DE3750198T2 - Hybridisierungssonden. - Google Patents
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verwendung von Hybridisierungssonden, Hybridisierungssonden hierfür und Kits bzw. Ausrüstungen zur Verwendung in solch einem Verfahren. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die Diskriminierung einer spezifischen Basensequenz aus einer Varianzbasensequenz und betrifft insbesondere die Vorteile, welche durch Unterziehen benachbarter Segmente einer Targetbasensequenz der Hybridisierung mit einer nachweisbaren ersten Nucleotidsonde und einer zweiten Nucleotidsonde erhalten werden können.
- Die vorliegende Erfindung betrifft inter alia die Diskriminierung spezifischer Basensequenzen bei Verbesserung des Problems der nicht-spezifischen Hintergrundhybridisierung, welche häufig bei der Hybridisierung von kurzen Oligonucleotidsonden an komplexe Genome auftritt.
- Die Hybridisierungsanalyse von Nucleinsäure ist eine Technik mit breiter Anwendbarkeit auf den Gebieten der biomedizinischen Forschung und der Technologie der rekombinanten DNA. So sind Hybridisierungssonden beispielsweise zum Nachweis, zur Überwachung, zur Lokalisierung und zur Isolierung von Nucleinsäuren und anderen Molekülen von wissenschaftlichem oder klinischem Interesse brauchbar. Besonders brauchbar sind kleine Oligonucleotid-Hybridisierungssonden, welche beispielsweise dazu verwendet werden können, um Änderungen in DNA-Basensequenzen in bezug auf bestimmte Krankheitszustände wie Phenylketonurie, Alphaantitrypsinmangel, Alpha- und Betathalassämie und Sichelzellenanämie nachzuweisen. Diese Krankheitszustände sind oft mit bekannten einzelnen Punktmutationen in Genen verbunden.
- Obwohl kurze Oligonucleotid-Hybridisierungssonden von beträchtlichem Nutzen sind, sind sie üblicherweise mit einem hohen Hintergrund nicht-spezifischer Hybridisierung verbunden, insbesondere wenn sie zur Analyse der Genome von höheren Organismen eingesetzt werden. Dieses Problem rührt von der größeren Komplexität des Genoms her. So können Säugetiere beispielsweise in der Größenordnung von tausendfach mehr DNA pro Zelle als Bakterien enthalten, und zahlreiche der Nucleotidsequenzen können wiederholt sein. Für eine vorgegebene Nucleotidsonde werden daher stabile Duplexe (im folgenden auch als Hybride bezeichnet) üblicherweise gebildet, welche von dem gewünschten Duplex verschieden sind. Dieses Problem ist insbesondere bei Verwendung sehr hoher Oligonucleotidkonzentrationen, um den Hybridisierungsprozeß zu beschleunigen, ausgeprägt. Dieses Problem kann durch Anwendung der Gelelektrophorese zur Auflösung verschiedener DNA- (oder RNA-)Fragmente vor der Oligonucleotidhybridisierung zur Sicherstellung, daß ein spezifisch hybridisierendes Fragment von nicht-spezifisch hybridisierenden Fragmenten getrennt wird, gelöst werden. Beispielsweise verwenden Woo et al. (Banbury Raport, Recombinant DNA Applications to Human Disease, Cold Spring Harbor Laboratory (1983) S. 105-110) die Southern-Transfertechnik, um kleine Restriktionsfragmente aufzulösen, welche an eine alpha&sub1;-Antitrypsinoligonucleotidsonde von DNA-Spezies mit höherem Molekulargewicht hybridisieren, welche ebenfalls an diese Sonde hybridisieren.
- Die Oligonucleotid-Hybridisierungsanalyse von komplexen Genomen unter Verwendung der Gelelektrophorese erfordert die Präparation von Molekülen reiner DNA (oder RNA) aus den Organismen, die Fragmentierung der DNA-Moleküle durch Behandlung mit Restriktionsendonucleasen und, in den meisten Fällen, den Transfer der aufgelösten DNA- (oder RNA-)Moleküle von dem Gel auf einen festen Träger zur Hybridisierung. Die Komplexität dieser Arbeitsweise macht sie für routinemäßige diagnostische Anwendung ungeeignet und schwierig zu automatisieren.
- Einfachere Methoden für die Hybridisierungsanalyse, welche lange Polynucleotidsonden spezifisch hybridisieren, werden von J. Brandsma und G. Miller, Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), Vol. 77 (1980), S. 6851-6855, für DNA und von T. Manser und M.L. Gefter Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Vol. 81 (1984), S. 2470-2474, für RNA beispielhaft gezeigt, und sie umfassen die direkte Immobilisierung von DNA oder RNA aus rohen Zell-Lysaten auf feste Träger. Wegen der nicht-spezifischen Hybridisierung sind solche direkten Immobilisierungsmethoden üblicherweise mit der Verwendung von Oligonucleotidsonden nicht kompatibel.
- Die EP-A-0 185 494, welche zum Stand der Technik im Sinne von Art. 54(3) EPÜ gehört, betrifft ein Verfahren zum Testen der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Targetnucleotidsequenz in einer denaturierte Nucleinsäure enthaltenden Probe. Diese Methode erfordert spezifisch Hybridisierungsbedingungen, in welchen eine erste Sonde (die diagnostische Sonde) nur an die Targetnucleinsäure bindet, falls sie komplementär zu dem diagnostischen Abschnitt der Targetsequenz ist. Eine zweite Sonde (die anstoßende Sonde) ist komplementär zu einer Nucleotidsequenz anstoßend an den diagnostischen Abschnitt. Falls die diagnostische Sonde gebunden wird, wird sie dann mit der anstoßenden Sonde ligatiert und nachgewiesen. Falls die Targetsequenz nicht identisch mit der diagnostischen Sonde ist, tritt daher keine Bindung auf.
- Zusätzlich zu dem zuvorgenannten Problem der nicht-spezifischen Hintergrundhybridisierung betrifft die vorliegende Erfindung inter alia ebenfalls die Vereinfachung des Nachweises von Verschiebungen, welche bislang nur durch Gelmethoden nachweisbar waren.
- Die vorliegende Erfindung basiert daher, zumindest teilweise, auf dem Auffinden eines Verfahrens zur Diskriminierung zwischen alternativen Nucleotidsequenzen unter Aufhebung der zuvorgenannten Probleme. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist daher von Interesse inter alia bei der Vereinfachung des Nachweises von Verschiebungen und der Möglichkeit des raschen Auffindens einer Mutation in einer vorgegebenen Basensequenz durch beispielsweise Ermöglichung einer aussagekräftigen Analyse von direkt immobilisierten DNA- oder RNA-Proben oder alternativ DNA- oder RNA-Proben in Lösung. In diesem Zusammenhang ist es bekannt, daß die Selektivität der Hybridisierung umso schlechter und dazu entsprechend der Hintergrund umso größer sind, je kürzer die Nucleotidsonde ist. Darüber hinaus ist die Stabilität des gebildeten Duplex, gemessen durch seine Schmelztemperatur (Tm), welche die Temperatur des mittleren Punktes des thermischen Übergangs ist, umso schwächer, je kürzer die Nucleotidsonde ist. Die vorliegende Erfindung basiert wenigstens teilweise auf der Feststellung, daß die unterschiedlichen Hybridisierungseigenschaften einer kurzen Nucleotidsonde relativ zu einer vergleichsweise längeren Nucleotidsonde in vorteilhafter Weise zur Diskriminierung zwischen alternativen Nucleotidsequenzen ausgenutzt werden können, wobei die zuvorgenannten Probleme besser gelöst werden.
- Die vorliegende Erfindung basiert weiterhin auf dem Auffinden eines Verfahrens, welches die Hybridisierungsanalyse wesentlich vereinfacht, so daß eine robuste Arbeitsweise zur Diskriminierung zwischen alternativen Nucleotidsequenzen bereitgestellt wird.
- Gemäß einem Merkmal der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zur Diskriminierung zwischen alternativen Nucleotidsequenzen bereitgestellt, wobei das Verfahren umfaßt: das Unterziehen benachbarter Segmente einer Targetbasensequenz der Hybridisierung mit einer nachweisbaren ersten Nucleotidsonde und mit einer zweiten Nucleotidsonde zur Bildung eines Hybrids, wobei die Nucleotidsequenz der ersten und der zweiten Sonde derart sind, daß, falls sie ein Splitsondenhybrid mit einer komplementären Targetsequenz bilden, sie anschließend aneinander gebunden werden können, das Unterziehen irgendeines erhaltenen Hybrids der Bindung, gefolgt vom Nachweis irgendeines erhaltenen Hybrids, wobei die DNA-Sequenz der nachweisbaren ersten Nucleotidsonde und der zweiten Nucleotidsonde derart sind, daß ein potentieller Fehler in der Targetsequenz entweder zwischen diesen Sonden oder an dem endständigen Ende von einer dieser Sonden, welche an die andere dieser Sonden angrenzt, liegt; das Verfahren so durchgeführt wird, daß eine komplementäre Targetsequenz von einer Targetsequenz mit einem oder mehreren nicht-komplementären Nucleotiden diskriminiert wird.
- Falls erforderlich, kann irgendein Hybrid, das im Anschluß an die Bindung erhalten wird, der selektiven Denaturierung unterworfen werden.
- Die Anwesenheit einer gebundenen Sonde kann durch ein beliebiges geeignetes Mittel nachgewiesen werden, beispielsweise selektive Denaturierung, oder falls eine der Sonden ein Glied eines Bindungspaares trägt, dann durch Verwendung des anderen Gliedes des Bindungspaares. Geeignete Beispiele von Bindungspaaren werden im folgenden diskutiert. Es sei darauf hingewiesen, daß man entweder eine komplementäre oder eine nicht-komplementäre Targetsequenz durch die Abwesenheit eines nachweisbaren Hybrids identifizieren könnte, und dies liegt innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung.
- Es sei darauf hingewiesen, daß bislang die Diskriminierungsspezifität durch sorgfältige Manipulation der Hybridisierungstemperatur und des Waschens der gebundenen Diskriminierungssonden erreicht wurde. Bei der vorliegenden Erfindung sind die Sonden so ausgelegt, daß sie mit der Targetsequenz auf beiden Seiten eines potentiellen Fehlers hybridisieren, wobei dort eine Lücke vorliegt, bevorzugt eine einzelne Nucleotidlücke, zwischen den Sonden, oder die Sonden können so ausgelegt sein, daß sie an benachbarte Sequenzen in der Targetsequenz hybridisieren, wobei irgendein potentieller Fehler an dem endständigen Ende einer der Sonden vorliegt, wobei dieses endständige Ende benachbart zu der anderen Sonde ist. Der Effekt der vorliegenden Erfindung ist, daß Spezifität hauptsächlich das Ergebnis der Wechselwirkung zwischen zwei unabhängig in Wechselwirkung tretenden Sonden und den Mitteln zum Binden der zuvorgenannten Sonden, beispielsweise T4 DNA-Ligase, ist. Auf diese Weise ermöglicht die vorliegende Erfindung die Durchführung eines Verfahrens zur Diskriminierung, bei welchem Bindung, z. B. Ligation durch beispielsweise T4 DNA-Ligase, weniger effizient zu erwarten ist, wenn der/die Rest/e an jedem der 3'- oder 5'-Plätze der benachbarten- zu verbindenden Sonden nicht komplementär zu der Sequenz ist/sind, an welche sie hybridisiert werden. Wenn eine Lücke, bevorzugt eine einzelne Nucleotidlücke, zwischen den zwei Sonden vorliegt, ermöglicht die vorliegende Erfindung in ähnlicher Weise die Durchführung eines Verfahrens zur Diskriminierung, bei welchem die Inkorporation von Nucleotiden mit beispielsweise dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I oder Kalbsthymus-DNA- Polymerase-alpha zum Auffüllen in der Lücke und zur Ermöglichung der Bindung mit beispielsweise DNA-Ligase signifikant weniger effizient sein wird, wo das zugesetzte Deoxynucleotidtriphosphat zu beispielsweise der DNA-Polymerasereaktionsmischung nicht zu dem zu untersuchenden Basenrest komplementär ist.
- Die vorliegende Erfindung ermöglicht daher eine wesentliche Vereinfachung der Hybridisierungsanalyse und ermöglicht die Herstellung einer robusten Technik zur Diskriminierung zwischen alternativen Nucleotidsequenzen. So kann beispielsweise die Notwendigkeit des Zugriffs auf die Verwendung einer Hybridisierung oder eines Waschens innerhalb eines schmalen Temperaturbereiches und für eine spezifische Zeitspanne entfallen, so daß die einer beliebigen, sich schmaler Fehlerbereiche bedienenden Technik eigenen Schwierigkeiten entfallen. Die vorliegende Erfindung macht es sogar zumindest bei bestimmten Ausführungsformen möglich, die Hybridisierungsanalyse bei Zimmertemperatur durchzuführen.
- Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise durchgeführt werden entweder durch Nachweis eines nachweisbaren, aus komplementärer Hybridbildung herrührendem Signals, wo eine komplementäre Targetsequenz vorliegt, wobei das Hybrid, falls erforderlich, vor dem Nachweis denaturiert wird, oder durch das Fehlen des Nachweises eines nachweisbaren Signals, das aus der Abwesenheit von Hybridbildung über einem Fehler oder aus selektiver Denaturierung irgendeines gebildeten Hybrids herrührt, wo eine Targetsequenz mit einem oder mehreren komplementären Nucleotid/en vorhanden ist.
- Obwohl daher die erste Nucleotidsonde nachweisbar sein muß, kann das zweite Nucleotid nachweisbar oder nicht nachweisbar sein, abhängig von der anzuwendenden Ausführungsform des Verfahrens.
- Der Ausdruck nachweisbar wird hier dazu verwendet, die Fähigkeit des Nachweises zu bezeichnen. Daher muß die erste Nucleotidsonde kein signalgebendes Mittel wie eine radioaktive Markierung oder einen nicht-radioaktiven signalgebenden Komplex tragen, obwohl ein solcher vorliegen kann, vorausgesetzt, daß die Sonde anschließend behandelt werden kann, um sie zur Signalgebung in die Lage zu versetzen. Auf diese Weise ist es möglich, zwischen Sequenzen in einem komplexen Genom zu diskriminieren, welche sich nur durch ein Basenpaar unterscheidet.
- Wenn ein Splitsondenhybrid im Anschluß an die Hybridisierung mit einer komplementären Targetbasensequenz gebildet würde, wird irgendein erhaltenes Hybrid einer Bindungsreaktion unterworfen, um die nachweisbare, erste Nucleotidsonde mit der zweiten Nucleotidsonde zu verbinden, wobei irgendein erhaltenes Hybrid der geeigneten Behandlung unterzogen wird, wodurch irgendein vorliegendes Hybrid, in welchem die Bindung der nachweisbaren, ersten Nucleotidsonde mit der zweiten Nucleotidsonde nicht durchgeführt wird, denaturiert wird, während keine Denaturierung für ein perfekt komplementäres, nachweisbares, gebundenes Oligonucleotid-Targetsequenzhybrid herbeigeführt wird. Wenn eine Sonde zur Hybridisierung mit einem Teil der Targetsequenz, welche einen Verdachtsfehler enthält, ausgelegt ist, ist die Sonde im allgemeinen ein Oligonucleotid (wie im folgenden definiert). Geeignete Behandlung kann beispielsweise selektive Denaturierung einschließen, oder eine der Sonden kann ein Glied eines Bindungspaares umfassen. Die Bindung von benachbarten stabilen Hybriden von erster und zweiter Nucleotidsonde ergibt eine größere thermische Stabilität des Hybrids für das nachweisbare Oligonucleotid, das an eine spezifische Targetsequenz gebunden ist, im Gegensatz zu nachweisbaren Oligonucleotiden, welche an nicht-spezifische Targetsequenzen mit keiner vorliegenden benachbarten Oligonucleotidsonde hybridisiert sind.
- Der hier verwendete Ausdruck "Oligonucleotid" bedeutet eine Nucleotidsequenz, welche entweder nicht zur Bildung eines Hybrids mit einer Targetsequenz, welche nur einen einzelnen Basenpaarfehler enthält, in der Lage ist, oder in der Lage ist, ein solches Hybrid zu bilden, wobei ein solches Hybrid jedoch durch die Anwesenheit von nur einem einzelnen Basenpaarfehler destabilisiert wird, so daß es selektiv unter Bedingungen denaturiert werden kann, welche ein entsprechendes, perfekt komplementäres Hybrid nicht denaturieren würden.
- Es sei darauf hingewiesen, daß die potentielle Varianzsequenz in dem Segment der Targetsequenz, an welche die nachweisbare erste Nucleotidsonde hybridisiert, vorhanden sein kann, sie kann in dem Segment der Targetsequenz, an welche die zweite Nucleotidsonde hybridisiert, vorhanden sein, oder sie kann zwischen diesen Segmenten vorliegen. Die Sonden werden so ausgelegt, daß im Fall des Vorhandenseins der potentiellen Varianzsequenz in dem Segment der Targetsequenz, an welche entweder die nachweisbare erste Nucleotidsonde oder die zweite Nucleotidsonde hybridisiert, dann die potentielle Varianzsequenz an dem endständigen Ende einer dieser Sonden vorliegt, wobei dieses endständige Ende angrenzend an das andere dieser Sonden ist.
- Wenn beispielsweise die potentielle Varianzsequenz in dem Segment der Targetsequenz, an welche die zweite Nucleotidsonde hybridisiert, vorliegt, ergibt sich die Bildung eines Splitsondenhybrids entweder in der Bildung eines schwachen Hybrids der zweiten Sonde über den Fehler, oder, falls die zweite Sonde sehr kurz ist, überhaupt keine Hybridisierung. Falls ein schwaches Hybrid gebildet wird, ergibt sich selektive Denaturierung bei der Denaturierung des zweiten Sondenhybrids. Falls das erhaltene Hybrid dann der Bindung unterworfen wird, kann die Bindung nur stattfinden, falls die zweite Sonde an die Targetsequenz hybridisiert ist, und daher, wenn kein Fehler in der zweiten Sonde: Targetsequenzhybrid vorliegt. Falls das nach der Bindung erhaltene Hybrid der selektiven Denaturierung unterzogen wird, denaturiert ein vorliegendes Hybrid, in welchem die erste Sonde alleine an die Targetsequenz ohne Bindung an die zweite Sonde hybridisiert ist, so daß nachweisbare Sonde zurückbleibt, hybridisiert nur an die Targetsequenz, welche keinen Fehler mit der komplementären Sequenz der zweiten Probe enthält.
- Die erste oder zweite Nucleotidsonde kann gewünschtenfalls ein Glied eines Bindungspaares besitzen. Im allgemeinen wird das eine Glied eines Bindungspaares durch die zweite Nucleotidsonde oder einen Teil hiervon getragen. Das andere Glied des Bindungspaares kann in Lösung oder auf einem Träger vorliegen. Daher kann geeignetenfalls die zweite Nucleotidsonde,, welche an die nachweisbare, erste Nucleotidsonde gebunden ist, auf einem Träger isoliert werden, welcher das andere Glied des Bindungspaares trägt. Ein solches Bindungspaar kann beispielsweise ein Proteinligand oder eine Antigen-Antikörper-Wechselwirkung wie eine Avidin-Biotin- oder Dinitrophenyl-Antidinitrophenyl-Antikörper-Wechselwirkung sein.
- Tatsächlich kann ein Glied des Bindungspaares eine Nucleotidsequenz sein, wobei diese Sequenz ein Teil der Sondensequenz sein kann oder ein Nucleotidsequenzzweig auf der Sonde. Das andere Glied des Bindungspaares kann beispielsweise ein Protein sein, welches an die Nucleotidsequenz bindet, oder eine andere Nucleotidsequenz, an welche es hybridisiert.
- Die Hybridisierung und/oder selektive Denaturierung wird bevorzugt bei einer ausgewählten Temperatur durchgeführt, um effektive Hybridisierungsselektivität, bevorzugt maximale Hybridisierungsselektivität für die spezifische Länge der gebundenen Sonde, zu ergeben. Vorteilhafterweise erfolgt die Hybridisierung und/oder selektive Denaturierung in wäßriger Lösung bei einer erhöhten Temperatur, welche für selektive Hybridisierung an ein Säugetier-Genom geeignet ist, wobei sie für eine Splitsonde, falls gebunden, bevorzugt oberhalb 60ºC im allgemeinen bei etwa 68ºC liegt. Alternativ kann die Hybridisierung und/oder selektive Denaturierung einer solchen Splitprobe, falls gebunden, bei einer niedrigeren Temperatur in Anwesenheit eines organischen Lösungsmittels, welches zur Destabilisierung des Hybrids wirksam ist, wie einem Formamid enthaltenden Lösungsmittel, durchgeführt werden. Wenn beispielsweise etwa 50% Formamid eingesetzt werden, wird die Hybridisierung und/oder selektive Denaturierung bei etwa 42ºC durchgeführt.
- Bei einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Hybridisierung-Sondenuntersuchung bereitgestellt, welches umfaßt: das Unterwerfen benachbarter Segmente der Targetbasensequenz der Hybridisierung mit einer nachweisbaren, ersten Nucleotidsonde und mit einer zweiten Nucleotidsonde, so daß ein Splitsondenhybrid mit einer komplementären Targetsequenz gebildet wird, falls erforderlich das Unterwerfen des erhaltenen Hybrids der selektiven Denaturierung, um jede der ersten und zweiten Nucleotidsonden, welche an einen Teil der Targetbasensequenz mit einem oder mehreren nicht-komplementären Nucleotid/en hybridisiert ist, zu denaturieren und anschließend das Unterwerfen des erhaltenen Hybrids der Bindungsreaktion, um die nachweisbare, erste Nucleotidsonde mit der zweiten Nucleotidsonde zu verbinden, und, falls erforderlich, Unterwerfen des erhaltenen Hybrids der selektiven Denaturierung, wodurch zwischen einer Targetsequenz komplementär zu den ersten und zweiten Nucleotidsonden und einer Targetsequenz mit einem oder mehreren Nucleotiden, nicht komplementär zu einer der ersten und zweiten Nucleotidsonden, diskriminiert wird.
- Die Hybridisierung oder selektive Denaturierung kann beispielsweise bei einer Temperatur oberhalb der Schmelztemperatur des Split- oder Einzelnucleotidsondenhybrids jedoch unterhalb der Schmelztemperatur des gebundenen Sondenhybrids oder in Anwesenheit eines zur Destabilisierung des Hybrids wirksamen organischen Lösungsmittels, wie zuvor erläutert, durchgeführt werden. Wenn die Hybridisierung unter selektiven Denaturierungsbedingungen durchgeführt wird, kann eine weitere selektive Denaturierungsstufe nach der Hybridisierung, jedoch vor der Bindung vermieden werden.
- Die erste und zweite Nucleotidsonde können mittels geeigneter, an sich bekannter Mittel, wie beispielsweise durch enzymatische Ligation unter Verwendung von beispielsweise einer DNA-Ligase oder durch kovalente/nicht-kovalente Bindung unter Verwendung beispielsweise einer Biotin-Avidin-Vernetzung gebunden bzw. verknüpft werden.
- Die nachweisbare, erste Nucleotidsonde und/oder die zweite Nucleotidsonde können anfänglich nicht in der Lage sein, miteinander gebunden, z. B. ligatiert, zu werden, bis die Lücke/en zwischen ihnen mit DNA-Polymerase in Anwesenheit der interessierenden Targetsequenz aufgefüllt ist/sind.
- Der Effekt der Bindung der nachweisbaren, ersten Nucleotidsonde und der zweiten Nucleotidsonde besteht in der Erhöhung der thermischen Stabilität des erhaltenen, vernetzten Sondenhybrids gegenüber dem entsprechenden nachweisbaren Sondenhybrid alleine. So kann beispielsweise die Temperatur des gebundenen Sondenhybrids auf eine Temperatur erhöht werden, welche die entsprechenden Splitsondenhybride oder ein entsprechendes Hybrid, in welchem nur eine der nachweisbaren, ersten Nucleotidsonde und zweiten Nucleotidsonden an die Targetbasensequenz hybridisiert ist, denaturiert. Das gebundene Sondenhybrid, welches die komplementäre Targetbasensequenz einschließt, bleibt intakt. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ermöglicht daher die Diskriminierung einer Basensequenz, welche der nachweisbaren Sondensequenz perfekt komplementär ist, von alternativen Sequenzen.
- Es sei darauf hingewiesen, daß, obwohl die zuvorgenannte Ausführungsform der Erfindung am brauchbarsten ist, um Oligonucleotide an spezifische Hybridisierungsplätze in komplexen Genomen zu richten, um beispielsweise die Anwesenheit von Punktmutationen zu analysieren, sie ebenfalls für die Analyse von anderen Variationen in komplexen Genomen wie Translokationen ist. Zur Analyse von Translokationen wird es bevorzugt, daß das nicht-nachweisbare, zweite Polynucleotid einer Splitsonde ein Glied eines Bindungspaares aufweist, das hiermit verbunden ist und angenommene Sequenzen benachbart an potentielle Translokationsbruchpunkte hybridisiert. Die nachweisbare Sonde bevorzugt eine Länge von mehreren Kilobasen und überspannt einen Bereich von potentiellen Translokationsbruchpunkten. Quantitative Bindung von Polynucleotiden, welche die Splitsonde umfassen, im Anschluß an die Hybridisierung tritt nur auf, wenn der Genombereich aneinanderstoßend und durch Translokationen nicht unterbrochen ist. Das Auftreten einer Translokation schließt einen Teil der nachweisbaren Sonde von der Bindung an das nicht-nachweisbare Polynucleotid aus. Bei nachfolgender Denaturierung von hybridisiertem Polynucleotid und Zuführung des anderen Gliedes des Bindungspaares wird ein Teil des nachweisbaren Polynucleotids dann nicht als assoziiert mit dem mit dem anderen Glied des Bindungspaares komplexierten Polynucleotid gefunden. Das Bindungspaar umfaßt bevorzugt einen Antigen-Antikörper oder eine Biotin-Avidin-Wechselwirkung, wodurch beispielsweise denaturierte Hybride durch eine feste Phase, welche mit einem Glied des Bindungspaares komplexiert ist, geführt werden, und das Eluat auf Anwesenheit der nachweisbaren Sonde analysiert wird.
- So wird gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ein Verfahren zur Analyse von Translokationen in einer Targetbasensequenz, z. B. einem komplexen Genom, bereitgestellt, in welchem die nachweisbare, erste Nucleotidsonde zur Hybridisierung über einen Bereich von potentieller/potentiellen Translokation/en angepaßt ist, und die nicht-nachweisbare, zweite Nucleotidsonde ausgelegt ist, an die dieser/diesen potentieller/en Translokation/en benachbarten Sequenzen zu hybridisieren, wobei die nicht-nachweisbare, zweite Nucleotidsonde ein Glied eines Bindungspaares trägt und wobei das Verfahren die Bildung eines Splitsondenhybrids umfaßt, welches der Bindung unter Bildung eines gebundenen Sondenhybrids unterworfen wird, und wobei dieses Hybrid dann denaturiert wird.
- Bei einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren, wie es zuvor definiert wurde, bereitgestellt, bei welchem jede der nachweisbaren, ersten Nucleotidsonde und der zweiten Nucleotidsonde eine solche Einheit tragen, daß nach Hybridbildung, und, falls angezeigt, Denaturierung sein Signal nur nachweisbar ist, falls eine Nucleotidsequenz erhalten wird, welche sowohl die an die nachweisbare, erste Nucleotidsonde gebundene Einheit als auch die an die zweite Nucleotidsonde gebundene Einheit trägt.
- Die Nucleotidsonden können beispielsweise Oligonucleotidsonden sein.
- Das Verfahren dieser Ausführungsform könnte beispielsweise unter Verwendung von Transferarbeitsweisen ohne radioaktive Energie (siehe beispielsweise europäische Patentveröffentlichung No. 70685 von Standard Oil Co.) oder von Enzymkanalarbeitsweisen (siehe beispielsweise europäische Patentveröffentlichung No. 95087 von Syva Co.) durchgeführt werden. So kann diese Ausführungsform einen homogenen Assay für eine spezifische Targetnucleotidsequenz bereitstellen.
- Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Diskriminierung zwischen alternativen Nucleotidsequenzen bereitgestellt, bei welchem eine Targetsequenz der Hybridisierung mit mehr als zwei Oligonucleotidsonden derart unterzogen wird, daß bei Vorliegen einer komplementären Targetsequenz ein Splitsondenhybrid erhalten wird, wobei die nachweisbare, erste Nucleotidsonde eine endständige Oligonucleotidsonde ist, welche nachweisbar ist, und die zweite Nucleotidsonde die andere endständige Oligonucleotidsonde ist, welche hieran gebunden ein Glied eines Bindungspaares aufweist, und wobei individuelle andere Oligonucleotidsonde/n separat, jedoch benachbart zu einer angrenzenden Targetsequenz zwischen diesen endständigen Oligonucleotidsonden hybridisiert wird, und wobei das erhaltene Hybrid dann der selektiven Denaturierung unterworfen wird, wodurch eine beliebige an die Targetsequenz über einen Basenpaarfehler hybridisierte Oligonucleotidsonde denaturiert wird und die individuellen Oligonucleotidsonden miteinander verbunden werden, um die nachweisbare Oligonucleotidsonde an die Oligonucleotidsonde, welche ein Glied eines hieran gebundenen Bindungspaares aufweist, unter Bildung eines gebundenen Sondenhybrids zu verbinden, welches dann denaturiert und mit dem anderen Glied des Bindungspaares kontaktiert wird, wodurch die nachweisbare, gebundene Sondennucleotidsequenz einschließlich dieses Bindungspaares von anderen Nucleotidsequenzen getrennt werden kann. So hat ein endständiges Oligonucleotid (hybridisierend angrenzend an eine Serie von anderen Oligonucleotiden) beispielsweise hieran eine nachweisbare, signalgebende Einheit gebunden, während das andere endständige Oligonucleotid eine Einheit gebunden aufweist, welche Teil eines Bindungspaares bildet, wobei die Einheit zur Ermöglichung der Gewinnung des Oligonucleotids in Lösung aus einer andere Nucleotidsequenzen enthaltenden Mischung effektiv ist. Benachbart hybridisierte Oligonucleotide werden miteinander durch geeignete Behandlung gebunden, um in effektiver Weise die signalgebenden und bindenden Einheiten über eine gebundene Sonde zu verbinden, falls kein Oligonucleotidhybrid vor der Bindung denaturiert wird. Der Verlust irgendeines individuellen Oligonucleotidhybrids ergibt das anschließende Versagen des Miteinanderverbindens der signalgebenden und bindenden Einheiten. Das gebundene Sondenhybrid wird denaturiert und mit dem anderen Glied des Bindungspaares kontaktiert, welches ein endständiges Oligonucleotid in der gebundenen Probe erkennt. Die gebundene Probe kann daher, falls gewünscht, von anderen Nucleotiden in der Mischung abgetrennt und dann auf Anwesenheit der nachweisbaren Einheit analysiert werden.
- Auf diese Weise ist die Assoziierung des bindenden Oligonucleotids mit dem signalgebenden Oligonucleotid von der Anwesenheit, bei der Bindung von aneinanderstoßenden hybridisierten Oligonucleotiden, von allen angrenzenden Oligonucleotiden zwischen dem hybridisierten, signalgebenden Oligonucleotid und dem bindenden Olgionucleotid abhängig. Das Bindungspaar, welches die Trennung der gebundenen Sonde mit einer assoziierten, bindenden Einheit bewirkt, kann Avidin und Biotin oder ein Antigen und assoziierter, spezifischer Antikörper sein. Diese Ausführungsform ist für die Analyse von längeren Aneinanderreihungen von Targetnucleotidsequenz als für lediglich zwei angrenzend hybridiserende gebundene Sonden oder Splitsonden wie bei den anderen Ausführungsformen geeignet.
- Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt die Hybridisierung der nachweisbaren, ersten Nucleotidsonde und der zweiten Nucleotidsonde an jeder Seite einer potentiellen Varianzsequenz in einer Targetsequenz und den anschließenden Versuch zur Bindung dieser Sonden, bevorzugt unter Verwendung von DNA-Polymerase unter Einführung von Nucleotid/en komplementär zu entweder der normalen oder der erwarteten Varianzsequenz und Ligation, gefolgt von dem Nachweis irgendeines erhaltenen Hybrids. Ein solcher Nachweis kann beispielsweise dadurch herbeigeführt werden, daß irgendein erhaltenes Hybrid der selektiven Denaturierung unterworfen wird, wodurch irgendein vorhandenes Hybrid, in welchem die Bindung der nachweisbaren, ersten Nucleotidsonde an die zweite Nucleotidsonde nicht bewirkt wurde, denaturiert wird.
- Die eingesetzte DNA-Polymerase kann beispielsweise das Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I oder DNA-Polymerasealpha von Kalbsthymus sein. Die Ligation wird bevorzugt mit DNA-Ligase herbeigeführt. Die nachweisbare, erste Nucleotidsonde und die zweite Nucleotidsonde sind bevorzugt derart, daß sie an die Targetsequenz hybridisieren, wodurch eine Lücke von einem einzelnen Nucleotid zwischen diesen Sonden belassen wird.
- Falls die Nucleotidsonde ein Signal oder einen zur Erzeugung eines Signals fähigen Rest tragen soll, können solche Signale oder Reste an sich bekannte sein, z. B. eine radioaktive Markierung.
- Der Rest, welcher zur Erzeugung eines nicht-radioisotopischen Signals fähig ist, kann alternativ einen signalgebenden Teil, normalerweise getrennt von dem Oligonucleotid durch eine Spacergruppe umfassen. Diese Spacergruppe kann gewünschtenfalls an den signalgebenden Teil des Komplexes über eine direkte kovalente Bindung oder eine Protein-Liganden- oder eine Antigen-Antikörper-Wechselwirkung gebunden sein, beispielsweise eine Avidin-Biotin- oder Dinitrophenyl- Antidinitrophenyl-Antikörper-Wechselwirkung. Es sei darauf hingewiesen, daß der signalgebende Teil des Restes selbst zur Signalgebung in der Lage sein kann, oder in der Lage sein kann, ein Signal durch Wechselwirkung mit einem geeigneten Agens entsprechend den an sich bekannten Methoden zu erzeugen. So schließt beispielsweise ein bevorzugter, signalgebender Teil des kovalent gebundenen Restes ein System zur Erzeugung einer enzymatisch aktivierten Bildung einer Farbänderung ein. Bevorzugte Enzymsysteme schließen alkalische Phosphatase, saure Phosphatase, beta-Galactosidase, Luciferase oder Meerettich-Peroxidase ein. Solche Enzymsysteme sind selbst nicht zur Signalgebung in der Lage, jedoch sind sie zur Erzeugung eines Signals in Anwesenheit eines geeigneten Substrats entsprechend den per se bekannten Methoden fähig. Der signalgebende Teil des kovalent gebundenen Restes kann nach einer beliebigen konventionellen Technik wie beispielsweise durch Lumineszenz, Fluoreszenz oder mittels Färbung arbeiten.
- Bei der Anwendung ist es im allgemeinen für die Nucleinsäuresonde erforderlich, kleinste Mengen der voll komplementären Oligonucleotidsequenz nachzuweisen. Unter solchen Umständen kann es vorteilhaft sein, innerhalb der Sonde ein Mittel zur Verstärkung des Signals einzubauen. Die Verstärkung kann nach bekannten Techniken erreicht werden, beispielsweise unter Verwendung von einem oder mehreren der in den europäischen Patentveröffentlichungen 27036 (Self), 49606 (Self), 58539 (Self) und 60123 (Self) beschriebenen Systemen.
- Gemäß einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung werden Splitsondenhybride geliefert, welche eine nachweisbare, erste Nucleotidsonde und eine zweite Nucleotidsonde, hybridisiert an benachbarte Segmente einer Targetbasensequenz umfassen, wobei die erste, nachweisbare Nucleotidsonde zur Bindung an die zweite Nucleotidsonde in der Lage ist, wobei diese dadurch gekennzeichnet sind, daß die nachweisbare, erste Nucleotidsonde und/oder die zweite Nucleotidsonde an jeder Seite einer Varianzsequenz hybridisiert sind, die mit einem Krankheitszustand assoziiert ist, oder an die entsprechende Normalsequenz, oder daß sie an die Targetbasensequenz derart hybridisiert sind, daß eine Varianzbasensequenz, die mit einem Krankheitszustand hierin assoziiert ist, an dem endständigen Ende von einer dieser Sonden vorliegt, wobei das endständige Ende an die andere dieser Sonden anstößt, oder daß sie an die entsprechende Normalsequenz hybridisiert sind.
- Die Nicht-nucleotidyl-vernetzungsbindung kann beispielsweise eine Disulfidbindung oder eine Biotin-Avidinbindung sein.
- Wenigstens die erste Nucleotidsonde ist nachweisbar und trägt daher bevorzugt ein Signal oder einen zur Erzeugung eines Signals fähigen Rest, wie zuvor beschrieben.
- Um das Verfahren der vorliegenden Erfindung in konventioneller Weise durchführen zu können, ist es im allgemeinen vorteilhaft, die Nucleotidsonden in einem Kit bzw. Satz einzugeben, und dieses Kit wird daher als weiteres Merkmal der Erfindung angesehen.
- So wird gemäß einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung ein Kit bzw. ein Satz zur Diskriminierung zwischen alternativen Nucleotidsequenzen bereitgestellt, welches/welcher eine nachweisbare, erste Nucleotidsonde und eine zweite Nucleotidsonde umfaßt, wobei jede Sonde eine an angrenzende Segmente einer Targetsequenz homologe Nucleotidsequenz aufweist, wobei eine potentielle Varianzsequenz in einem dieser Segmente oder dazwischen vorhanden ist, wobei die nachweisbare, erste Nucleotidsonde und/oder die zweite Nucleotidsonde derart sind, daß eine potentielle Varianzsequenz an dem endständigen Ende von einer dieser Sonden vorliegt, wobei dieses endständige Ende anstoßend an die andere dieser Sonden ist, oder die potentielle Varianzsequenz zwischen diesen Sonden vorhanden ist, wobei das Kit zusätzlich ein Reagens (Reagentien) zum Verbinden dieser Sonden enthält, falls die Sonden nicht so gebunden sind.
- Die potentielle Varianzsequenz ist üblicherweise eine Punktmutation, welche mit einem Krankheitszustand assoziiert ist. In einem solchen Fall enthält das Kit bevorzugt eine nachweisbare, erste Nucleotidsonde und eine zweite Nucleotidsonde zum Nachweis einer Punktmutation, welche mit einem Krankheitszustand verbunden ist, wie auch eine nachweisbare, erste Nucleotidsonde und eine zweite Nucleotidsonde zum Nachweis der entsprechenden Normalsequenz, in welcher die Punktmutation fehlt.
- In diesem Zusammenhang wird anerkannt, daß bestimmte Krankheitszustände durch Punktmutationen charakterisiert sind, welche in verschiedenen Bereichen des menschlichen DNA-Genoms auftreten. In einem solchen Fall wäre die Bestimmung wesentlich, daß jede relevante Punktmutation vorhanden oder nicht vorhanden war, und so würden mehr als ein Set von Sonden (wenigstens nachweisbare, erste Nucleotidsonde und zweite Nucleotidsonde) verwendet werden, ein Sondenset zum Nachweis der Anwesenheit oder des Fehlens von jeder Punktmutation. Ebenfalls wäre es vorteilhaft, in das Kit ein Set oder mehrere Sets von Sonden für die entsprechende Normal- oder Varianzsequenz einzuschließen.
- Das Kit enthält weiterhin vorteilhafterweise Mittel zur Extraktion von DNA und/oder Mittel zur Immobilisierung von DNA auf einem testen Träger.
- Gewünschtenfalls kann wenigstens eine der nachweisbaren, ersten Nucleotidsonde und der zweiten Nucleotidsonde ein Glied eines Bindungspaares tragen, wobei das andere Glied des Bindungspaares beispielsweise auf einem mit dem Kit gelieferten festen Träger vorliegt.
- Das Kit umfaßt weiterhin geeignete Pufferlösungen und/oder Waschlösungen und enthält geschriebene oder gedruckte Instruktionen zur Benutzung des Kits entsprechend dem Verfahren der vorliegenden Erfindung.
- Mit Bezug auf die Zeichnung gilt:
- Fig. 1, 2 und 3 sind Autoradiographien, in denen I die DNA-Sequenz von menschlichem Interferon-alpha&sub2; in dem Plasmid pIFS1101, wie in Edge et al., Nucleic Acids Research Vol. 11 (1983), S. 6419 bis S. 6435, angegeben, darstellt und K die DNA-Sequenz wiedergibt, welche für das Interferonalpha&sub2;-analoge [Ala²&sup8;]IFN-alpha&sub2; codiert, in welchem das Codon TCC durch GCT ersetzt ist. Diese analoge Basensequenz wird hier als pK9 bezeichnet.
- Fig. 4 ist eine Autoradiographie, in welcher die Spur M ein Signal zeigt, das einer Oligonucleotidmarkerbande mit einer Länge von 32 Basen entspricht, die Spur 1 ein Signal zeigt, welches einem Ligationsprodukt mit einer Länge von 32 Basen entspricht, abstammend von Oligonucleotiden 11(-1) und 13 (siehe später), jedes mit einem einzelnen dCTP-Rest, inkorporiert an seinem 3'-Ende. Die Spuren 2 bis 5 zeigten überhaupt kein Signal, das einem Oligonucleotid mit einer Länge von 32 Basen entspricht.
- Fig. 5 zeigt eine Autoradiographie von Aliquoten von Ligasereaktionsmischungen, enthaltend 5' OH trp 3, 5' OH trp 4, 5' ³²P CRN1 und 5' ³²P CRN2, ausgetragen zwischen 0 und 40ºC, wobei diese Inkubationstemperaturen im Oberteil der Autoradiographie erscheinen. O- ist eine No-Enzymkontrolle. BPB zeigt die Stellung des Markierungsfarbstoffes Bromphenolblau.
- Fig. 6 zeigt eine Autoradiographie von Aliquoten von Ligasereaktionsmischungen, enthaltend 5' OH trp 3, 5' OH trp 4, 5' ³²P CRN1 und 5' ³²P CRN4C, ausgetragen zwischen 0 und 40ºC, wobei diese Inkubationstemperaturen im Oberteil der Autoradiographie erscheinen. O- ist eine No-Enzymkontrolle. BPB zeigt die Stellung des Markierungsfarbstoffes Bromphenolblau an.
- Fig. 7 zeigt eine Autoradiographie von Aliquoten von Ligasereaktionsmischungen, enthaltend 5' OH trp 3, 5' OH trp 4, 5' ³²P CRN1 und 5' ³²P CRN6C, ausgetragen zwischen 0 und 40ºC, wobei diese Inkubationstemperaturen im Oberteil der Autoradiographie erscheinen. O- ist eine No-Enzymkontrolle. BPG zeigt die Stellung des Markierungsfarbstoffes Bromphenolblau.
- Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert, jedoch nicht beschränkt. In den Beispielen sind die Lösungen, falls nichts anderes angegeben ist, wäßrig und die %-Werte sind Gew.-/Vol.
- Die Konstitution der verschiedenen Reagentien ist wie folgt
- SSC ist 0,15M NaCl+0,015M Natriumcitrat;
- Kinasepuffer ist 0,066M Tris.HCl pH 7,6, 1mM Spermidin, 0,01M MgCl&sub2;, 15mM Dithiothreit und 0,2 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA);
- 10·Core-Puffer ist 500 mM Tris HCl pH 8, 100 mM MgCl&sub2;, 500 mM NaCl;
- 10·Nick-Translationspuffer ist 0,5 M Tris.HCl (pH7,2), 0,1 M MgSO&sub4;, 1mM Dithiothreit und 500 ug/ml BSA (Pentax, Fraktion V);
- Triton® -X-100 ist eine grenzflächenaktive Polyoxyethylenetherverbindung;
- Ficoll ist ein nicht-ionisches, synthetisches Polymeres von Saccharose mit einem Molekulargewicht von annähernd 400.000 in dialysierter und lyophilisierter Form;
- Nonidet P-40 ist ein Octylphenolethylenoxidkondensat, enthaltend einen Durchschnitt von 9 Mol Ethylenoxid pro Molekül;
- Denhardt's Reagens ist 0,2 g/l Ficol 400.000; 0,2 g/l, Polyvinylpyrrolidon (PVP) und 0,2 g/l Rinderalbumin (BA);
- PBS - (phosphatgepufferte Salzlösung) ist 0,01M Natriumphosphat pH 7,4 und 0,13M NaCl;
- SSPE ist 10 mM Natriumphosphat pH 7, 0,18M NaCl und 1 mM EDTA.
- Die folgenden Abkürzungen werden benutzt:
- DNA Deoxyribonucleinsäure
- tRNA Transferribonucleinsäure
- EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
- PBS phosphatgepufferte Salzlösung
- SDS Natriumdodecylsulfat
- 2·SSC doppelte Konzentration von SSC
- 6·SSC sechsfache Konzentration von SSC
- 20·SSC zwanzigfache Konzentration von SSC
- BSA Rinderserumalbumin
- BA Rinderalbumin
- PVP Polyvinylpyrrolidon
- Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan
- 10·Core-Puffer zehnfaches der Konzentration von Core-Puffer
- ATP Adenosintriphosphat
- NP40 Nonidet P.40
- 10·Nick-Translations-Puffer zehnfache Konzentration von Nick-Translationspuffer.
- Die folgenden Bezeichnungen sind Warenzeichen:
- Minifold
- Triton-X- 100
- CORE-BUFFER (Core-Puffer)
- Ficoll.
- Für Oligonucleotidhybridisierungsanalyse benutzte Plasmide waren pIFS1101 (Edge et al., Nucleic Acids Research, Vol. 11, (1983), S. 6419 bis 6435) und ein Derivat hiervon, bezeichnet hier als pK9, in welchen das für Alanin codierende Codon GCT bei der Aminosäurestellung 28 anstelle des Codons TCC, welches für Serin in HuIFN-alpha&sub2; codiert, vorliegt. Aliquote von 1 ug, 100 ng und 10 ng wurden auf 153 ul in Wasser verdünnt. Hierzu wurden 30 ul 2M NaOH, 17 ul 1M Tris.HCl pH7,4 und 100 ul 20·SSC (SSC ist 0,15M NaCl, 0,015M Natriumcitrat) gegeben. Die Proben wurden auf 100ºC für 10 min erhitzt, dann auf Eis angeordnet und es wurden 70 ul 1M Tris.HCl pH 7 zugesetzt. Verdünnungen von Plasmid-DNA wurden auf BA 85 Nitrocellulosefiltern (Schleicher und Schuell, Keene, N.H., USA) unter Verwendung einer Schleicher und Schuell Minifold II Apparatur gemäß den Angaben des Herstellers filtriert. Das Nitrocellulosepapier wurde geschnitten, damit es in die Minifold-Apparatur paßte, und durch Aufschwimmen auf 2·SSC vor dem Montieren in der Apparatur benetzt. DNA-Proben wurden dann auf die Bohrungen aufgegeben und mit einer Geschwindigkeit von annähernd 0,5 ml pro min filtriert. Die Nitrocellulose wurde dann an Luft für 10 min getrocknet und bei 80ºC für 2 h in Vakuum erhitzt. Die Oligonucleotide 11 und 13 (Edge et al., siehe oben), entsprechend der Sequenz des synthetischen Interferon-alpha&sub2;-gens in PiFS1101 wurden für die Hybridisierung verwendet. Oligonucleotide 11 und 13 haben die folgenden DNA-Sequenzen:
- Oligonucleotid 11 5' CGTATCTCCCTGTTC 3'
- Oligonucleotid 13 5' TCCTGTCTGAAAGAC 3'.
- Oligonucleotid 13 wurde mit ³²P wie folgt markiert: zu 400 ng Oligonucleotid in 18,5 ul H&sub2;O wurden 20 ul ³²P-gamma- ATP (Adenosin-5'-[³²P]-triphosphat, Triethylammoniumsalz in wäßriger Lösung, annähernd 3000 Ci/nMol, 10 uCi/ul, Amersham International), 4,5 ul 10·Kinasepuffer (10·Puffer = 0,66M Tris.HCl pH7,6, 10mM Spermidin, 0,1M MgCl&sub2;, 150nM Dithiothreit und 2 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA, Nucleic Acid Enzyme Grade, Bethesda Research Laboratories)) und 2 ul T4 Polynucleotidkinase (5 Einheiten/ul, Boehringer Mannheim) zugesetzt. Nach 1 h bei 37ºC wurde die Hälfte der Probe auf eine 4 ml Säule von Biogel P2 (Biorad, vorher ins Gleichgewicht gesetzt mit 10mM Tris.HCl pH8, 1mM EDTA) aufgegeben. Das mit ³²P markierte Nucleotid wurde in das Leervolumen des Elutionspuffers, welcher 10 mM Tris.HCl pH 8, 1 mM EDTA umfaßte, eluiert. 100 ng der mit ³²P markierten Oligonucleotidsonde wurde für die Hybridisierung zusammen mit 100 ng nichtmarkiertem Oligonucleotid 11 verwendet. Nitrocellulosefilter, auf welchen pIFS1101 oder pK9 DNA immobilisiert worden waren, wurden für 2 h bei 68ºC in 5·Denhardt's Reagens (1 g/l Ficoll, 1 g/l Polyvinylpyrrolidon, 1 g/l BA (Rinderalbumin, Fraktion V, Miles Laboratories), 5·SSC, 50mM Natriumphosphat pH 7, 1% Glycin, 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 100 ug schallbehandeltem, denaturierten Heringsperma-DNA (Sigma) vorhybridisiert. Die Hybridisierungen wurden in 2 ml 5·SSC, 0,5% NP40 (BDH) und 250 ug/ml tRNA (Sigma, Typ X-S) mit 100 ng entweder zusammen zugesetzten Oligonucleotiden 11 und 13 oder, als Kontrolle, 100 ng alleine zugesetztem Oligonucleotid 13 durchgeführt. Die Hybridisierungen wurden über Nacht bei Zimmertemperatur durchgeführt. Die Filter wurden dann in 6·SSC, 0,06% Natriumpyrophosphat und 20mM Natriumphosphatpuffer, pH 7 für 5 min bei Zimmertemperatur gewaschen, und nach Auswechseln des Waschpuffers für weitere 3 min bei Zimmertemperatur. Die Filter wurden dann mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS; 0,01M Natriumphosphat pH 7,4, 0,13M Nacl), welche 2% BA und 0,1% Triton-X-100 (BDH) enthielt, für 30 min bei 16ºC behandelt. Die Filter wurden dann fünfmal mit PBS und 2% BA zur Entfernung des Triton-X-100 gespült. Zur Vernetzung von hybridisierten Sonden wurden die Filter mit 66mM Tris.HCl pH 7,6, 5mM MgCl&sub2;, 5mM Dithiothreit, ImM ATP, 500 ug/ml BSA und 0,3 E/ul T4 DNA-Ligase (Boehringer, 5 E/ul) behandelt. Die Inkubation erfolgte für 80 min bei 16ºC. Die Filter wurden dann bei 60ºC für 20 min in 6·SSC, 0,06% Natriumpyrophosphat und 20mM Natriumphosphat pH 7 gewaschen. Die Filter wurden dann in einer Saranhülle eingepackt und dem autoradiographischen Film für 2 Tage exponiert. Fig. 1 zeigt, daß nach der abschließenden Waschung bei 60ºC ein annehmbares autoradiographisches Signal nur für das Plasmid pIFS1101 (I) beobachtet wurde, wo die hybridisierten Oligonucleotide 11 und 13 durch Ligation vernetzt worden waren. Ein Hintergrundsignal, entsprechend immobilisiertem pK9 (K) wurde nach Hybridisierung und Vernetzung der Oligonucleotide 11 und 13 beobachtet. Dieses Hintergrundsignal bildete etwa 1% des entsprechenden Signals, erhalten für pIFS1101 und rührte von der minimalen Hybridisierung von Oligonucleotid 13 als Folge von Hybridfehlern mit dem entsprechenden Bereich des Plasmids pK9 her. Daher wurde durch dieses Beispiel gezeigt, daß benachbarte, hybridisierte Oligonucleotidsonden sich effizient durch Ligation auf Nitrocellulosefiltern vernetzen. Darüber hinaus konnte unter den angegebenen Versuchsbedingungen die Ligationszeit auf 5 min ohne irgendeinen Intensitätsverlust des autoradiographischen Signals reduziert werden.
- DNA mit hohem Molekulargewicht wurde aus der Lymphoblastoid Linie Daudi unter Verwendung der Methode von Blin und Stafford (Nucleic Acids Research, Vol. 3 (1976), S. 2303) isoliert. 200 ug Daudi-DNA wurde in 320 ul H&sub2;O verdünnt, hierzu wurden 40ul 10·CORE-PUFFER (Bethesda Research Laboratories) und 40 ul EcoRI (50 Einheiten/ul Northumbria Biologicals, Cramlington, Northumberland, UK) zugesetzt. Im Anschluß an Inkubation bei 37ºC für 3 h wurde die Lösung mit einem gleichen Volumen von Phenol/Chloroform (1 : 1), dann mit 1 Volumen Chloroform und abschließend dreimal mit 1 Volumen H&sub2;O-gesättigtem Ether extrahiert. Die DNA wurde auf 0,3M Natriumacetat eingestellt und mit 2 Volumina eiskaltem Ethanol ausgefällt. Das DNA-Pellet wurde in kaltem 70%igem Ethanol gewaschen, und das Pellet wurde getrocknet und in 100 ul H&sub2;O wieder aufgelöst.
- 3 ug der Plasmide pIFS1101 und pK9 (siehe Beispiel 1) wurden in 17 ul H&sub2;O aufgelöst, hierzu wurden 2 ul 10·CORE- PUFFER und 1 ul EcoR1 (siehe oben) zugesetzt. Das Gemisch wurde für 3 h bei 37ºC inkubiert, hieran schlossen sich Lösungsmittelextraktionen und Ausfällungen mit EtOH an, wie für die Daudi-DNA zuvor. Die getrockneten Pellets wurden in 10 ul H&sub2;O wieder aufgelöst.
- 10 ug mit EcoR1 verdaute Daudi-DNA wurde mit 1 ng gleichen Teilen von entweder piFS1101 oder pK9 vermischt und der Gelelektrophorese auf einem waagerechten 0,5%igen Agarosegel, wie in Maniatias et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual: Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) beschrieben, unterworfen. Im Anschluß an die Elektrophorese wurde DNA entweder auf Nitrocellulosefilter nach der Southern-Transfermethode (Maniatis et al) für die anschließende Hybridisierung übertragen, oder, alternativ, DNA wurde direkt mit getrockneten Agarosegelen, hergestellt wie von Studencki und Wallace (DNA, Vol. 3, S. 7 bis 15 (1984)) beschrieben, den Sonden ausgesetzt. Für auf Nitrocellulosefilter übertragene DNA erfolgte die Hybridisierung so, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit der Ausnahme, daß die Hybridisierungstemperatur 32ºC betrug, unter Verwendung von 100 ng Oligonucleotid 11 und 100 ng mit ³²P markiertem Oligonucleotid 13 als Sonden. Die Filter wurden für 30 min bei Zimmertemperatur in 5·SSC, 0,06% Natriumpyrophosphat und 20mM Natriumphosphat pH 7 und dann bei 40ºC für 15 min gewaschen, um das meiste des mit ³²P markiertem Oligonucleotid, das mit der pK9 Plasmid-DNA assoziiert war, zu entfernen. Die Filter wurden dann bei -70ºC einem Kodak® X-Omat AR Film unter Verwendung von Verstärkerfolien exponiert. Nach dieser Waschung bei 40ºC war ein Hintergrundsignal, herrührend von Hybridisierung an Daudi-Zellen-DNA noch sichtbar, wie in Fig. 2 gezeigt.
- Getrocknete Agarosegele wurden direkt mit 100 ng von beiden Oligonucleotiden 11 und mit ³²P markiertem 13 in 50 mM Natriumsphosphat pH 7, 0,9 M NaCl, 5 mM EDTA, 0,3% SDS und 10 ug/ml E.coli-DNA bei 32ºC über Nacht hybridisiert. Die getrockneten Gele wurden anschließend in 2·SSPE (SSPE ist 10mM Natriumphosphat pH 7, 0,18M NaCl, 1 mM EDTA) und 0,1% SDS bei Zimmertemperatur für 30 min und dann bei 40ºC für 15 min in demselben Waschpuffer gewaschen. Das Ergebnis war dem auf Nitrocellulosefiltern (Fig. 2) beobachteten Ergebnis vergleichbar. Um den Hintergrund als Folge der Hybridisierung an Daudi-Zellen-DNA zu entfernen, wurden Oligonucleotide 11 und 13, welche an DNA, immobilisiert entweder in Nitrocellulose oder getrockneten Gelen, hybridisierten, durch Ligation vernetzt, wie in Beispiel 1 beschrieben, und abschließend bei 60ºC für 15 min wie zuvor gewaschen. Dies ergab eine einzelne Bande, entsprechend 1 ng Plasmid plFS1101 mit geringem feststellbarem Hintergrund und mit keinem sichtbaren, pK9-DNA entsprechendem Signal, wie in Fig. 3 für auf Nitrocellulose immobilisierte DNA gezeigt ist.
- Die zur Analyse eingesetzte Plasmid-DNA war pIFS1101 (Edge et al., Nucleic Acids Research, Vol. 11 (1983), S. 6419 bis 6435). 2 ug pIFS1101-Plasmid-DNA wurde mit EcoRI (20 Einheiten, Bethesda Research Laboratories) in einem Reaktionsvolumen von 20 ul für 2 h unter Anwendung der von dem Enzymlieferanten empfohlenen Bedingungen verdaut. Die Reaktionsmischung wurde einmal mit Phenol:Chloroform (1 : 1) und einmal mit Chloroform extrahiert, bevor 2 ul 3M Natriumacetat pH 5,2 und 45 ul Ethanol zugesetzt wurden. Die DNA wurde bei -20ºC über Nacht ausgefällt, in 70%igem EtOH gewaschen und getrocknet, bevor sie in 30 ul H&sub2;O resuspendiert wurde.
- Die zur Analyse eingesetzten Oligonucleotide wurden mit 11(-1) und 13 bezeichnet, falls Oligonucleotid 13 zur Konstruktion an dem synthetischen Interferon-alpha&sub2;-gen in pIFS1101 verwendet wurde, und Oligonucleotid 11(-1) ist ein Derivat von Oligonucleotid 11, verwendet zur Genkonstruktion mit einer um 1 Base verschobenen 5'-Sequenz.
- Daher war die Sequenz der Oligonucleotide wie folgt
- Oligonucleotid 11(-1) 5'CCGTATCTCCCTGTT3'
- Oligonucleotid 13 5'TCCTGTCTGAAAGAC3'.
- Das Oligonucleotid 13 wurde am 5'-Ende mit ³²P unter Verwendung von Polynucleotidkinase markiert, wie für synthetische Linker (Vorwärtsreaktion) in Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Editors: Maniatis, Fritsch und Janbrook, Cold Spring Harbor) beschrieben. Die Kinasereaktion wurde durch Erhitzen auf 70ºC für 10 min abgestoppt, gefolgt von 2 aufeinanderfolgenden Phenolextraktionen. Die Lösung wurde dann mit Ether extrahiert, und überschüssiger Ether wurde abgeblasen.
- Gleiche Teile von 4 ul von mit EcoRI verdauter pIFS1101-DNA wurden zu gleichen Teilen von 50 ul einer Lösung von 10·SSC, 1% NP40 und 0,5 ug/ml tRNA zugesetzt. Gleiche Teile von 1 pMol mit ³²P markiertem Oligonucleotid 13, entweder mit oder ohne 1 pMol von Oligonucleotid 11(-1), wurden zugesetzt, und die Lösungen wurden auf 100 ul mit Wasser verdünnt. Die Lösungen wurden auf 100ºC für 5 min erhitzt und dann in einem Wasserbad bei 39ºC für 2 h angeordnet, damit die Oligonucleotide an die Target-pIFS1101-DNA hybridisiert wurden.
- DNA-Proben wurden in 10 ul H&sub2;O, zu welchem 1 ul entweder 2nM dCTP oder 2nM dGTP (PL Biochemicals) zugesetzt worden waren, aufgelöst. Dann wurden 2,5 ul 10·Nick-Translationspuffer (siehe Molecular Cloning, A Laboratory Manual, zuvor zitiert) 10·Puffer ist 0,5 M Tris.HCl (pH 7,2), 0,1M MgSO&sub4; 1 mM Dithiothreit und 500 ug/ml BSA (Pentax, Fraktion V) zugesetzt, und die Lösungen wurden mit Wasser auf 25 ul verdünnt. 2 Einheiten des Klenow-Fragmentes von DNA-Polymerase I (Boehringer) wurden zugesetzt, und die Lösungen wurden bei Zimmertemperatur für 30 min inkubiert. 1,5 ul 10·Nick-Translationspuffer wurde zusammen mit 4 ul 10 mM ATP und 7,5 ul H&sub2;O zugegeben. 2 Einheiten T4-DNA-Ligase (Bethesda Research Laboratories) wurden zugesetzt, und die Lösungen wurden bei 14ºC für 4 h inkubiert.
- 2 ul der Reaktionsmischungen wurden auf einem 8%igen nativen Polyacrylamidgel analysiert. Vor dem Aufladen wurden die Proben auf 100ºC für 5 min erhitzt und rasch auf Eis abgekühlt, bevor 1 ul Gelbeladungspuffer (0,25% Bromphenolblau, 0,25% Xylolcyanol und 15% Ficoll Typ 400) zugesetzt wurden. Fig. 4 zeigt die Ergebnisse dieser Gelanalyse. Ein autoradiographisches Signal, entsprechend einer Oligonucleotidmarkerbande von einer Länge von 32 Basen (Spur M) wurde nur in der Spur 1 beobachtet, wo die Polymerasereaktion dCTP vor der Ligasebehandlung einschloß. Andere Proben schlossen Polymerasebehandlung mit vorliegendem dCTP jedoch ohne Ligasebehandlung (Spur 2) oder ohne Oligonucleotid 11(-1) (Spur 5) ein. Der Einschluß von dGTP anstelle von dCTP in der Polymerasestufe entweder mit Ligasebehandlung (Spur 3) oder ohne Ligasebehandlung (Spur 4) ergab kein autoradiographisches Signal an der 32-Basen-Position.
- Diese Ergebnisse zeigen, daß die Bildung des Ligationsproduktes mit einer Basenlänge von 32, herrührend von Oligonucleotid 11(-1) und 13, den Einschluß des korrekten Deoxynucleotidtriphosphats (dCTP) zum Auffüllen in der Einbasenpaarlücke gegenüberliegend einem G-Rest zwischen den einzelnen hybridisierten Oligonucleotiden erfordert. Der Einschluß des nicht-korrekten Nucleotids (z. B. dGTP) oder, durch Inferenz, Substitution des G-Restes in der Lücke durch einen alternativen Rest schließt die Bildung des Ligationsproduktes mit einer Basenlänge von 32 aus. Daher stellt dies einen diagnostischen Test für die Anwesenheit oder das Fehlen eines spezifischen Nucleotids in einer Target-DNA-sequenz dar.
- Bei einer weiteren Belegung der Erfindung durch Beispiele wurde eine systematische Untersuchung hinsichtlich des Effektes von Fehlern auf die Ligation mit T4-DNA-Ligase über einem Bereich von Temperaturen durchgeführt. Jede mögliche Fehlermöglichkeit innerhalb eines Stranges einer Überlappung von sieben Basenpaaren wurde untersucht (Tabelle 1). Ligation von mit Fehler behafteten Oligonucleotiden wurde in Konkurrenzexperimenten bei Anwesenheit von äquimolaren Mengen des nicht mit Fehlern behafteten Oligonucleotids CRN 1 durchgeführt. Die Sequenzen entsprechen dem -35 Bereich des E. coli trp Promoters Windass, J D et al. Nucleic Acids Research 10, 6639-6657 (1982)). Alle Oligonucleotide in dieser Untersuchung wurden durch DNA-Sequenzierung charakterisiert (Maxam A M und Gilbert W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 560-564 (1988)). Ligationsprodukte wurden nach Trennung durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese durch Cerenkov-Auszählung der Radioaktivität in mutmaßlichen Produktbanden quantifiziert. In allen Fällen, wo ein mit Fehlern behaftetes Oligonucleotid bei Anwesenheit des vollständig komplementären Oligonucleotids CRN 1 ligatiert war, waren die Ausbeuten an mit Fehlern behaftetem, ligatiertem Produkt minimal bis zu einer Trennung der fehlerhaften Base von dem Ligationspunkt um 6 Basenpaare und bis die Temperatur der Ligationsreaktion in diesen Fällen weniger als 35ºC betrug. Tabelle 1
- Der den Fehler tragende Bereich ist der -35 Bereich des synthetischen E. Coli trp Promoters. In Konkurrenz mit CRN l zur Anelierung an die 5' Überlappung von trp 4 sind CRN2 (Kontrolle) und CRN3A an 6C. Diese Oligonucleotide bedecken alle möglichen Einbasenpaarfehler mit der trp 4 5' Überlappung.
- Oligonucleotide wurden nach der verbesserten Festphasen-Phosphotriestermethode (Gait, M J et al. (1980) Nucleic Acids Research 8, 1081-1096 und Markham, A F et al. (1980) Nucleic Acid Research 8, 5193-5205) synthetisiert und durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie anfänglich auf Parisil 10-SAX Anionenaustauschersäulen (Jones Chromatography, Glamorgan or Whatman Ltd.), dann auf C&sub1;&sub8; uBondapak Umkehrphasen-Säulen (Waters Associates Inc.), wie beschrieben (Newton, C R et al (1983) Anal. Biochem. 129, 22-30), gereinigt.
- Sequenzierung von 5' ³²P radiomarkierten Oligonucleotiden erfolgte wie von Maxam und Gilbert (Maxam, A M et al (1977) Proceeding of the National Academy of Sciences, USA 74, 560-564) für das Cytosin plus Thymin, Adenin und Guanosin größer als Adeninspaltungen beschrieben, und wie von Rubin und Schmid (Rubin, C M et al (1980) Nucleic Acids Research 8, 4613-4619) für die partielle, auf Cytosin spezifische Spaltung mit Hydroxylaminhydrochlorid beschrieben.
- T4-DNA-Ligase war das Produkt von Boehringer Mannheim GmbH, und die Definition der immer eingesetzten Einheit ist diejenige nach Weiss et al (Weiss, B et al (1968) Journal of Biological Chemistry 243, 4543-4555). Eine Einheit ist dabei die Enzymaktivität, welche bei 37ºC I: nMol ³²PPi in Noritabsorbierbares Material innerhalb 20 min austauscht. Ligasereaktionen wurden in 66 mM Tris-HCl (pH 7,6), 6,6 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreit und 0,4 mM ATP durchgeführt.
- T4-Polynucleotidkinase war ein Produkt von New England Biolabs, wobei die Definition der Einheit die Enzymaktivität ist, welche 1 nMol von säureunlöslichem ³²P in 30 min bei 37ºC erzeugt. Kinasereaktionen wurden durchgeführt in 50 mM Tris-HCl (pH 9,0), 10 mM MgCl&sub2;, 20 mM Dithiothreit, 0,1 mM Spermidin, 0,1 mM EDTA. Die ATP-Konzentration war in Abhängigkeit von der nachfolgenden Verwendung von phosphoryliertem Oligonucleotid variabel.
- Adenosin-5'-[γ-³²P]-triphosphat, Triethylammoniumsalz (³²P ATP) waren Produkte von Amersham International, 1 mCi pro ml in wäßrigem Ethanol mit einer spezifischen Aktivität von > 5000 Ci/mMol.
- Die Autoradiographie erfolgte bei Zimmertemperatur oder bei -70ºC unter Verwendung von Kodak XR-5 Film mit Ilford Schnell-Wolframverstärkungsfolien [Laskey, R A et al (1977) Febs Letters 82, 314-341].
- Elektrophorese erfolgte durch 20% Acrylamid (19,33% Acrylamid, 0,67% Bisacrylamid)-Gele, enthaltend 7M Harnstoff, 50 mM Tris-borat (pH 8,3) 1 mM EDTA, falls nichts anderes angegeben ist.
- Elektrophoreseproben wurden entweder resuspendiert oder verdünnt mit 80% Formamid, 10 mM NaOH, 1 mM EDTA, 0,1% Bromphenolblau. Vor der Elektrophorese wurden die Proben bei 100ºC für 2 min hitzedenaturiert, dann rasch auf Eis abgekühlt. Elektrophorese erfolgte über einen Potentialgradienten von 40V/cm, bis das Bromphenolblau 15 cm vom Ausgangspunkt gewandert war, falls nichts anderes angegeben ist.
- Mit ³²P markierte Oligonucleotide wurden durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese gereinigt, und DNA wurde aus den Gelen durch Elektroelution in Dialysebeutel, welche 10 mM Tris-borat (pH 8,3), 0,2 mM EDTA (1 ml) enthielten, bei einem Potentialgradienten von 16V/cm für 45 min, wonach die Polarität für 20 sec umgekehrt wurde, gewonnen. Elektroeluate wurden durch aufeinanderfolgende Butanolextraktionen in ein Volumen von annähernd 500 ul konzentriert, mit Phenol-Chloroform [gepuffert mit 0,5 M Tris-HCl (pH 7,5), dann mit Wasser extrahiert] (500 ul) extrahiert. Wäßrige Phasen wurden mit Ether (3·1 ml) extrahiert, weiter durch Butanolextraktion auf annähernd 20 ul konzentriert, im Vakuum getrocknet und mit Ethanol ausgefällt. Die Ethanolausfällung wurde durch Resuspendieren der DNA in 0,3 M Natriumacetat (pH 5,6, 250 ul), dann Zugabe und Mischen von Ethanol (800 ul), rasches Abkühlen auf -70ºC für 90 min oder länger mit anschließendem Zentrifugieren während 15 min in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge durchgeführt. Die Pellets wurden in Vakuum getrocknet, in Wasser (500 ul) resuspendiert.
- Cerenkov-Strahlung wurde unter Verwendung eines Flüssigszintillationszählers Intertechnique SL4000 mit einem on line-Drucker M1750 silent 700, bestimmt. Elektroeluate wurden in mit Silikon beschichtete 750 ml Mikrozentrifugengläser, angeordnet in 20 ul Standardzählbehältern aus Kunststoff (Packard) überführt. Die Proben wurden für 10 min an die Dunkelheit sich anpassen gelassen, dann wurde die Cerenkov-Strahlung durch Einstellen des Flüssigkeitsszintillations-Spektrometers auf Zählung für Tritium bestimmt. Banden aus Gelen wurden ausgeschnitten, direkt in den Zählgläsern aus Kunststoff angeordnet und die Cerenkov- Strahlung bestimmt, wie zuvor für Elektroeluate beschrieben. Das Unterdrücken der Cerenkov-Strahlung in Gelbanden relativ zu derselben Menge von ³²P-markiertem Oligonucleotid in Lösung konnte so stattfinden.
- Eine Gesamtzahl von 220 Konkurrenzreaktionen wurde durchgeführt. Jedes Fehler-Oligonucleotid von CRN2 (Sequenzkontrolle) wurde gegen CRN1 in einem DNA-Ligase-assay bei 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 und 40ºC konkurrieren gelassen. In jedem Fall wurde eine Kontrolle bei 0ºC ohne Enzym eingeschlossen. Alle Konkurrenzreaktionen wurden in einem Volumen von 60 ul und mit einem Gehalt von trp 4 (5,0 pMol), trp 3 (7,5 pMol), CRN1 (7,5 pMol) und dem konkurrierenden Oligonucleotid (7,5 pMol) durchgeführt. In molaren Konzentrationen betrug das Gesamt-Oligonucleotid 456,5 nM, trp 4 betrug 83 nM, trp 3, CRN 1 und Konkurrenzprodukt betrugen sämtlich 124,5 nM.
- Für jedes konkurrierende Oligonucleotid wurde eine "Konkurrenzmischung" hergestellt, welche Konkurrenzprodukt (75 pMol) und CRN1 (75 pMol) in wäßriger Lösung (390 ul) enthielt. Die Konkurrenzmischungen wurden in 10 gleiche Teile unterteilt. Beide Oligonucleotide waren 5'-phosphoryliert mit ³²P-ATP und Polynucleotidkinase. Sie wurden weiter durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese, Elektroelution und Ethanol-Ausfällung gereinigt, wie zuvor beschrieben. Andere Reaktionskomponenten wurden in einem "trp-Mix" kombiniert, welcher enthielt trp 3 (7,5 pMol), trp 4 (5,0 pMol) und IOX DNA-Ligasepuffer (6 ul) pro 20 ul.
- Für jede Temperatur, bei welcher die Konkurrenzreaktion untersucht wurde, wurde ein gleicher Teil jedes Konkurrenz- Mixund ein gleicher Teil des trp-Mix (200 ul) in jeden Konkurrenz-Mix überführt und für 30 min einer Vorinkubation unterzogen. Weiterhin wurde DNA-Ligase, äquilibriert auf die gewünschte Temperatur, zugesetzt (1 Einheit in ul) und gemischt, mit Ausnahme von der 0ºC-Kontrolle ohne Enzym, wo Wasser (1 ul) zugesetzt wurde. Die Inkubationen erfolgten während 30 min und wurden durch Extraktion mit Phenol/Chloroform abgeschlossen und bei -70ºC vor der Elektrophorese aufbewahrt.
- Gleiche Mengen (10 ul) wurden von den wäßrigen Phasen der Reaktionen, welche über den Temperaturbereich für jede Konkurrenzreaktion durchgeführt wurden, entfernt, und diese Teilmengen wurden mit getrennten Anteilen von Formamid/NaOH/ Bromphenolblau (20 ul) vermischt und der Elektrophorese unterzogen, wie beschrieben. Die Reihen der Temperaturbereiche für einzelne Konkurrenz-Oligonucleotide wurden auf getrennten Gelen durchgeführt, welche entsprechend der Beschreibung autoradiographiert wurden (siehe Fig. 5, 6 und 7).
- Beide Banden von "0ºC ohne Enzym" -Kontrolle wurden herausgeschnitten und die Cerenkov-Strahlung ausgezählt, um den tatsächlichen Anteil von konkurrierendem Oligonucleotid relativ zu CRN1 zu bestimmen. Die Produktbande von CRN1 und die sichtbaren Produktbanden des Konkurrenzproduktes wurden in ähnlicher Weise isoliert und die Cerenkov-Strahlung ausgezählt. Falls keine Konkurrenzprodukt-Bande sichtbar war, wurde der Bereich des Gels isoliert, bei dem das Produkt durch Untersuchung der Autoradiographie aus der Konkurrenz mit CRN1 und CRN2 vermutet wurde. Bei diesen Banden wurde ebenfalls die Cerenkov-Strahlung ausgezählt, um den Anteil von fehlerhaftem Produkt in dem Gesamtprodukt bei jeder Temperatur zu bestimmen.
- Typische Ergebnisse nach einer Ligation von 30 min bei 0ºC sind in der Tabelle wiedergegeben. Falls kleine Mengen der Fehler-Ligationsprodukte beobachtet wurden, waren die Ausbeuten hiervon im wesentlichen bei Ligationstemperaturen von 0, 5, 10, 15, 20 und 25ºC konstant.
- Die Ausbeuten von fehlerhaften Produkten wurden regelmäßig um annähernd 50% reduziert, wenn die Ligation bei 30ºC durchgeführt wurde, und weiter nach Inkubation bei 35ºC reduziert. Oligonucleotid Fehler Fehlerprodukt Gesamtprodukt % Fehlerprodukt keiner Oligonucleotid Fehler Fehlerprodukt Gesamtprodukt % Fehlerprodukt Oligonucleotid Fehler Fehlerprodukt Gesamtprodukt % Fehlerprodukt
- Die Ergebnisse legen es nahe, daß der Nachweis von Punktmutationen in DNA möglich sein sollte durch Durchführung von Untersuchungen in Anwesenheit von geeigneten Paaren von Oligonucleotiden, wovon eines komplementär zu der normalen Sequenz ist und wovon eines komplementär zu der mutierten Sequenz ist, gefolgt von der Analyse der Ligationsprodukte.
Claims (13)
1. Verfahren zur Diskriminierung zwischen alternativen
Nucleotidsequenzen, wobei das Verfahren umfaßt: das Unterziehen
benachbarter Segmente einer Targetbasensequenz der
Hybridisierung mit einer nachweisbaren ersten Nucleotidsonde und mit
einer zweiten Nucleotidsonde zur Bildung eines Hybrids, wobei
die Nucleotidsequenz der ersten und der zweiten Sonde derart
sind, daß, falls sie ein Splitsondenhybrid mit einer
komplementären Targetsequenz bilden, sie anschließend aneinander
gebunden werden können, das Unterziehen irgendeines
erhaltenen Hybrids der Bindung und den Nachweis irgendeines
erhaltenen Hybrids, wobei
die DNA-Sequenz der nachweisbaren ersten Nucleotidsonde
und der zweiten Nucleotidsonde derart sind, daß ein
potentieller Fehler in der Targetsequenz entweder zwischen diesen
Sonden oder an dem endständigen Ende von einer dieser Sonden,
welche an die andere dieser Sonden angrenzt, liegt;
das Verfahren so durchgeführt wird, daß eine komplementäre
Targetsequenz von einer Targetsequenz mit einem oder mehreren
nicht-komplementären Nucleotiden diskriminiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die nachweisbare erste
Nucleotidsonde und zweite Nucleotidsonde an jeder Seite einer
potentiellen Varianzsequenz in einer Targetsequenz
hybridisiert werden, wobei diese Sonden einer Bindungsreaktion
unterworfen werden, welche die Einführung eines Nucleotids/
von Nucleotiden, das/die entweder zu der normalen oder der zu
erwartenden Varianzsequenz komplementär ist/sind, und das
Unterziehen des Nucleotids/der Nucleotide der
Bindungsbildung umfaßt; gefolgt vom Nachweis irgendeines erhaltenen
Hybrids.
3. Verfahren nach Anspruch 2, worin der Nachweis durch
Unterziehen irgendeines erhaltenen Hybrids der selektiven
Denaturierung durchgeführt wird, wodurch irgendein vorhandenes
Hybrid, in welchem die Bindung der nachweisbaren ersten
Nucleotidsonde an die zweite Nucleotidsonde nicht
durchgeführt wurde, denaturiert wird.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, worin die
Einführung des/der Nucleotids/e durch Verwendung von DNA-
Polymerase durchgeführt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, worin die
nachweisbare erste Nucleotidsonde und die zweite Nucleotidsonde
derart sind, daß sie an die Targetsequenz hybridisieren,
wodurch ein Lücke eines einzelnen Nucleotids zwischen diesen
Sonden belassen wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1, worin eine Splitsonde im Anschluß
an die Hybridisierung mit einer komplementären
Targetbasensequenz gebildet würde, wobei irgendein erhaltenes Hybrid
einer Bindungsreaktion zum Binden der nachweisbaren ersten
Nucleotidsonde an die zweite Nucleotidsonde unterzogen wird,
und das so erhaltene Hybrid einer geeigneten Behandlung
unterzogen wird, wodurch irgendwelches vorhandenes Hybrid, in
dem Bindung der nachweisbaren ersten Nucleotidsonde an zweite
Nucleotidsonde nicht erfolgte, denaturiert wird, während
keine Denaturierung für eine perfekt komplementäres,
nachweisbares, gebundenes Oligonucleotid-Targetsequenzhybrid
erfolgt.
7. Verfahren nach Anspruch 1, worin benachbarte Segmente der
Targetbasensequenz der Hybridisierung mit einer
nachweisbaren ersten Nucleotidsonde und mit einer zweiten
Nucleotidsonde derart unterzogen werden, daß ein Splitsondenhybrid mit
einer komplementären Targetsequenz gebildet wird, das
erhaltene Hybrid selektiver Denaturierung unterzogen wird, wodurch
eine beliebige der ersten und zweiten Nucleotidsonden, die an
einen Abschnitt der Targetbasensequenz mit einem oder
mehreren nicht-komplementären Nucleotid/en hybridisiert ist,
denaturiert wird, das erhaltene Hybrid anschließend einer
Bindungsreaktion unterworfen wird, wodurch die nachweisbare
erste Nucleotidsonde mit der zweiten Nucleotidsonde
verbunden wird, und das erhaltene Hybrid selektiver Denaturierung
unterworfen wird, wodurch zwischen einer zu der ersten und
zweiten Nucleotidsonde komplementären Targetsequenz und
einer Targetsequenz mit einem oder mehreren Nucleotiden
nichtkomplementär zu einer der ersten und zweiten
Nucleotidsonde diskriminiert wird.
8. Verfahren nach Anspruch 1 für die Analyse von Verschiebungen
in einer Targetbasensequenz, worin die nachweisbare erste
Nucleotidsonde geeignet ist, über einen Bereich von
potentieller/n Verschiebung/en zu hybridisieren und die
nicht-nachweisbare zweite Nucleotidsonde geeignet ist, an Sequenzen
benachbart zu dieser/n potentiellen Verschiebungen zu
hybridisieren, wobei die nicht-nachweisbare zweite Nucleotidsonde
ein Glied eines Bindungspaares trägt, wobei das Verfahren
die Bildung eines Splitsondenhybrids umfaßt, welches der
Bindung zur Bildung eines gebundenen Sondenhybrids
unterworfen wird, welches Hybrid dann denaturiert wird.
9. Verfahren nach Anspruch 1, worin jede der nachweisbaren
ersten Nucleotidsonde und zweiten Nucleotidsonde eine
solche Einheit tragen, daß nach der Hybridbildung und
Denaturierung, falls angebracht, ein Signal nur nachweisbar
ist, wenn eine Nucleotidsequenz erhalten wird, die sowohl
die an die nachweisbare erste Nucleotidsonde gebundene
Einheit als auch die an die zweite Nucleotidsonde gebundene
Einheit trägt.
10. Verfahren nach Anspruch 1, zur Diskriminierung zwischen
alternativen Nucleotidsequenzen, in welchem eine
Targetsequenz der Hybridisierung mit mehr als zwei
Oligonucleotidsonden derart unterworfen wird, daß, wo eine
komplementäre Targetsequenz vorhanden ist, ein Splitsondenhybrid
erhalten wird, wobei die nachweisbare erste Nucleotidsonde
eine endständige Oligonucleotidsonde ist, welche
nachweisbar
ist, und die zweite Nucleotidsonde die andere
endständige Oligonucleotidsonde ist, welche hieran gebunden ein
Glied eines Bindungspaares hat, wobei individuelle andere
Oligonucleotidsonde/n getrennt jedoch benachbart zu einer
angrenzenden Targetsequenz zwischen diesen endständigen
Oligonucleotidsonden hybridisiert werden, das erhaltene
Hybrid dann selektiver Denaturierung unterworfen wird,
wodurch irgendwelche an die Targetsequenz über einen
Basenpaarfehler hybridisierte Oligonucleotidsonde denaturiert
wird, und die individuellen Oligonucleotidsonden gebundenen
werden, um die nachweisbare Oligonucleotidsonde an die
Oligonucleotidsonde, welche ein Glied eines Bindungspaares
hieran gebunden aufweist, zur Bildung eines gebundenen
Sondenhybrids zu vereinigen, welches dann denaturiert und
mit dem anderen Glied des Bindungspaares kontaktiert wird,
wodurch die nachweisbare gebundene Sondennucleotidsequenz
einschließlich dieses Bindungspaares von anderen
Nucleotidsequenzen abgetrennt werden kann.
11. Splitsondenhybrid, umfassend eine nachweisbare erste
Nucleotidsonde und eine zweite Nucleotidsonde, hybridisiert an
angrenzende Segmente einer Targetbasensequenz, wobei die
nachweisbare erste Nucleotidsonde zur Bindung mit der
zweiten Nucleotidsonde fähig ist, dadurch gekennzeichnet,
daß die nachweisbare erste Nucleotidsonde und/oder die
zweite Nucleotidsonde an beide Seite einer mit einem
Krankheitszustand assoziierten Varianzsequenz oder an die
entsprechende Normalsequenz hybridisiert sind; oder an die
Targetbasensequenz derart hybridisiert sind, daß eine mit
einem Krankheitszustand assoziierte Varianzbasensequenz
hierin am endstandigen Ende einer dieser Sonden ist, wobei
dieses endständige Ende mit dem anderen dieser Sonden
anstoßend ist, oder mit der entsprechenden Normalsequenz
hybridisiert sind.
12. Kit zur Diskriminierung zwischen alternativen
Nucleotidsequenzen nach dem Verfahren nach Anspruch 1, welches
umfaßt eine nachweisbare erste Nucleotidsonde und eine zweite
Nucleotidsonde, wobei jede Sonde eine zu angrenzenden
Segmenten einer Targetsequenz homologe Nucleotidsequenz hat,
eine potentielle Varianzsequenz in einem dieser Segmente
oder dazwischen vorhanden ist; die nachweisbare erste
Nucleotidsonde und/oder die zweite Nucleotidsonde derart
sind, daß eine potentielle Varianzsequenz an dem
endständigen Ende einer dieser Sonden ist, wobei dieses
endständige Ende anstoßend an die andere dieser Sonden ist,
oder die potentielle Varianzsequenz zwischen diesen Sonden
vorhanden ist, wobei das Kit zusätzlich ein Reagens(tien)
zum Verbinden dieser Sonden enthält.
13. Kit nach Anspruch 12, welches eine nachweisbare erste
Nucleotidsonde und eine zweite Nucleotidsonde zum Nachweis
einer mit einem Krankheitszustand assoziierten Punktmutation
wie auch eine nachweisbare erste Nucleotidsonde und eine
zweite Nucleotidsonde zum Nachweis der entsprechenden
Normalsequenz, in welcher die Mutationssequenz fehlt,
enthält.
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