CZ307304B6 - Sada pro přípravu a způsob přípravy fixovaných a permeabilizovaných mykoplazmat pro jejich následnou detekci - Google Patents
Sada pro přípravu a způsob přípravy fixovaných a permeabilizovaných mykoplazmat pro jejich následnou detekci Download PDFInfo
- Publication number
- CZ307304B6 CZ307304B6 CZ2016-775A CZ2016775A CZ307304B6 CZ 307304 B6 CZ307304 B6 CZ 307304B6 CZ 2016775 A CZ2016775 A CZ 2016775A CZ 307304 B6 CZ307304 B6 CZ 307304B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- mycoplasmas
- permeabilized
- triphosphate
- fixed
- biotin
- Prior art date
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 title claims abstract description 26
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 29
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 29
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims abstract description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 13
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 claims description 12
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 claims description 10
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 claims description 10
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 claims description 10
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 9
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 9
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 9
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 claims description 9
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 claims description 9
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 6
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 3
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000001745 anti-biotin effect Effects 0.000 claims description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N dCTP Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO[P@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N 0.000 claims 2
- 102000042455 reverse transcriptase family Human genes 0.000 claims 1
- 108091078962 reverse transcriptase family Proteins 0.000 claims 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 abstract description 13
- 241000204003 Mycoplasmatales Species 0.000 abstract description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 abstract description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000007762 localization of cell Effects 0.000 abstract 1
- 241000894007 species Species 0.000 abstract 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 abstract 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 32
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 26
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 25
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 22
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 9
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000713838 Avian myeloblastosis virus Species 0.000 description 6
- 206010028470 Mycoplasma infections Diseases 0.000 description 6
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 5
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- OLXZPDWKRNYJJZ-UHFFFAOYSA-N 5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-ol Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 OLXZPDWKRNYJJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 239000008098 formaldehyde solution Substances 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- IMNIMPAHZVJRPE-UHFFFAOYSA-N triethylenediamine Chemical compound C1CN2CCN1CC2 IMNIMPAHZVJRPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 2'‐deoxycytidine Chemical class O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- -1 deoxyuridine triphosphates Chemical class 0.000 description 2
- MXHRCPNRJAMMIM-UHFFFAOYSA-N desoxyuridine Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 2
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxyuridine Chemical class C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- CDEURGJCGCHYFH-DJLDLDEBSA-N 5-ethynyl-2'-deoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C#C)=C1 CDEURGJCGCHYFH-DJLDLDEBSA-N 0.000 description 1
- 208000030090 Acute Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 238000000116 DAPI staining Methods 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 206010056557 Gulf war syndrome Diseases 0.000 description 1
- 101000731000 Homo sapiens Membrane-associated progesterone receptor component 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100032399 Membrane-associated progesterone receptor component 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- AZRNEVJSOSKAOC-VPHBQDTQSA-N [[(2r,3s,5r)-5-[5-[(e)-3-[6-[5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]hexanoylamino]prop-1-enyl]-2,4-dioxopyrimidin-1-yl]-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C(\C=C\CNC(=O)CCCCCNC(=O)CCCC[C@H]2[C@H]3NC(=O)N[C@H]3CS2)=C1 AZRNEVJSOSKAOC-VPHBQDTQSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 231100000005 chromosome aberration Toxicity 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012120 mounting media Substances 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 201000010076 persian gulf syndrome Diseases 0.000 description 1
- INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N pibenzimol Chemical compound C1CN(C)CCN1C1=CC=C(N=C(N2)C=3C=C4NC(=NC4=CC=3)C=3C=CC(O)=CC=3)C2=C1 INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000002966 varnish Substances 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Popsaný způsob přípravy fixovaných a permeabilizovaných mykoplazmat pro jejich následnou detekci pomocí enzymatického značení DNA zahrnuje několik následných kroků. Tyto kroky vycházejí z fixovaného a permeabilizovaného vzorku. Vzorek se inkubuje s enzymem, vybraným ze skupiny zahrnující DNA polymerázy nebo reverzní transkriptázy, a značenými nukleotidy. Tyto nukleotidy se včleňují do nově syntetizovaných částí řetězců DNA a odhalují místa lokalizace mykoplazmatických buněk. Značené nukleotidy, které jsou včleněny do DNA mykoplazmat, jsou následně vizualizovány pomocí standardních postupů. Popsaný způsob a sada dovolují detekci mykoplazmat bez závislosti na jejich druhu.
Description
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu přípravy mykoplazmat (Mollicutes) pro jejich následnou detekci.
Dosavadní stav techniky
Mykoplazmata patří mezi bakterie. Avšak na rozdíl od běžných bakterií nemají buněčnou stěnu. Mykoplazmata jsou považována za nejmenší organizmy, které jsou schopny se sami replikovat. Mykoplazmata způsobují několik chronických onemocnění, včetně únavového syndromu, fibromyalgického syndromu, syndromu války v zálivu a revmatoidní artritidy. Rovněž jsou původcem akutních onemocnění, např. pneumonie (zápaly plic), bronchitidy, zánětů močových cest a zánětů v oblasti genitálu. Navíc patří mezi organismy, které často kontaminují eukaryotické buněčné kultury. Ke kontaminaci může dojít různými cestami. Nejčastějšími příčinami je používání kontaminovaných kultivačních roztoků, přenesení kontaminace z jiné kontaminované kultury nebo kontaminace prostřednictvím laboratorního personálu (Cytotechnology, 39, 75-90; Cell Journal, 13, 203-212). Mykoplazmatické kontaminace pak vedou k celé řadě efektů. Předpokládá se, že mění úroveň syntézy proteinů, RNA a DNA, mohou indukovat aberace chromosomů, měnit složení buněčných membrán, měnit morfologii buněk, inhibovat buněčný růst a jiné (Cytotechnology, 39, 75-90; Cell Journal, 13, 203-212). Existuje několik detekčních metod. Mnohé z nich vyžadují subjektivní hodnocení, přičemž použitá měření bývají často materiálně, přístrojově a časově náročná. V současnosti se pro detekci mykoplazmat nejčastěji používají testy založené např. na růstu kolonií mykoplazmat na agaru histochemickém značení, elektronové mikroskopii, značení pomocí Hoechst 33258 nebo DAPI, ELISA testy, značení pomocí protilátek, hybridizaci, detekci pomocí PCR, plazmatestech či analýze proteinů (Cytotechnology, 39, 75-90).
Podstata vynálezu
Předkládaným vynálezem je sada pro přípravu a způsob přípravy fixovaných a permeabilizovaných mykoplazmat na podložkách pro jejich následnou detekci. Podložkami mohou být veškeré materiály, které nevedou k inaktivaci použitých enzymů a jsou kompatibilní s detekčními metodami použitými pro měření signálu. S výhodou se jedná o podložní nebo krycí skla, kultivační misky nebo různé destičky používané pro ELISA testy a/nebo buněčné kultivace. Způsob je založen na syntéze krátkých řetězců DNA uvnitř fixovaných a permeabilizovaných mykoplazmat prostřednictvím enzymu DNA polymerázy nebo enzymu reverzní transkriptázy v přítomnosti značeného nukleotidu, který je těmito enzymy inkorporován do těchto řetězců DNA. Příkladem enzymů jsou DNA polymeráza I, Bsm DNA polymeráza, phi29 DNA polymeráza, Klenow fragment, T7 DNA polymeráza, AMV (avian myeloblastosis virus) reverzní transkriptáza, M-MuLV (moloney murine leukemia virus) reverzní transkriptáza. SuperScript® IV reverzní transkriptáza nebo GoScript™ reverzní transkriptáza. Výhodným příkladem enzymů je DNA polymeráza I a reverzní transkriptáza AMV, které jsou relativně levné a dostatečně výkonné pro tento účel. Při syntéze DNA dochází k inkorporaci značených nukleotidů do vznikajících řetězců DNA. Značené nukleotidy zůstávají díky této reakci uvnitř DNA fixovaných a permeabilizovaných mykoplazmat. Vyvinutý způsob nevede ke značení běžných bakteriálních buněk s buněčnou stěnou.
Podle našich výsledků je výhodné použít nukleotidy konjugované např. s biotinem nebo digoxigeninem, které jsou substráty použitého enzymu. Tyto značené nukleotidy jsou následně lehce detekovatelné a zároveň poskytují vysoký signál. Příkladem je 5-(N-[N-biotinyl-e
- 1 CZ 307304 B6 aminocaproyl-y-aminobutyryl]-3-aminoallyl)-2'-deoxyuridin-5'-trifosfát (biotin-16-dUTP) nebo y-[N-(biotin-6-amino-hexanoyl)]-5-aminoallyl-2'-deoxyuridin-5'-trifosfát (biotin-11dUTP) nebo digoxigenin-3-O-methylcarbonyl-8-aminocaproyl-5-(3-aminoallyl)-2-deoxyuridin-5'-trifosfát (digoxigenin-11-dUTP) nebo N6-(6-amino)hexyl-2'-deoxyadenosin-5'trifosfát (biotin-7-dATP) nebo y-[N-(biotin-6-amino-hexanoyl)]-7-propargylamino-2'deoxyadenosin-5'-trifosfát (biotin-1 1-dATP) nebo y-[N-(biotin-6-amino-hexanoyl-6aminobutanoyl)]-5-(3-propargylamino)-2'-deoxycytidin-5'-trifosfát (biotin-1 1-CTP). Veškeré biotinem značené deoxyuridinové trifosfáty jsou dále uváděné jako biotin-dUTP, podobně digoxigeninem značené deoxyuridinové trifosfáty jako digoxigenin-dUTP.
Pro maximalizaci inkorporace do DNA je výhodné do směsi se značenými nukleotidy přidat i 2'deoxyadenosin-5'-trifosfát (dATP) a/nebo 2'-deoxyguanosin-5'-trifosfát (dGTP) a/nebo 2'deoxycitidin-5'-trifosfát (dCTP) a/nebo 2'-deoxythymidin-5'-trifosfát (dTTP). Koncentrace přidaných nukleotidů závisí na použitém značeném nukleotidu. Např. při použití značeného 2'deoxyuridinového nukleotidu je výhodné, aby použitá koncentrace dTTP byla nižší než koncentrace značeného nukleotidu nebo je možné dTTP zcela vynechat, koncentrace ostatních nukleotidů mohou být nad koncentracemi značeného nukleotidu. Obdobně to platí pro použití značeného 2'-deoxyadenosinového a 2'-deoxycytidinového nukleotidu. V tomto případě je výhodné, aby koncentrace dATP, resp. dCTP byla nižší než koncentrace značeného 2'deoxyadenosinového, resp. 2'-deoxycytidinového nukleotidu, nebo je dATP, resp. dCTP ze směsi zcela vynechán. Koncentrace ostatních nukleotidů mohou být i nad koncentracemi značného dATP, resp. dCTP. Analogicky se postupuje u ostatních značených nukleotidů.
Nejvýhodnější varianta je založena na použití biotin-dUTP nebo digoxigenin-dUTP a směsi dATP, dGTP a dCTP. Tato varianta poskytovala nejsilnější signál.
K detekci mykoplazmat je pak možné použít standardní detekční metody pro tyto značené nukleotidy. Dostatečnou citlivost vykazují systémy založené na protilátkové detekci biotinu nebo digoxigeninu. Použité protilátky mohou, ale nemusí být přímo konjugované s fluorochromem. Pokud nejsou, použije se pro vizualizaci sekundární protilátka konjugovaná s fluorochromem namířená proti protilátce rozeznávající biotin nebo digoxigenin. Ačkoli v případě biotinu je možné použít namísto protilátky streptavidin konjugovaný s fluorochromem, systém založený na protilátce je podle našich výsledků z hlediska síly signálu výhodnější. Oproti systému založeném na streptavidinu, je signál při použití systému založeném na protilátce proti biotinu a sekundární protilátce v závislosti na provedení zpravidla nejméně o polovinu vyšší.
Příkladem dalších značených nukleotidů použitelných pro detekci mykoplazmat je např. 5ethynyl-2'-deoxyuridin trifosfát (EdUTP) nebo nukleotidy přímo konjugované s fluorochromem. V případě použití EdUTP se pro jeho detekci použije standardní detekční metoda (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105(7), 2415-2420). V případě použití nukleotidů konjugovaných s fluorochromem není třeba provádět další detekční reakci.
Pro jasnou identifikaci vzorků obsahující mykoplazmata je výhodné použít negativní vzorky, které jsou podrobeny stejné detekční proceduře.
Metoda je výhodně použitelná i pro detekce mykoplazmatických infekcí v kultivovaných buněčných liniích.
Nespornou výhodou popsaného protokolu je jeho nezávislost na druhu mykoplazmat.
Předmětem předkládaného vynálezu je také sada pro detekci mykoplazmat. Sada pro detekci mykoplazmat obsahuje enzym prodlužující řetězce DNA vybraný ze skupiny zahrnující DNA polymerázy nebo reverzní transkriptázy, nukleotid konjugovaný s biotinem nebo digoxigeninem, dATP a/nebo dGTP a/nebo dCTP a/nebo dTTP, pufr pro použitý enzym vybraný ze skupiny
-2CZ 307304 B6 zahrnující DNA polymerázy nebo reverzní transkriptázy zaručující vysokou aktivitu enzymu a prostředky pro detekci značících nukleotidů, kterými mohou být specifické protilátky.
Objasnění výkresů
Obrázek 1 Příklad enzymatické detekce mykoplazmatické infekce v buněčné kultuře HeLa buněk pomocí biotin-dUTP (Příklad 1). DNA mykoplazmat byla enzymaticky značena pomocí biotindUTP, který byl následně detekován pomocí primární a sekundární protilátky. DNA buněk byla značena pomocí DAPI. Příklady značené mykoplazmatické DNA jsou označeny šipkami. Měřítko - 10 pm.
Obrázek 2 Příklad HeLa buněk neinfikovaných mykoplazmaty. Na obrázku označeném jako biotin-dUTP jsou HeLa buňky, ve kterých byla provedena kontrola infekce mykoplazmaty pomocí enzymatického značení. DNA buněk byla značena pomocí DAPI (Příklad 1). Měřítko 10 pm.
Příklady uskutečnění vynálezu
Seznam použitých zkratek
HeLa buněčná linie lidských epiteliálních buněk
DMEM Dulbeccova modifikace Eaglova média
PBS fosfátem pufrovaný fyziologický roztok
S-MEM modifikace Eaglova minimálního média pro suspenzní buňky
Příklad 1
Detekce mykoplazmatických kontaminací v kultuře eukaryotických buněk kultivovaných na sklíčkách.
Následující postup popisuje způsob detekce mykoplazmatických infekcí v kultuře buněk kultivovaných na podložních sklíčkách. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.
A) Lidské HeLa buňky (dále jen vzorky) byly pěstovány v Petriho miskách na kruhových sklech o průměru 12 mm v růstovém médiu - DMEM s L-glutaminem (Gibco), 10% (obj./obj.) fetálním telecím sérem (Life Technologies), 50 pg/ml gentamicinem a 3,7 g/1 NaHCO3 v atmosféře s 5% (obj./obj.) CO2 při 37 °C.
B) Druhý den po pasáži bylo růstové médium odstraněno a nahrazeno pufrem (lx PBS, složení viz část Použité roztoky a chemikálie, přidány byly přibližně 1 až 2 ml pufru na 4 cm2 plochy).
C) Pufr byl odstraněn a vzorky byly 10 minut alternativně fixovány 0,5%, 2 nebo 4% (hmotnost/obj.) roztokem formaldehydu v lx PBS (pH 7,4; 1 až 2 ml fixačního roztoku na 4 cm2 plochy).
Alternativně byly vzorky fixovány metanolem a následně acetonem nebo byly fixovány etanolem.
V případě použití metanolu a acetonu byla skla se vzorky nejdříve inkubována 10 minut v metanolu při teplotě -20 °C (přibližně 1 až 2 ml metanolu na 4 cm2 plochy) a následně byla ponořena na 30 sekund do kádinky s 50 ml acetonu o teplotě místnosti, skla se vzorky pak byla usušena a po usušení položena do Petriho misky s lx PBS, přičemž vzorky směrovaly nahoru do roztoku.
V případě použití etanolu byly vzorky fixovány 70% (obj./obj.) roztokem etanolu 60 minut při teplotě -20 °C (přibližně 1 až 2 ml etanolu na 4 cm2 plochy). Skla se vzorky pak byla položena do Petriho misky s lx PBS, přičemž vzorky směrovaly nahoru do roztoku.
V případě použití metanolu a acetonu anebo etanolu následoval krok F.
D) Roztok formaldehydu byl odstraněn a vzorky byly převrstveny lx PBS (přibližně 1 až 2 ml lx PBS na 4 cm2 plochy). Po 5 minutách byl pufr odstraněn a nahrazen novým o stejném složení. Tento krok byl opakován ještě jednou.
E) Následně byl pufr odstraněn. Vzorky byly 10 minut permeabilizovány 0,2% (obj./obj.) roztokem Tritonu X-100 v lx PBS (přibližně 1 až 2 ml permeabilizačního roztoku na 4 cm2 plochy). Po odstranění permeabilizačního roztoku byly vzorky převrstveny lx PBS (přibližně 1 až 2 ml lx PBS na 4 cm2 plochy).
F) Po 5 minutách byl roztok lx PBS odstraněn a nahrazen stejným množstvím téhož roztoku. Tento krok byl opakován ještě jednou.
G) Skla se vzorky byla vyjmuta pomocí pinzety z Petriho misky a přebytek pufru byl odsát pomocí filtračního papíru tak, že skla se vzorky byla položena stranou bez vzorků na filtrační papír. Skla se vzorky byla položena na kapky lx PBS na parafilmu (150 μΐ/kapka, tato velikost byla použita vždy, pokud není uvedeno jinak). Skla směřovala vrstvou se vzorky směrem dolů do kapky.
H) Vzorky byly inkubovány 30 minut na teplotě místnosti na 40 μΐ kapkách reakční směsi obsahující DNA polymerázu I nebo AMV reverzní transkriptázu (konečná koncentrace byla 0,1 nebo 0,2 nebo 0,5 nebo 1 U. μΓ1; definice jednotky použitých enzymů viz část Použité roztoky a chemikálie), lx pufr pro DNA polymerázu I respektive AMV reverzní transkriptázu (složení pufrů viz část Použité roztoky a chemikálie), dATP, dGTP a dCTP (alternativně 0,005 nebo 0,05 nebo 0,5 mmol.F1), biotin-dUTP nebo digoxigenin-dUTP (alternativně 0,001 nebo 0,0125 nebo 0,125 mmol.F1). V některých provedeních byly vynechány dATP, dGTP nebo dCTP. V jiných provedeních byl přidán dTTP (alternativně 0,001 nebo 0,005 nebo 0,0125 nebo 0,125 mmol.F1).
V dalších provedeních byl použit namísto značeného deoxyuridinu trifosfátu biotin-7-dATP nebo biotin—11—dATP nebo biotin—11—dCTP v koncentraci alternativně 0,001 nebo 0,0125 nebo 0,125 mmol.F1. V případě použití biotin-7-dATP nebo biotin—11-dATP směs obsahovala rovněž dGTP, dCTP a dTTP (alternativně 0,005 nebo 0,05 nebo 0.5 mmol.F1). V případě použití biotin11-dCTP směs rovněž obsahovala dATP, dGTP nebo dTTP (alternativně 0,005 nebo 0,05 nebo 0,5 mmol.F1).
I) Skla se vzorky byla přenesena na kapku 25 mmol.F1 Tris-HCl, pH = 7,5 a 150 mmol. 1 1 NaCI. Po 5 minutách byla skla se vzorky přenesena na novou kapku 25 mmol.F1 Tris-HCl, pH = 7,5 a 150 mmol.F1 NaCI. Tento krok byl ještě jednou opakován.
J) Vzorky byly následně inkubovány 30 minut na 40 μΐ kapkách s králičí protilátkou rozeznávající biotin-dUTP ředěnou ve 25 mmol.l1 Tris-HCl, pH = 7,5 a 150 mmol.l 1 NaCI (koncentrace protilátky byla 5 μg/ml) nebo s myší protilátkou rozeznávající digoxigenin-dUTP ředěnou ve 25 mmol.F1 Tris-HCl, pH = 7,5 a 150 mmol.F1 NaCI (koncentrace protilátky byla 5 pg/ml).
-4CZ 307304 B6
K) Skla se vzorky byla přenesena na kapku 25 mmol.l“1 Tris-HCl, pH = 7,5 a 150 mmol.l 1 NaCl. Po 5 minutách byla skla se vzorky přenesena na novou kapku 25 mmol.L1 Tris-HCl, pH = 7,5 a 150 mmol.l1 NaCl. Tento krok byl ještě jednou opakován.
L) Skla se vzorky byla inkubována 30 minut ve směsi sekundární protilátky a 1 pmol.l 1 DAP1 ředěných 25 mmol.l1 Tris-HCl, pH = 7,5 a 150 mmol.l1 NaCl na kapkách o velikosti 40 μΐ. Sekundární protilátky byly ředěny v poměru 1:100. V případě použití biotinylovaných nukleotidů byla použita kozí protilátka namířená proti králíkovi konjugovaná s fluorochromem Alexa Fluor 488, v případě digoxigenin-dUTP byla použita kozí protilátka namířená proti myši konjugovaná s fluorochromem Alexa Fluor 488.
M) Skla se vzorky byla přenesena na kapku 25 mmol.l1 Tris-HCl, pH = 7,5 a 150 mmol.F1 NaCl. Po 5 minutách byla skla se vzorky přenesena na novou kapku 25 mmol.r1 Tris-HCl, pH =
7,5 a 150 mmol.l1 NaCl. Tento krok byl ještě jednou opakován.
N) Nakonec byl 25 mmol.l1 Tris-HCl, pH = 7,5 a 150 mmol.l1 NaCl ze skel odsát pomocí filtračního papíru a následně byla skla položena na kapičky (3 μΐ) připraveného montovacího média na podložním skle (roztok: 90% glycerol (obj./obj.), 50 mM Tris, pH 8, 2,5% 1,4diazabicyclo[2.2.2]oktan (hmotnost/obj.)). Vzorky směřovaly do kapičky roztoku. Jemným tlakem pomocí pinzety na horní stranu skel se vzorky došlo k roztažení roztoku média po celé ploše skel. Následně byly okraje skel zalakovány pomocí rychleschnoucího laku. Signál byl detekován pomocí fluorescenčního mikroskopu. Příklad detekce mykoplazmatické infekce u HeLa buněk pomocí biotin-dUTP je na obrázku 1. Příklad HeLa buněk, které nejsou nakaženy mykoplazmaty je na obrázku 2.
Příklad 2
Detekce mykoplazmat přisedlých na sklíčkách bez přítomnosti živočišných buněk.
Následující postup popisuje způsob detekce mykoplazmat přisedlých na sklíčkách bez přítomnosti živočišných buněk. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.
Vzorky byly promyty pufrem (lx PBS, přidány byly přibližně 1 až 2 ml pufru na 4 cm2 plochy) a následně bylo postupováno podle kroku C až N příkladu 1 s těmito rozdíly:
1) V kroku L nebyla použita DAPI.
Příklad 3
Detekce mykoplazmatických kontaminací v kultuře eukaryotických buněk kultivovaných v suspenzi.
Následující postup popisuje způsob detekce mykoplazmatických kontaminací v kultuře eukaryotických buněk kultivovaných v suspenzi. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.
A) Lidské HeLa S3 buňky (dále jen vzorky) byly pěstovány v kultivačních lahvích (objem lahví byl 50 ml), které byly třepány, v růstovém médiu S-MEM (modifikace Eaglova minimálního média pro suspenzní buňky, Sigma) s 3% (hmotnost/obj.) L-glutaminem, 5% (obj./obj.) fetálním telecím sérem (Life Technologies) a 50 pg/ml gentamicinem v atmosféře s 5% (obj./obj.) CO2 při 37 °C. Buněčná suspenze obsahovala přibližně 5 až 8 x 105 buněk na 1 mililitr.
-5CZ 307304 B6
B) Druhý den byla suspenze buněk přenesena do 15 mililitrové centrifugační zkumavky a vzorky byly odstřeďovány 10 minut při 300 g. Supematant byl odstraněn (ve zkumavce bylo ponecháno 200 μΐ média) a ke vzorkům bylo přidáno nové médium (10 ml). Vzorky byly rozsuspendovány a následně opět odstřeďovány 10 minut při 300 g. Supematant byl odstraněn (ve zkumavce bylo ponecháno 200 μΐ média) a k peletu vzorků byl přidán 1 ml nového média. Pelet vzorků byl rozsuspendován.
C) 50 μΐ kapka suspenze buněk byla přenesena na kruhová skla o průměru 12 mm potažená vrstvou poly-L-lysinu (způsob přípravy těchto skel je popsán v části Použité roztoky a chemikálie). Po 2 minutách byl přebytek média odsát pomocí filtračního papíru tak, že byl filtrační papír jemně přiložen k hraně skla. Skla byla položena alternativně do 0,5% nebo 1% nebo 2% (hmotnost/obj.) roztoku formaldehydu v Petriho misce a vzorky byly fixovány 10 minut. Skla byla umístěna do Petriho misek tak, že směřovala vzorky nahoru do roztoku.
D) V dalších krocích bylo postupováno podle bodů D-N příkladu 1.
Příklad 4
Detekce mykoplazmatických kontaminací v kultuře eukaryotických buněk kultivovaných na vnitřním povrchu kultivačních destiček.
Následující postup popisuje způsob detekce mykoplazmatických kontaminací v kultuře eukaryotických buněk kultivovaných na vnitřním povrchu kultivačních destiček. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.
Postup je stejný jako v případě přisedlých buněk (příklad 1, body A-N) s následujícími rozdíly:
1) Veškeré inkubace byly provedeny v jamkách 96-jamkových destiček.
2) Při inkubacích s protilátkami bylo použito 50 μΐ roztoku.
3) V případě promývání bylo použito 100 μΐ roztoku.
4) Na konci protokolu (bod N příkladu 1) se z jednotlivých vzorků odstraní 25 mmol.l1 TrisHC1, pH = 7,5 a 150 mmol.r1 NaCl a nahradí se 100 pL směsi 90% glycerol (obj./obj.), 50 mM Tris, pH 8, 2,5% l,4-diazabicyclo[2.2.2]oktan (hmotnost/obj.).
Příklad 5
Detekce mykoplazmat přisedlých na vnitřním povrchu kultivačních destiček bez přítomnosti živočišných buněk.
Následující postup popisuje způsob detekce mykoplazmat přisedlých na vnitřním povrchu kultivačních destiček bez přítomnosti živočišných buněk. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.
Postup byl stejný jako v příkladu 2 s těmito rozdíly:
1) Veškeré inkubace byly provedeny v jamkách 96-jamkových destiček.
-6CZ 307304 B6
2) Při inkubacích s protilátkami bylo použito 50 μΙ roztoku.
3) V případě promývání bylo použito 100 μΐ roztoku.
4) Na konci protokolu se z jednotlivých vzorků odstraní 25 mmol.l“1 Tris-HCl, pH = 7,5 a 150 mmol.l1 NaCl a nahradí se 100 pL směsi 90% glycerol (obj./obj.), 50 mM Tris, pH 8, 2,5%) l,4-diazabicyclo[2.2.2]oktan (hmotnost/obj.).
5) V některých provedeních byly protilátky rozeznávající protilátky namířené proti biotinu nebo digoxigeninu konjugovaný s peroxidázou a jako substrát byl použit 1-Step™ Ultra TMB-ELISA Substráte Solution (ThermoFisher Scientifíc, kat. č. 34028). V těchto případech byla pro detekci signálu použita čtečka destiček.
Použité roztoky a chemikálie:
1. Fosfátem pufrovaný fyziologicky roztok (PBS) lOx PBS (desetinásobně koncentrovaný roztok PBS):
1,4 mol.F1 NaCl mmol.l1 KC1 mmol.l1 Na2HPO4 mmol.F1 KH2PO4
Uvedené složky byly rozpuštěny v destilované vodě a pH bylo upraveno do rozmezí 7,3 až 7,4 lx PBS (fosfátem pufrovaný fyziologický roztok v obvyklé koncentraci)
2. Příprava polylysinových skel pro ukotvení suspenzních buněk
Kruhová skla s průměrem 12 mm byla vložena do 50 ml kádinky s 20 ml 96% (obj./obj.) etanolu. Po 10 minutách byla pomocí pinzety přenesena do Petriho misky vyložené filtračním papírem a usušena. Skla byla následně na dobu 1 minuty ponořena do 0,01% (hmotnost/obj.) roztoku poly-L-lysinu v DMEM, následně byla ponořena na 30 sekund do lx PBS a pak ještě jednou na 30 sekund do nového lx PBS. Tento krok byl ještě 3x opakován. Nakonec byla skla položena na filtrační papír a usušena.
3. Složení lOxpufrupro DNA polymerázu I
500 mmol.l“1 Tris-HCl (pH 7,5 @ 25 °C), 100 mmol.l“1 MgCl2, 10 mmol.l“1 DTT ((±)-threo1,4-Dimercapto-2,3-butanediol)
4. Složení lOxpufrupro AMVreverzní transkriptázu
250 mmol.l“1 Tris-HCl (pH 8,3 @ 25 °C), 250 mmol.l“1 KC1, 50 mmol.l“1 MgCl2, 2,5 mmol.l“1 spermidin a 50 mmol.l 1 DTT ((±)-threo-l,4-Dimercapto-2,3-butanediol).
5. Definice jednotky použitých enzymů
DNA polymeráza I
Jedna jednotka (U) enzymu katalyzuje za 30 minut inkorporaci 10 nmol deoxyribonukleotidů do polynukleotidové frakce při teplotě 37 °C.
-7CZ 307304 B6
AMV reverzní transkriptáza
Jedna jednotka (U) enzymu katalyzuje přenos 1 nmol deoxynukleotidů do materiálu, který je možné precipitovat v kyselém prostředí, v průběhu 10 minut při teplotě 37 °C.
Průmyslová využitelnost
Způsob přípravy fixovaných a permeabilizovaných mykoplazmat pro jejich následnou detekci a sada pro detekci mykoplazmat jsou využitelné pro detekce mykoplazmatických infekcí na pracovištích, které se věnují pěstování buněčných linií, a rovněž v obecných případech potřeby identifikace mykoplazmat. Způsob a sada jsou nezávislé na druhu mykoplazmat.
Claims (6)
1. Sada pro přípravu fixovaných a permeabilizovaných mykoplazmat pro jejich následnou detekci, vyznačující se tím, že obsahuje enzym ze skupiny DNA polymeráz, s výhodou DNA polymerázu I nebo enzym ze skupiny reverzních transkriptáz, s výhodou AMV reverzní transkriptázu, pufr pro enzym ze skupiny DNA polymeráz, s výhodou pufr pro DNA polymerázu I nebo pufr pro enzym ze skupiny reverzních transkriptáz, s výhodou pufr pro AMV reverzní transkriptázu, nukleotid trifosfát konjugovaný s biotinem nebo nukleotid trifosfát konjugovaný s digoxigeninem, dále tyto nukleotidy: 2'-deoxyadenosin-5'-trifosfát a/nebo 2'-deoxyguanosin5'-trifosfát a/nebo 2'-deoxycytidin-5'-trifosfát a/nebo 2'-deoxytymidin-5'-trifosfát a protilátky proti biotinu nebo digoxigeninu.
2. Způsob přípravy fixovaných a permeabilizovaných mykoplazmat pro jejich následnou detekci pomocí sady podle nároku 1, vyznačující se tím, že se ke vzorkům fixovaných a permeabilizovaných mykoplazmat na podložkách přidá reakční směs obsahující značený nukleotid a enzym ze skupiny DNA polymeráz nebo reverzních transkriptáz a tato směs je inkubována se vzorkem.
3. Způsob přípravy fixovaných a permeabilizovaných mykoplazmat pro jejich následnou detekci podle nároku 2, vyznačující se tím, že se jako enzym použije DNA polymeráza I.
4. Způsob přípravy fixovaných a permeabilizovaných mykoplazmat pro jejich následnou detekci podle nároku 2, vyznačující se tím, že se jako enzym použije AMV reverzní transkriptáza.
5. Způsob přípravy fixovaných a permeabilizovaných mykoplazmat pro jejich následnou detekci podle některého z nároků 2 až 4, vyznačující se tím, že reakční směs z nároku 2 obsahuje rovněž 2'-deoxyadenosin-5'-trifosfát a/nebo 2'-deoxyguanosin-5'-trifosfát a/nebo 2'deoxycytidin-5'-trifosfát a/nebo 2'-deoxytymidin-5'-trifosfát.
6. Způsob přípravy fixovaných a permeabilizovaných mykoplazmat pro jejich následnou detekci podle některého z nároků 2 až 5, vyznačující se tím, že se jako značený nukleotid použije nukleotid konjugovaný s biotinem nebo digoxigeninem.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2016-775A CZ307304B6 (cs) | 2016-12-08 | 2016-12-08 | Sada pro přípravu a způsob přípravy fixovaných a permeabilizovaných mykoplazmat pro jejich následnou detekci |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2016-775A CZ307304B6 (cs) | 2016-12-08 | 2016-12-08 | Sada pro přípravu a způsob přípravy fixovaných a permeabilizovaných mykoplazmat pro jejich následnou detekci |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2016775A3 CZ2016775A3 (cs) | 2018-05-23 |
| CZ307304B6 true CZ307304B6 (cs) | 2018-05-23 |
Family
ID=62235668
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2016-775A CZ307304B6 (cs) | 2016-12-08 | 2016-12-08 | Sada pro přípravu a způsob přípravy fixovaných a permeabilizovaných mykoplazmat pro jejich následnou detekci |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ307304B6 (cs) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0250662A1 (en) * | 1986-06-25 | 1988-01-07 | The Regents Of The University Of California | Detection of mycoplasma by DNA hybridization |
| CN104988242A (zh) * | 2015-08-11 | 2015-10-21 | 上海睿玻生物科技有限公司 | Pcr-荧光探针法检测人型支原体核酸试剂盒及其检测方法 |
-
2016
- 2016-12-08 CZ CZ2016-775A patent/CZ307304B6/cs not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0250662A1 (en) * | 1986-06-25 | 1988-01-07 | The Regents Of The University Of California | Detection of mycoplasma by DNA hybridization |
| CN104988242A (zh) * | 2015-08-11 | 2015-10-21 | 上海睿玻生物科技有限公司 | Pcr-荧光探针法检测人型支原体核酸试剂盒及其检测方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| DREXLER H. G. et al.: „Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention", Cytotechnology, vol. 39, 2002, str. 75 – 90 * |
| GARNER C. M. et al.: „Mycoplasma detection in cell cultures: a comparison of four methods", British Journal of Biomedical Science, vol. 57, no. 4, 2000, str. 295 – 301, ISSN: 1073-6085 * |
| JOHANSSON K.–E. et al.: „Evaluation and practical aspects of the use of a commercial DNA probe for detection of mycoplasma infections in cell cultures", Journal of Biochemical and Biophysical Methods, vol. 19, no. 2 - 3, 1989, str. 185 – 199 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ2016775A3 (cs) | 2018-05-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9228240B2 (en) | Methods for detecting and quantifying viable bacterial endo-spores | |
| US7049103B2 (en) | Method of evaluating drug efficacy and toxicity | |
| JP6262533B2 (ja) | Ｄｎａインサイチュハイブリダイゼーションのための方法、プローブ及びキット、並びにそれらの使用 | |
| Wolbers et al. | Viability study of HL60 cells in contact with commonly used microchip materials | |
| US11739321B2 (en) | Compositions and methods for genomic DNA and gene expression analysis in single cells | |
| CN111556900A (zh) | 包括胺的聚合酶链反应组合物 | |
| Zhang et al. | High-throughput screening of drugs against the growth of Cryptosporidium parvum in vitro by qRT-PCR | |
| CN102703603A (zh) | 通用型甲型流感病毒(iav)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒 | |
| US6261773B1 (en) | Reagent for nucleic acid amplification and process for nucleic acid amplification | |
| US9567648B1 (en) | Detection of foaming and bulking bacteria in wastewater | |
| Bonar et al. | E. coli 6S RNA complexed to RNA polymerase maintains product RNA synthesis at low cellular ATP levels by initiation with noncanonical initiator nucleotides | |
| JPWO2021095797A1 (ja) | 未分化細胞検出法 | |
| CZ307304B6 (cs) | Sada pro přípravu a způsob přípravy fixovaných a permeabilizovaných mykoplazmat pro jejich následnou detekci | |
| Hara et al. | Cyclin A2-CDK2 regulates embryonic gene activation in 1-cell mouse embryos | |
| Woll et al. | Analysis of embryonic stem cell-derived osteogenic cultures | |
| Panning | X inactivation in mouse ES cells: histone modifications and FISH | |
| Abdukhakimova et al. | Characterizationharacterization of extremophilic actinomycetes strains as sources of antimicrobial agents | |
| Meštrović et al. | Antimicrobial resistance screening in Chlamydia trachomatis by optimized McCoy cell culture system and direct qPCR-based monitoring of chlamydial growth | |
| JP5662161B2 (ja) | 生物材料中の細菌のインビトロ検出及び／又は定量及び／又は同定の方法 | |
| CZ2014579A3 (cs) | Způsob stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v buňkách, tkáních a organismech | |
| Koke et al. | A succinic dehydrogenase activity in “mesosomes” of Neurospora crassa | |
| JP7370602B2 (ja) | 未分化細胞の分化抵抗性評価法 | |
| KR101771128B1 (ko) | 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 | |
| CZ28964U1 (cs) | Sada pro zpřístupnění specifických pyrimidinových nukleosidů ve struktuře dvouřetězcové DNA pro reakci s protilátkami, které s těmito nukleosidy reagují | |
| Saito et al. | Behavior of MC3T3-E1 osteoblast-like cells cultured on a glass substrate with different surface roughness |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20211208 |