CZ2016775A3

CZ2016775A3 - Sada pro přípravu a způsob přípravy fixovaných a permeabilizovaných mykoplazmat pro jejich následnou detekci

Info

Publication number: CZ2016775A3
Application number: CZ2016-775A
Authority: CZ
Inventors: Karel Koberna; Anna Ligasová
Original assignee: Univerzita PalackĂ©ho v Olomouci
Priority date: 2016-12-08
Filing date: 2016-12-08
Publication date: 2018-05-23
Also published as: CZ307304B6

Abstract

Popsaný způsob přípravy fixovaných a permeabilizovaných mykoplazmat pro jejich následnou detekci pomocí enzymatického značení DNA zahrnuje několik následných kroků. Tyto kroky vycházejí z fixovaného a permeabilizovaného vzorku. Vzorek se inkubuje s enzymem, vybraným ze skupiny zahrnující DNA polymerázy nebo reverzní transkriptázy, a značenými nukleotidy. Tyto nukleotidy se včleňují do nově syntetizovaných částí řetězců DNA a odhalují místa lokalizace mykoplazmatických buněk. Značené nukleotidy, které jsou včleněny do DNA mykoplazmat, jsou následně vizualizovány pomocí standardních postupů. Popsaný způsob a sada dovolují detekci mykoplazmat bez závislosti na jejich druhu.

Description

Oblast techniky prv ρ ,

Vynález se týká způsobu detek-eomykoplazmat (Mollicutes), P<~c

Dosavadní stav techniky

Mykopiazmata patří mezi bakterie. Avšak na rozdíl od běžných bakterií nemají buněčnou stěnu.

a

Mykopiazmata jsou považoványza nejmenší organizmy, které jsou schopny se sami replikovat. Mykopiazmata způsobují několik chronických onemocnění, včetně únavového syndromu, fibromyalgického syndromu, syndromu války v zálivu a revmatoidní artritidy. Rovněž jsou původcem akutních onemocnění, např. pneumonie (zápaly plic), bronchitidá, zánějy močových cest a záněty v oblasti genitálu. Navíc patří mezi organismy, které často kontaminují eukaryotické buněčné kultury. Ke kontaminaci může dojít různými cestami. Nejčastějšími příčinami je používání kontaminovaných kultivačních roztoků, přenesení kontaminace z jiné kontaminované kultury nebo kontaminace prostřednictvím laboratorního personálu (Cytotechnology, 39, 75-90; Cell Journal, 13, 203-212). Mykoplazmatické kontaminace pak vedou k celé řadě efektů. Předpokládá se, že mění úroveň syntézy proteinů, RNA a DNA, mohou indukovat aberace chromosomů, měnit složení buněčných membrán, měnit morfologii buněk, inhibovat buněčný růst a jiné (Cytotechnology, 39, 75-90; Cell Journal, 13, 203-212). Existuje několik detekčních metod. Mnohé z nich vyžadují subjektivní hodnocení, přičemž použitá měření bývají často materiálně, přístrojově a časově náročná. V současnosti se pro detekci mykoplazmat nejčastěji používají testy založené např. na růstu kolonií mykoplazmat na agaru, histochemická značení, elektronová mikroskopii, značení pomocí Hoechst 33258 nebo ’ , i Ά

DAPI, ELISA testy, značení pomocí protilátek, hybridizaci, detekce pomocí PCR, plazmatesty či analýzy proteinů (Cytotechnology, 39, 75-90).

Podstata vynálezu ‘ l )

Předkládaným vynálezem ježpůsob přípravy fixovaných a permeabilizovaných mykoplazmat na podložkách pro jejich následnou detekci a sada- pro- detekci mykoplazmat. Podložkami *

«

mohou být veškeré materiály, které nevedou k inaktivaci použitých enzymů a jsou kompatibilní s detekčními metodami použitými pro měření signálu. S výhodou se jedná o podložní nebo krycí skla, kultivační misky nebo různé destičky používané pro ELISA testy a/nebo buněčné kultivace. Způsob je založen na syntéze krátkých řetězců DNA uvnitř fixovaných a permeabilizovaných mykoplazmat prostřednictvím enzymu DNA polymerázy nebo enzymu reverzní transkriptázy v přítomnosti značeného nukleotidu, který je těmito enzymy inkorporován do těchto řetězců DNA. Příkladem enzymů jsou DNA polymeráza I, Bsm DNA polymeráza, phi29 DNA polymeráza, Klenow fragment, T7 DNA polymeráza, AMV (avian myeloblastosis virus) reverzní transkriptáza, M-MuLV (moloney murine leukemia virus) reverzní transkriptáza, SuperScript® IV reverzní transkriptáza nebo GoScript™ reverzní transkriptáza. Výhodným příkladem enzymů je DNA polymeráza I a reverzní transkriptáza AMV, které jsou relativně levné a dostatečně výkonné pro tento účel. Při syntéze DNA dochází k inkorporaci značených nukleotidů do vznikajících řetězců DNA. Značené nukleotidy zůstávají díky této reakci uvnitř DNA fixovaných a permeabilizovaných mykoplazmat. Vyvinutý způsob nevede ke značení běžných bakteriálních buněk s buněčnou stěnou.

Podle našich výsledků je výhodné použít nukleotidy konjugované např. s biotinem nebo digoxigeninem, které jsou substráty použitého enzymu. Tyto značené nukleotidy jsou následně lehce detekovatelné a zároveň poskytují vysoký signál. Příkladem je 5-(N-[N-biotinyl-8aminocaproyl-7-aminobutyryl]-3-aminoallyl)-2'-deoxyuridin-5'-trifosfát (biotin-16-dUTP) nebo Y-[N-(biotin-6-amino-hexanoyl)]-5-aminoallyl-2'-deoxyuridin-5'-trifosfát (biotin-11-dUTP) nebo digoxigenin-3-0-methylcarbonyl-8-aminocaproyl-5-(3-aminoallyl)-2-deoxy-uridin-5'-trifosfát (digoxigenin-11-dUTP) nebo N⁶-(6-amino)hexyl-2'-deoxyadenosin-5'- tri fosfát (biotin-7-dATP) nebo y-[N-(biotin-6-amino-hexanoyl)]-7-propargyIamino-2'-deoxyadenosin-5'-trifbsfát (biotin-11-dATP) nebo y-[N-(biotin-6-amino-hexanoyl-6-aminobutanoyl)]-5-(3-propargylamino)-2’-deoxycytidin-5’-trifosfát (biotin-11-dCTP).

Veškeré biotinem značené deoxyuridinové trifosfáty jsou dále uváděné jako biotin-dUTP, podobně digoxigeninem značené deoxyuridinové trifosfáty jako digoxigenin-dUTP.

Pro maximalizaci inkorporace do DNA je výhodné do směsi se značenými nukleotidy přidat i 2'-deoxyadenosin-5'-trifosfát (dATP) a/nebo 2’-deoxyguanosin-5'-trifosfát (dGTP) a/nebo 2'. deoxycitidin-5'-trifosfát (dCTP) a/nebo 2'-deoxythymidin-5'-trifosfát (dTTP). Koncentrace přidaných nukleotidů závisejí na použitém značeném nukleotidu. Např. při použití značeného *

.» «5 * » 9 9 »· » 9 ·4 i t9 9

9 9 9

9

9 9

2’-deoxyuridinového nukleotidu je výhodné, aby použitá koncentrace dTTP byla nižší než koncentrace značeného nukleotidu neboje možné dTTP zcela vynechat, koncentrace ostatních nukleotidů mohou být nad koncentracemi značeného nukleotidu. Obdobně to platí pro použití značeného 2'-deoxyadenosinového a 2'-deoxycytidinového nukleotidu. V tomto případě je výhodné, aby koncentrace dATP, resp. dCTP byla nižší než koncentrace značeného 2'-deoxyadenosinového, resp. 2'-deoxycytidinového nukleotidu, nebo je dATP, resp. dCTP ze směsi zcela vynechán. Koncentrace ostatních nukleotidů mohou být i nad koncentracemi značného dATP, resp. dCTP. Analogicky se postupuje u ostatních značených nukleotidů.

Nejvýhodnější varianta je založena na použití biotin-dUTP nebo digoxigenin-dUTP a směsi dATP, dGTP a dCTP. Tato varianta poskytovala nejsilnější signál.

K detekci mykoplazmat je pak možné použít standardní detekční metody pro tyto značené nukleotidy. Dostatečnou citlivost vykazují systémy založené na protilátkové detekci biotinu nebo digoxigeninu. Použité protilátky mohou, ale nemusí být přímo konjugované s fluorochromem. Pokud nejsou, použije se pro vizualizaci sekundární protilátka konjugovaná s fluorochromem namířená proti protilátce rozeznávající biotin nebo digoxigenin. Ačkoli v případě biotinu je možné použít namísto protilátky streptavidin konjugovaný s fluorochromem, systém založený na protilátce je podle našich výsledků z hlediska síly signálu výhodnější. Oproti systému založeném na streptavidinu, je signál při použití systému založeném na protilátce proti biotinu a sekundární protilátce v závislosti na provedení zpravidla nejméně o polovinu vyšší.

Příkladem dalších značených nukleotidů použitelných pro detekci mykoplazmat je např. 5. ethynyl-2’-deoxyuridin trifosfát (EdUTP) nebo nukleotidy přímo konjugované s fluorochromem. V případě použití EdUTP se pro jeho detekci použije standardní detekční metoda (Proceedings of ťhe National Academy of Sciences of the United States of America 105(7), 2415-2420). V případě použití nukleotidů konjugovaných s fluorochromem, není třeba provádět další detekční reakci.

Pro jasnou identifikaci vzorků obsahující mykoplazmata je výhodné použít negativní vzorky, které jsou podrobeny stejné detekční proceduře.

a « « > » » 9 ♦ » ** , t · » 3 » · ** ♦ · 1 · 9 ·♦ · · « · » ··* » « · · * ·

9« « « ií 9 ♦ · · » ··»·

Metoda je výhodně použitelná i pro detekce mykopiazmatických infekcí v kultivovaných buněčných liniích.

Nespornou výhodou popsaného protokolu je jeho nezávislost na druhu mykopiazmat.

Předmětem předkládaného vynálezu je také sada pro detekci mykopiazmat. Sada pro detekci mykopiazmat obsahuje enzym prodlužující řetězce DNA vybraný ze skupiny zahrnující DNA polymerázy nebo reverzní transkriptázy, nukleotid konjugovaný s biotinem nebo digoxigeninem, dATP a/nebo dGTP a/nebo dCTP a/nebo dTTP, pufr pro použitý enzym vybraný ze skupiny zahrnující DNA polymerázy nebo reverzní transkriptázy zaručující vysokou aktivitu enzymu a prostředky pro detekci značících nukleotidů, kterými mohou být specifické protilátky.

Objasnění výkresů

Obrázek 1 Příklad enzymatické detekce mykoplazmatické infekce v buněčné kultuře HeLa buněk pomocí biotin-dUTP (Příklad 1). DNA mykopiazmat byla enzymaticky značena pomocí biotin-dUTP, který byl následně detekován pomocí primární a sekundární protilátky. DNA buněk byla značena pomocí DAPI. Příklady značené mykoplazmatické DNA jsou označeny šipkami. Měřítko - 10 pm.

Obrázek 2 Příklad HeLa buněk neinfikovaných mykoplazmaty. Na obrázku označeném jako biotin-dUTP jsou HeLa buňky, ve kterých byla provedena kontrola infekce mykoplazmaty pomocí enzymatického značení. DNA buněk byla značena pomocí DAPI (Příklad 1). Měřítko — 10 pm.

Příklady uskutečnění vynálezu

Seznam použitých zkratek

HeLa buněčná linie lidských epiteliálních buněk

DMEM Dulbeccova modifikace Eaglova média

PBS fosfátem pufrovaný fyziologický roztok

S-MEM modifikace Eaglova minimálního média pro suspenzní buňky * » 9 * » * * » * ϊ» * 9» » , _t * 9» · « « ·« 9 · • 9 *9 9 9 * φ > * 9 » » ♦ * '* · * ·

Příklad 1

Detekce mykoplazmatických kontaminací v kultuře eukaryotických buněk kultivovaných na sklíčkách.

Následující postup popisuje způsob detekce mykoplazmatických infekcí v kultuře buněk kultivovaných na podložních sklíčkách. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.

A) Lidské HeLa buňky (dále jen vzorky) byly pěstovány v Petriho miskách na kruhových sklech o průměru 12 mm v růstovém médiu - DMEM s L-glutaminem (Gibco), 10% (obj./obj.) fetálním telecím sérem (Life Technologies), 50 pg/ml gentamicinem a 3,7 g/1 NaHCCh

Ϋ v atmosféře s 5% (obj./obj.) CO2 při 37^C.

B) Druhý den po pasáži bylo růstové médium odstraněno a nahrazeno pufrem (lx PBS, složení viz část Použité roztoky a chemikálie, přidány byly přibližně 1 až 2 ml pufru na 4 cm²plochy).

C) Pufr byl odstraněn a vzorky byly 10 minut alternativně fixovány 0,5%, ž^nebo 4% (hmotnost/obj.) roztokem formaldehydu v lx PBS (pH 7,4; 1 až 2 ml fixačního roztoku na 4 cm² plochy).

Alternativně byly vzorky fixovány metanolem a následně acetonem nebo byly fixovány etanolem.

V případě použití metanolu a acetonu byla skla se vzorky nejdříve inkubována 10 minut v metanolu při teplotě -20j°C (přibližně 1 až 2 ml metanolu na 4 cm² plochy) a následně byla ponořena na 30 sekund do kádinky s 50 ml acetonu o teplotě místnosti, skla se vzorky pak byla usušena a po usušení položena do Petriho misky s lx PBS, přičemž vzorky směrovaly nahoru do roztoku.

V případě použití etanolu byly vzorky fixovány 70% (obj./obj.) roztokem etanolu 60 minut při teplotě -20í°C (přibližně 1 až 2 ml etanolu na 4 cm² plochy). Skla se vzorky pak byla položena do Petriho misky s lx PBS, přičemž vzorky směrovaly nahoru do roztoku.

V případě použití metanolu a acetonu anebo etanolu následoval krok Ef » 9 ♦ »* * 1 » »

9»

D) Roztok formaldehydu byl odstraněn a vzorky byly převrstveny lx PBS (přibližně 1 až 2 ml lx PBS na 4 cm² plochy). Po 5 minutách byl pufr odstraněn a nahrazen novým o stejném složení. Tento krok byl opakován ještě jednou.

E) Následně byl pufr odstraněn. Vzorky byly 10 minut permeabilizovány 0,2% (obj./obj.) roztokem Tritonu X-100 v lx PBS (přibližně 1 až 2 ml permeabilizačního roztoku na 4 cm²plochy). Po odstranění permeabilizačního roztoku byly vzorky převrstveny lx PBS (přibližně 1 až 2 ml lx PBS na 4 cm² plochy).

F) Po 5 minutách byl roztok lx PBS odstraněn a nahrazen stejným množstvím téhož roztoku. Tento krok byl opakován ještě jednou.

G) Skla se vzorky byla vyjmuta pomocí pinzety z Petriho misky a přebytek pufru byl odsát pomocí filtračního papíru tak, že skla se vzorky byla položena stranou bez vzorků na filtrační papír. Skla se vzorky byla položena na kapky lx PBS na parafilmu (150 μΙ/kapka, tato velikost byla použita vždy, pokud není uvedeno jinak). Skla směřovala vrstvou se vzorky směrem dolů do kapky.

H) Vzorky byly inkubovány 30 minut na teplotě místnosti na 40 μΐ kapkách reakční směsi obsahující DNA polymerázu I nebo AMV reverzní transkriptázu (konečná koncentrace byla 0,1 nebo 0,2 nebo 0,5 nebo 1 U.pl·¹; definice jednotky použitých enzymů viz část Použité roztoky a chemikálie), lx pufr pro DNA polymerázu I respektive AMV reverzní transkriptázu (složení pufrů viz část Použité roztoky a chemikálie), dATP, dGTP a dCTP (alternativně 0,005 nebo 0,05 nebo 0.5 mmol.l¹), biotin-dUTP nebo digoxigenin-dUTP (alternativně 0,001 nebo 0,0125 nebo 0,125 mmol.l·')· V některých provedeních byly vynechány dATP, dGTP nebo dCTP.

V jiných provedeních byl přidán dTTP (alternativně 0,001 nebo 0,005 nebo 0,0125 nebo 0,125 mmol.l·¹). V dalších provedeních byl použit namísto značeného deoxyuridinu trifosfátu biotin- ~7-dATP nebo biotin-11-dATP nebo biotin-11-dCTP v koncentraci alternativně 0,001 nebo 0,0125 nebo 0,125 mmol.l·¹. V případě použití biotin-7-dATP nebo biotin-11-dATP směs obsahovala rovněž dGTP, dCTP a dTTP (alternativně 0,005 nebo 0,05 nebo 0.5 mmol.l·’).

V případě použití biotin-11-dCTP směs rovněž obsahovala dATP, dGTP nebo dTTP (alternativně 0,005 nebo 0,05 nebo 0.5 mmol.l·¹).

I) Skla se vzorky byla přenesena na kapku 25 mmol.l'¹ Tris-HCl, pH = 7,5 a 150 mmol.l'¹NaCl. Po 5 minutách byla skla se vzorky přenesena na novou kapku 25 mmol.l·’ Tris-HCl, pH = 7,5 a 150 mmol.l·¹ NaCl. Tento krok byl ještě jednou opakován.

J) Vzorky byly následně inkubovány 30 minut na 40 μΐ kapkách s králičí protilátkou rozeznávající biotin-dUTP ředěnou ve 25 mmol.l·’ Tris-HCl, pH = 7,5 a 150 mmol.l·¹ NaCl (koncentrace protilátky byla 5 μg/ml) nebo s myší protilátkou rozeznávající digoxigenin-dUTP ředěnou ve 25 mmol.l·¹ Tris-HCl, pH = 7,5 a 150 mmol.l·¹ NaCl (koncentrace protilátky byla 5 pg/ml).

K) Skla se vzorky byla přenesena na kapku 25 mmol.l·¹ Tris-HCl, pH = 7,5 a 150 mmol.l·¹NaCl. Po 5 minutách byla skla se vzorky přenesena na novou kapku 25 mmol.l·¹ Tris-HCl, pH = 7,5 a 150 mmol.l·¹ NaCl. Tento krok byl ještě jednou opakován.

L) Skla se vzorky byla inkubována 30 minut ve směsi sekundární protilátky a 1 gmol.l'¹DAPI ředěných 25 mmol.l·¹ Tris-HCl, pH = 7,5 a 150 mmol.l·¹ NaCl na kapkách o velikosti 40 μΐ. Sekundární protilátky byly ředěny v poměru 1:100. V případě použití biotinylovaných nukleotidů byla použita kozí protilátka namířená proti králíkovi konjugovaná s fluorochromem Alexa Fluor 488, v případě digoxigenin-dUTP byla použita kozí protilátka namířená proti myši konjugovaná s fluorochromem Alexa Fluor 488.

M) Skla se vzorky byla přenesena na kapku 25 mmol.l·¹ Tris-HCl, pH = 7,5 a 150 mmol.l·¹NaCl. Po 5 minutách byla skla se vzorky přenesena na novou kapku 25 mmol.l·¹ Tris-HCl, pH = 7,5 a 150 mmol.l·¹ NaCl. Tento krok byl ještě jednou opakován.

N) Nakonec byl 25 mmol.l'¹ Tris-HCl, pH = 7,5 a 150 mmol.l'¹ NaCl ze skel odsát pomocí filtračního papíru a následně byla skla položena na kapičky (3 μΐ) připraveného montovacího média na podložním skle (roztok: 90% glycerol (obj./obj.), 50 mM Tris, pH 8, 2,5% 1,4-

-diazabicyclo[2.2.2]oktan (hmotnost/obj.)). Vzorky směřovaly do kapičky roztoku. Jemným tlakem pomocí pinzety na horní stranu skel se vzorky došlo k roztažení roztoku média po celé ploše skel. Následně byly okraje skel zalakovány pomocí rychleschnoucího laku. Signál byl detekován pomocí fluorescenčního mikroskopu. Příklad detekce mykoplazmatické infekce u > » » í *

i * > i » 9 » ♦ « a ·' «

» í 9

HeLa buněk pomocí biotin-dUTP je na obrázku 1. Příklad HeLa buněk, které nejsou nakaženy mykoplazmaty je na obrázku 2.

Příklad 2

Detekce mykoplazmat přisedlých na sklíčkách bez přítomnosti živočišných buněk.

Následující postup popisuje způsob detekce mykoplazmat přisedlých na sklíčkách bez přítomnosti živočišných buněk. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.

Vzorky byly promyty pufrem (lx PBS, přidány byly přibližně 1 až 2 ml pufru na 4 cm² plochy) a následně bylo postupováno podle kroku C až N příkladu 1 s těmito rozdíly:

1) V kroku L nebyla použita DAPI.

Příklad 3

Detekce mykoplazmatických kontaminací v kultuře eukaryotických buněk kultivovaných v suspenzi.

Následující postup popisuje způsob detekce mykoplazmatických kontaminací v kultuře eukaryotických buněk kultivovaných v suspenzi. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.

A) Lidské HeLa S3 buňky (dále jen vzorky) byly pěstovány v kultivačních lahvích (objem lahví byl 50 ml), které byly třepány, v růstovém médiu S-MEM (modifikace Eaglova minimálního média pro suspenzní buňky, Sigma) s 3% (hmotnost/obj.) L-glutaminem, 5% (obj./obj.) fetálním telecím sérem (Life Technologies) a 50 pg/ml gentamicinem v atmosféře f i s 5% (obj./obj.) CO2 při 37l°C. Buněčná suspenze obsahovala přibližně 5t8 χ 10⁵ buněk na l mililitr.

B) Druhý den byla suspenze buněk přenesena do 15 mililitrové centrifůgační zkumavky a vzorky byly odstřeďovány 10 minut při 30 . Supematant byl odstraněn (ve zkumavce bylo

ponecháno 200 μΐ média) a ke vzorkům bylo přidáno nové médium (10 ml). Vzorky byly » > » • · »

* · 4

(ve zkumavce bylo ponecháno 200 μΐ média) a k peletu vzorků byl přidán 1 ml nového média. Pelet vzorků byl rozsuspendován.

C) 50 μΐ kapka suspenze buněk byla přenesena na kruhová skla o průměru 12 mm potažené vrstvou poly-L-lysinu (způsob přípravy těchto skel je popsán v části Použité roztoky a chemikálie). Po 2 minutách byl přebytek média odsát pomocí filtračního papíru tak, že byl filtrační papír jemně přiložen k hraně skla. Skla byla položena alternativně do 0₍.5% nebo 1% nebo 2% (hmotnost/obj.) roztoku formaldehydu v Petriho misce a vzorky byly fixovány 10 minut. Skla byla umístěna do Petriho misek tak, že směřovala vzorky nahoru do roztoku.

V-

D) V dalších krocích bylo postupováno podle bodů D-N příkladu 1.

Příklad 4

Detekce mykoplazmatických kontaminací v kultuře eukaryotických buněk kultivovaných na vnitřním povrchu kultivačních destiček.

Následující postup popisuje způsob detekce mykoplazmatických kontaminací v kultuře eukaryotických buněk kultivovaných na vnitřním povrchu kultivačních destiček. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.

h

Postup je stejný jako v případě přisedlých buněk (Příklad 1, body A-N) s následujícími rozdíly:

1) Veškeré inkubace byly provedeny v jamkách 96-jamkových destiček.

2) Při inkubacích s protilátkami bylo použito 50 μΐ roztoku.

3) V případě promývání bylo použito 100 μΐ roztoku.

4) Na konci protokolu (bod N příkladu I) se z jednotlivých vzorků odstraní 25 mmol.kl Tris-HCI, pH = 7,5 a 150 mmohlT NaCl a nahradí se 100 pL směsi 90% glycerol (obj./obj.), 50 mM Tris, pH 8, 2,5% l,4-diazabicyclo[2.2.2]oktan (hmotnost/obj.).

Příklad 5

Detekce mykoplazmat přisedlých na vnitřním povrchu kultivačních destiček bez přítomnosti živočišných buněk.

» ·

Následující postup popisuje způsob detekce mykoplazmat přisedlých na vnitřním povrchu kultivačních destiček bez přítomnosti živočišných buněk. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.

Postup byl stejný jako v příkladu 2 s těmito rozdíly:

1) Veškeré inkubace byly provedeny v jamkách 96-jamkových destiček.

2) Při inkubacích s protilátkami bylo použito 50 μΐ roztoku.

3) V případě promývání bylo použito 100 μΙ roztoku.

4) Na konci protokolu se z jednotlivých vzorků odstraní 25 mmol.Ut Tris-HCl, pH = 7,5 a 150 mmoLM NaCI a nahradí se 100 gL směsi 90% glycerol (obj./obj.), 50 mM Tris, pH 8, 2,5% l,4-diazabicyclo[2.2.2]oktan (hmotnost/obj.).

5) V některých provedeních byly protilátky rozeznávající protilátky namířené proti biotinu nebo digoxigeninu konjugovány s peroxidázou a jako substrát byl použit 1-Step™ Ultra TMB-ELISA Substráte Solution (ThermoFisher Scientific, kat. č. 34028). V těchto případech byla pro detekci signálu použita čtečka destiček.

Použité roztoky a chemikálie:

1. Fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (PBS) lOx PBS (desetinásobně koncentrovaný roztok PBS):

1,4 mol.l¹ NaCI mmol.r¹ KC1 mmol.I’¹ Na₂HPO₄ mmoLl-' KH₂PO₄ vír

Uvedené složky byly rozpuštěny v destilované vodě a pH bylo upraveno do rozmezí 7,3r7,4 lx PBS (fosfátem pufrovaný fyziologický roztok v obvyklé koncentraci)

2. Příprava polylysinovych skel pro ukotvení suspenzních buněk

Kruhová skla s průměrem 12 mm byla vložena do 50 ml kádinky s 20 ml 96% (obj./obj.) etanolu. Po 10 minutách byla pomocí pinzety přenesena do Petriho misky vyložené filtračním v » »

papírem a usušena. Skla byla následně na dobu 1 minuty ponořena do 0,01% (hmotnost/obj.) roztoku poly-L-lysinu v DMEM, následně byla ponořena na 30 sekund do lx PBS a pak ještě jednou na 30 sekund do nového lx PBS. Tento krok byl ještě 3x opakován. Nakonec byla skla položena na filtrační papír a usušena.

3. Složení lOx pufru pro DNA polymerázu I

500 mmol.I’¹ Tris-HCl (pH 7,5 @ 25 °C), 100 mmol.r¹ MgCh, 10 mmol.I'¹ DTT ((±)-threo=- 1,4-Dimercapto-2,3-butanediol)

4. Složení lOx pufru pro AMVreverzní transkriptázu

250 mmol.I'¹ Tris-HCl (pH 8,3 @ 25°C), 250 mmol.I’¹ KCI, 50 mmol.I’¹ MgCb, 2,5 mmol.l*¹spermidin a 50 mmol.l·’ DTT ((±)-threo-l,4-Dimercapto-2,3-butanediol).

5. Definice jednotky použitých enzymů

DNA polymeráza I

Jedna jednotka (U) enzymu katalyzuje za 30 minut inkorporaci 10 nmol deoxyribonukleotidů do polynukleotidové frakce při teplotě 3ÝC.

AMV reverzní transkriptáza

Jedna jednotka (U) enzymu katalyzuje přenos 1 nmol deoxynukleotidů do materiálu, který je možné precipitovat v kyselém prostředí, v průběhu 10 minut při teplotě 37°C.

Průmyslová využitelnost:

Způsob přípravy fixovaných a permeabilizovaných mykoplazmat pro jejich následnou detekci a sada pro detekci mykoplazmat jsou využitelné pro detekce mykoplazmatických infekcí na pracovištích, které se věnují pěstování buněčných linií, a rovněž v obecných případech potřeby identifikace mykoplazmat. Způsob a sada jsou nezávislé na druhu mykoplazmat.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Sada pro přípravu fixovaných a permeabilizovaných mykoplazmat pro jejich následnou detekcýv yznačující se tím, že obsahuje enzym ze skupiny DNA polymeráz, s výhodou DNA polymerázu I nebo enzym ze skupiny reverzních transkriptáz, s výhodou AMV reverzní transkriptázu, pufr pro enzym ze skupiny DNA polymeráz, s výhodou pufr pro DNA polymerázu I nebo pufr pro enzym ze skupiny reverzních transkriptáz, s výhodou pufr pro AMV reverzní transkriptázu, nukleotid trifosfát konjugovaný s biotinem nebo nukleotid trifosfát konjugovaný s digoxigeninem, dále tyto nukleotidy: 2'-deoxyadenosin5'-trifosfát a/nebo 2'-deoxyguanosin-5'-trifosfát a/nebo 2'-deoxycytidin-5'-trifosfát a/nebo 2'-deoxytymidin-5'-trifosfát a protilátky proti biotinu nebo digoxigeninu.
2. Způsob přípravy fixovaných a permeabilizovaných mykoplazmat pro jejich následnou detekci pomocí sady podle nároku ^vyznačující se t í m, že se ke vzorkům fixovaných a permeabilizovaných mykoplazmat na podložkách přidá reakční směs obsahující značený nukleotid a enzym ze skupiny DNA polymeráz nebo reverzních transkriptáz a tato směs je inkubována se vzorkem.
3. Způsob přípravy fixovaných a permeabilizovaných mykoplazmat pro jejich následnou detekci podle nároku 2^vyznačující se tím, že se jako enzym použije DNA polymeráza I.
4. Způsob přípravy fixovaných a permeabilizovaných mykoplazmat pro jejich následnou detekci podle nároku 2 _f v y z n a č u j í c í se t í m, že se jako enzym použije AMV reverzní transkriptáza.
5. Způsob přípravy fixovaných a permeabilizovaných mykoplazmat pro jejich následnou detekci podle některého z nároků 2až4^vyznačující se tím, že reakční směs z nároku -Y obsahuje rovněž 2'-deoxyadenosin-5'-trifosfát a/nebo 2'-deoxyguanosin-5'trifosfát a/nebo 2'-deoxycytidin-5'-trifosfát a/nebo 2'-deoxytymidin-5'-trifosfát.
6. Způsob přípravy fixovaných a permeabilizovaných mykoplazmat pro jejich následnou detekci podle některého z nároků 2 až 5^ vyznačující se tím, že se jako značený nukleotid použije nukleotid konjugovaný s biotinem nebo digoxigeninem.