JP2011045384A - プライマー配列 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】特定の塩基配列からなる群より選択される配列の組み合わせである、鶏特異的DNA検出用プライマー対、ウシ特異的DNA検出用プライマー対、ブタ特異的DNA検出用プライマー対。生肉、鶏肉加工食品、鶏肉加工品含有食品、血液、体液、羽毛、肉骨粉、骨粉、チキンミール、ならびにこれらを含有する飼料、肥料、および飼料添加物からなる群より選択される試料に含まれる鶏由来の成分、ウシ由来の成分、およびブタ由来成分を検出する方法。動物由来成分検出用キット。
【選択図】なし
Description
反芻動物、ウシ、およびブタ由来DNA検出用プライマーについては、図1および図2に示す各種動物のatp8遺伝子のDNA配列のアラインメントに基づいて、以下の各実施例に用いるプライマー領域を選択した。また、魚類由来DNA検出用プライマーについては、図7に示す各種動物のatp8遺伝子およびその近傍のDNA配列のアラインメントに基づいて、プライマー領域を選択した。鶏由来DNA検出用プライマーについては、図8に示す各種動物のatp8遺伝子およびその近傍のDNA配列のアラインメントに基づいて、プライマー領域を選択した。選択した領域のDNA配列を、DNA自動合成機を用いて合成した。
ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカ、ブタ、ウマ、ウサギ、クジラ、ニワトリ、タラ、サケ、イワシ、カニ、エビ、およびアサリの15種類の肉試料から、ミトコンドリアDNAを以下のように調製した。各肉試料を10倍量の緩衝液(10mM Tris-HCl, pH 7.5、20mM EDTA, pH 7.5)に懸濁し、ビーズ破砕法で破砕した後、市販の組織細胞ミトコンドリアDNA抽出キットであるmtDNAエキストラクターCTキット(和光純薬工業製)を用いてDNAを抽出した。
実施例1と同様に調製した15種類のDNA試料を鋳型とし、Fpc-F(配列番号3)とFpc-R(配列番号4)とを、それぞれ5’側および3’側プライマーとして用いて、PCRを行った。PCRの条件は以下の通りである:95℃で9分熱変性した後、変性:92℃、30秒;アニーリング:55℃、30秒;伸長:72℃、30秒の反応を、45サイクル繰り返し、最後に72℃、5分反応させた。反応終了後、アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色してPCR産物(DNA断片)を検出した。結果を図4に示す。
家畜用配合飼料(主成分:トウモロコシ、マイロ、グルテンフィード、ふすま、米ぬか、大豆油かす、なたね油かす)に所定の割合でウシ由来の肉骨粉(オーストラリア産)を混合した。得られた飼料を100mgとり、上記実施例1と同様に10倍量の緩衝液に懸濁し、ビーズ破砕法で破砕した後、市販の組織細胞ミトコンドリアDNA抽出キット(和光純薬工業製)を用いてミトコンドリアDNAを抽出した。このDNAを鋳型として、哺乳動物由来DNA配列を特異的に検出するプライマー対であるanicon5(配列番号41)とanicon3(配列番号42)(特許文献1参照)、上記実施例1で用いた反芻動物由来DNA配列を特異的に検出するプライマー対であるFpr-F(配列番号1)とFpr-R(配列番号2)、ならびに上記実施例2で用いたウシ由来DNA配列を特異的に検出するプライマー対であるFpc-F(配列番号3)とFpc-R(配列番号4)とを用いて、実施例1と同じ条件でPCRを行った。結果を図5に示す。0.01質量%の肉骨粉が含まれている場合でも、ウシ由来のDNA配列を検出できることが判明した。
実施例1と同様に調製した15種類のDNA試料を鋳型とし、pig5-3(配列番号5)とpig32-2(配列番号6)とを、それぞれ5’側および3’側プライマーとして用いて、PCRを行った。PCRの条件は以下の通りである:95℃で9分熱変性した後、変性:92℃、30秒;アニーリング:60℃、1分;伸長:72℃、1分の反応を、45サイクル繰り返し、最後に72℃、5分反応させた。反応終了後、アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色してPCR産物(DNA断片)を検出した。結果を図6に示す。
魚粉に使用される種々の魚類由来の成分を幅広く検出する目的で、図7に示すatp8遺伝子およびその近傍のDNA配列のアラインメントに基づいて、数箇所のプライマー領域を選択した。図7には、例として、fish5(配列番号7)とfish3-1(配列番号15)ならびにFM5(配列番号12)とFM3(配列番号25)の位置を二重下線で示す。
市販の牛飼育用の配合飼料およびチキンミールに混入した魚粉を検出できるかどうかについて検討した。使用した魚粉の原料は(1)サバおよびサンマ、(2)マグロおよびカツオ、ならびに(3)イワシであり、0.5mmメッシュの網ふるいを通過したものを使用した。配合飼料としては、市販の牛用配合飼料を粉砕器および乳鉢で粉砕し、0.5mmメッシュの網ふるいを通過したものを使用した。なお、配合飼料の配合割合は、以下の表3に示すとおりである。チキンミールは、市販のチキンミールであり、0.5mmメッシュの網ふるいを通過したものを使用した。
鶏由来の成分を幅広く検出する目的で、図8に示すatp8遺伝子およびその近傍のDNA配列のアラインメントに基づいて、数箇所のプライマー領域を選択した。図8には、例として、chick5-1(配列番号32)とchick3-1(配列番号36)の位置を二重下線で示す。
上記実施例6で用いた市販の牛飼育用の配合飼料中に、市販のチキンミールを10、1、0.1、0.01、または0.001質量%含む試料を調製した。これらの試料および無添加の試料について、上記実施例5と同様にDNAを抽出し、chick5-1(配列番号32)とchick3-1(配列番号36)とのプライマー対を用いてPCRを行った。
Claims (14)
- 配列表の配列番号32、33、34、および35の配列からなる群より選択される配列と、配列表の配列番号36、37、および38の配列からなる群より選択される配列との組み合わせである、鶏特異的DNA検出用プライマー対。
- 前記鶏が、ニワトリおよびウズラからなる群より選択される、請求項1に記載のプライマー対。
- 配列表の配列番号3の配列と配列表の配列番号4の配列との組み合わせである、ウシ特異的DNA検出用プライマー対。
- 配列表の配列番号5の配列と配列表の配列番号6の配列との組み合わせである、ブタ特異的DNA検出用プライマー対。
- 試料中の鶏由来の成分を検出する方法であって、請求項1または2に記載のプライマー対を用い、試料中のDNAを鋳型として、DNA断片をPCR法により増幅する工程、および該増幅されたDNA断片を検出する工程を含む、方法。
- 前記試料が、生肉、鶏肉加工食品、鶏肉加工品含有食品、血液、体液、羽毛、肉骨粉、骨粉、チキンミール、ならびにこれらを含有する飼料、肥料、および飼料添加物からなる群より選択される、請求項5に記載の方法。
- 試料中のウシ由来の成分を検出する方法であって、請求項3に記載のプライマー対を用い、試料中のDNAを鋳型として、DNA断片をPCR法により増幅する工程、および該増幅されたDNA断片を検出する工程を含む、方法。
- 前記試料が、生肉、肉加工食品、肉加工品含有食品、血液、体毛、体液、乳、乳加工品、肉骨粉、骨粉、ならびにこれらを含有する飼料、肥料、および飼料添加物からなる群より選択される、請求項7に記載の方法。
- 試料中のブタ由来の成分を検出する方法であって、請求項4に記載のプライマー対を用い、試料中のDNAを鋳型として、DNA断片をPCR法により増幅する工程、および該増幅されたDNA断片を検出する工程を含む、方法。
- 前記試料が、生肉、肉加工食品、肉加工品含有食品、血液、体毛、体液、乳、乳加工品、肉骨粉、骨粉、ならびにこれらを含有する飼料、肥料、および飼料添加物からなる群より選択される、請求項9に記載の方法。
- 請求項1〜4のいずれかの項に記載のプライマー対を用い、試料中のDNAを鋳型として、DNA断片をPCR法により増幅する工程、および該増幅されたDNA断片を検出する工程を含む、動物種識別方法。
- 配列表の配列番号39の配列と配列表の配列番号40の配列との組み合わせである植物特異的DNA検出用プライマー対を用い、試料中のDNAを鋳型として、DNA断片をPCR法により増幅する工程、および該増幅されたDNA断片を検出する工程をさらに含む、請求項11に記載の動物種識別方法。
- 請求項1〜4のいずれかの項に記載のプライマー対および配列表の配列番号41の配列と配列表の配列番号42の配列との組み合わせである哺乳動物特異的DNA検出用プライマー対のうちの少なくとも1つのプライマー対を含む、動物由来成分検出用キット。
- さらに、配列表の配列番号39の配列と配列表の配列番号40の配列との組み合わせである植物特異的DNA検出用プライマー対を含む、請求項13に記載のキット。
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