，反之则否。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述多重PCR扩增的反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述鉴别肉及肉制品中猪牛羊鸡鸭源成分的方法包括如下步骤：
(1)提取待测肉及其制品样品的DNA作为PCR模板；
(2)利用同时检测肉及肉制品中五种动物源成分的PCR检测试剂盒中的五组特异性引物作为扩增引物，进行多重PCR扩增，PCR扩增的反应体系如下：
由5.0μL的2×Taq Plus Master Mix、上下游引物各为10μM、1.0μg待测模板DNA，以ddH2O补足10μL体系；
所述多重PCR扩增的反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；
(3)PCR扩增产物进行电泳检测：
取待检测的PCR产物1-2μL，用2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，若电泳结果出现231bp的特异DNA条带，则检出羊源性成分，反之则否；若电泳结果出现290bp的特异DNA条带，则检出鸭源性成分，反之则否；若电泳结果出现341bp的特异DNA条带，则检出牛源性成分，反之则否；若电泳结果出现481bp的特异DNA条带，则检出猪源性成分，反之则否；若电泳结果出现610bp的特异DNA条带，则检出鸡源性成分，反之则否。
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