CZ28964U1

CZ28964U1 - Sada pro zpřístupnění specifických pyrimidinových nukleosidů ve struktuře dvouřetězcové DNA pro reakci s protilátkami, které s těmito nukleosidy reagují

Info

Publication number: CZ28964U1
Application number: CZ2015-31075U
Authority: CZ
Inventors: Karel Koberna; Anna Ligasová
Original assignee: Univerzita PalackĂ©ho v Olomouci
Priority date: 2015-05-12
Filing date: 2015-05-12
Publication date: 2015-12-14

Description

Úřad průmyslového vlastnictví v zápisném řízení nezjišťuje, zda předmět užitného vzoru splňuje podmínky způsobilosti k ochraně podle § 1 zák. č. 478/1992 Sb.

CZ 28964 Ul

Sada pro zpřístupnění specifických pyrimidinových nukleosidů ve struktuře dvouřetězcové DNA pro reakci s protilátkami, které s těmito nukleosidy reagují

Oblast techniky

Sada umožňuje zpřístupnění specifických pyrimidinových nukleosidů ve dvouřetězcové DNA. Příkladem takových nukleosidů je 5-bromo-2’-deoxyuridin, 5-chloro-2’-deoxyuridin nebo 5 -j odo-2 ’ -deoxyuridin.

Dosavadní stav techniky

Pyrimidinové nukleosidy jsou široce používané při detekci replikační aktivity. Příkladem těchto nukleosidů je 5-bromo-2’-deoxyuridin (BrdU), 5-chloro-2’-deoxyuridin (CldU) nebo 5-jodo-2’deoxyuridin (IdU), dále jen „značené nukleosidy“. Použití značených nukleosidů a specifických protilátek, které rozeznávají tyto nukleosidy, dovoluje např. rychlou analýzu buněčných populací z hlediska jejich proliferační aktivity.

Jelikož značené nukleosidy jsou ve struktuře dvouřetězcové DNA zpravidla nepřístupné pro reakci s protilátkou, je pro jejich zpřístupnění nutné použít speciální kroky (Genes Dev, 14, 28552868; J Cell Sci, 115, 4037-4051; PLoS One, 7, e52584; Histochemistry, 98, 199-205; Cytometry 14, 640-648), které jsou naprosto klíčové např. pro následující detekce nebo izolace dvouřetězcové DNA. Příkladem těchto kroků je použití roztoků kyseliny chlorovodíkové (HC1, depurinace), hydroxidu sodného (rozvolnění struktury DNA v důsledku deprotonace nukleobází), použití jednomocné mědi v kombinaci s exonukleázou III nebo jen samotné jednomocné mědi, použití DNázy I nebo směsi DNázy I a exonukleázy, případně samotné exonukleázy a to v případě, kdy dochází k fyzickému narušení DNA např. krájením vzorků. V závislosti na typu zpřístupnění a intenzitě působení dochází k menším nebo větším poškozením DNA a rovněž dalších buněčných složek. Obecně systémy, které jsou založeny na působení enzymů, jsou šetrnější k buněčné struktuře než neenzymatické přístupy. Na druhou stranu čistě enzymatické přístupy nedovolují takovou míru zpřístupnění značených nukleosidů jako neenzymatické přístupy a/nebo vyžadují silnou destrukci DNA, což může vést k problémům při stanovení obsahu DNA a zkreslení cytometrických analýz založených na obsahu DNA.

Podstata technického řešení

Předkládaná přihláška užitného vzoru popisuje sadu umožňující efektivní zpřístupnění pyrimidinových nukleosidů ve struktuře dvouřetězcové DNA pro reakci se specifickými protilátkami. Sada je založena na působení vodného roztoku nízkých koncentrací kyselin a následném použití exonukleázy III. Běžně používané koncentrace kyselin, které jsou dostatečné pro zpřístupnění značených nukleosidů, se pohybují v oblasti od 2 do 4 mol.l·¹. V námi vyvinuté sadě se podle našich pozorování optimální koncentrace kyseliny pohybuje mezi 40 až 80 mmol.l·¹, přičemž pro zpřístupnění je výhodné vzorky třepat např. na laboratorní třepačce. Za pomoci vyvinuté sady jsou buňky nebo tkáně s inkorporovánými značeným nukleosidy nejprve inkubovány v nízké koncentraci kyseliny, následně je roztok kyseliny odstraněn a nahrazen promývacím roztokem, s výhodou obsahující tris(hydroxymetyl)aminometan s HC1 (Tris-Cl). Po tomto kroku následuje inkubace s exonukleázou III. S výhodou směs s exonukleázou III obsahuje i specifickou protilátku rozeznávající značený nukleosid. Rovněž s výhodou je po reakci se specifickou protilátkou rozeznávající značené nukleosidy použita inkubace ve formaldehydu. Sada je použitelná jak pro přisedlé buňky, tak pro buňky pěstované v suspenzi nebo tkáně. Sada dovoluje snadnou identifikaci populace značených buněk pomocí histogramu jaderných signálů (Obrázek 1). Ve srovnání s přístupy založenými na vysokých koncentracích HC1 dochází pouze k nízké degradaci DNA. To umožňuje provádět spolehlivé analýzy buněčného cyklu založené na obsahu DNA (Obrázek 2). Objasnění výkresů

Obr. 1 Na obrázku 1 je znázorněn histogram signálu v jádrech HeLa buněk inkubováných jednu hodinu s 10 pmol.l'¹ BrdU a následně zpracovaných podle Příkladu 1.

-1 CZ 28964 Ul

Obr. 2 Na obrázku 2 je znázorněno porovnání obsahu DNA po použití vyvinuté sady (A) a po použití 2 mol.l·¹ (B) nebo 4 mol.l¹ HC1 (C). DNA byla značena pomocí DAPI. Jaderný signál byl změřen pomocí mikroskopické analýzy obrazu.

Seznam použitých zkratek

HeLa

DMEM

PBS

BrdU

CldU

IdU

S-MEM

HC1

H₂SO₄

HI

HBr

Tris buněčná linie lidských epiteliálních buněk

Dulbeccova modifikace Eaglova média fosfátem pufrovaný fyziologický roztok

5-bromo-2 ’ -deoxyuridin

-chloro-2 ’ -deoxyuridin

-j odo-2 ’ -deoxyuridin modifikace Eaglova minimálního média pro suspenzní buňky kyselina chlorovodíková kyselina sírová kyselina j odo vodíková kyselina bromovodíková tris(hydroxymetyl)aminometan

Příklady uskutečnění technického řešení

Příklad 1

Zpřístupnění a detekce míst s inkorporovaným BrdU, CldU nebo IdU ve struktuře DNA pomocí nízké koncentrace kyseliny a exonukleázy III v buňkách přisedlých na podložních sklíčkách.

Následující postup popisuje zpřístupnění a detekci míst v DNA s inkorporovaným BrdU, CldU nebo IdU v HeLa buňkách přisedlých na podložních sklíčkách. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.

A) Lidské HeLa buňky (dále jen vzorky) byly pěstovány v Petriho miskách na kruhových sklech o průměru 12 mm v růstovém médiu DMEM s L-glutaminem (Gibco) s 10% (obj./obj.) fetálním telecím sérem (PAA Laboratories), 1% (obj./obj.) gentamicinem a 3,7 g/l NaHCO₃ v atmosféře s 5% (obj./obj.) CO₂ při 37 °C.

B) Druhý den po pasáži byl do růstového média přidán BrdU v konečné koncentraci 10 pmol.l·¹. Vzorky byly inkubovány alternativně 10, 20, 40 nebo 60 minut nebo 24 hodin v atmosféře s 5% (obj./obj.) CO₂ při 37 °C. Alternativně byl do růstového média přidán CldU nebo IdU ve stejné koncentraci jako BrdU.

C) Následně bylo růstové médium odstraněno a nahrazeno pufrem (lx PBS, složení viz část Použité roztoky a chemikálie, přidány byly přibližně 1 až 2 ml pufru na 4 cm² plochy).

D) Pufr byl odstraněn a vzorky byly 10 minut fixovány 2% (hmotnost/obj.) roztokem formaldehydu v lx PBS (pH 7,4; 1 až 2 ml fixačního roztoku na 4 cm² plochy).

Alternativně byly vzorky fixovány metanolem a následně acetonem. V tomto případě byla skla se vzorky nejdříve inkubována 10 minut v metanolu při teplotě -20 °C (přibližně 1 až 2 ml metanolu na 4 cm² plochy) a následně ponořena na 30 sekund do kádinky s 50 ml acetonu o teplotě místnosti, skla se vzorky pak byla usušena a po usušení položena do Petriho misky s lx PBS. V případě použití metanolu a acetonu následoval krok G).

-2CZ 28964 Ul

E) Roztok formaldehydu byl odstraněn a vzorky byly převrstveny lx PBS (přibližně 1 až 2 ml lx PBS na 4 cm² plochy). Po 5 minutách byl pufr odstraněn a nahrazen novým o stejném složení. Tento krok byl opakován ještě jednou.

F) Následně byl pufr odstraněn. Vzorky byly 10 minut permeabilizovány 0,2% (obj./obj.) roztokem Tritonu X-100 v lx PBS (přibližně 1 až 2 ml permeabilizačního roztoku na 4 cm² plochy). Po odstranění permeabilizačního roztoku byly vzorky převrstvenylx PBS (přibližně 1 až 2 ml lx PBS na 4 cm² plochy).

G) Po 5 minutách byl roztok lx PBS odstraněn a nahrazen stejným množstvím téhož roztoku. Tento krok byl opakován ještě jednou.

H) Z misek byl odstraněn roztok lx PBS, vzorky byly převrstveny roztokem obsahujícím alternativně 10, 20, 40, 80, 160 nebo 320 mmol.l’¹ HC1 nebo H2SO4 nebo HI nebo HBr (přibližně 1 až 2 ml roztoku na 4 cm² plochy).

I) Petriho misky se vzorky na sklech byly přemístěny na třepačku (Thermomixer comfort, Eppendorf) a zde byly inkubovány alternativně 1, 2, 5, 10, 20, 30 nebo 60 minut při rychlosti 300 otáček/minutu. V některých provedeních inkubace v roztoku kyseliny proběhla bez třepání.

J) Inkubační roztok byl odstraněn a vzorky byly převrstveny roztokem 100 mmol.l·¹ Tris-Cl, pH 7,5 (přibližně 1 až 2 ml roztoku na 4 cm² plochy). Po jedné minutě byl roztok 100 mmol.l’¹Tris-Cl odstraněn a nahrazen stejným množstvím roztoku. Tento krok byl opakován ještě jednou. Alternativně byl namísto roztoku Tris-Cl použit roztok lx PBS.

K) Petriho misky se vzorky na sklech byly přemístěny na třepačku (Thermomixer komfort, Eppendorf) a zde byly inkubovány 10 minut při rychlosti 300 otáček/minutu. Alternativně byl tento krok vynechán.

L) Skla se vzorky byla vyjmuta pomocí pinzety z Petriho misky a přebytek roztoku byl odsát pomocí filtračního papíru tak, že skla se vzorky byla položena stranou bez vzorků na filtrační papír. Skla se vzorky byla položena na kapky 100 mmol.l’¹ Tris-Cl, pH 7,5 na parafilmu (50 μΐ/kapka). Alternativně byl namísto Tris-Cl použit roztok lx PBS. Skla směřovala vrstvou se vzorky směrem dolů do kapky.

M) Následně byly vzorky inkubovány alternativně 5, 10, 30 nebo 60 minut s protilátkou namířenou proti BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU (v koncentraci 1 až 100 pg/ml) konjugovanou nebo nekonjugovanou s fluorochromem a exonukleázou III (ÍU/μΙ. Fermentas viz část Použité roztoky a chemikálie) v roztoku lx pufru pro exonukleázu III (66 mmol.l’¹ Tris (pH 8,0 při 30 °C), 0,66 mmol.l'¹ MgCl₂, viz část Použité roztoky a chemikálie) na kapkách o velikosti 20 μΐ alternativně při teplotě 10, 20, 25, 37 nebo 40 °C. V některých provedeních byla inkubace s protilátkou provedena ve zvláštním kroku po inkubaci s exonukleázou III. V těchto provedeních byla skla po inkubaci s exonukleázou III buď nejprve promyta stejně jako v kroku N nebo nepromyta a následně položena na kapky o velikosti 20 μΐ obsahující protilátku namířenou proti BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU ve 100 mmol.l'¹ Tris-Cl a 100 mmol.l'¹ NaCl, pH 7,5). Alternativně byl namísto roztoku Tris-Cl s NaCl použit roztok lx PBS.

N) Skla se vzorky byla přenesena na kapku roztoku 100 mmol.l'¹ Tris-Cl a 100 mmol.l¹ NaCl, pH7,5. Po 5 minutách byla skla se vzorky přenesena na novou kapku roztoku 100 mmol.l·¹Tris-Cl a 100 mmol.l’¹ NaCl, pH 7,5 stejného složení. Alternativně byl namísto roztoku Tris-Cl sNaCl použit roztok lx PBS. V případě použití protilátky konjugované s fluorochromem byla následně skla se vzorky přenesena na kapku destilované vody (50 μΐ). Po 5 minutách byla skla se vzorky přenesena na novou kapku destilované vody. Tento krok byl ještě třikrát opakován. Pak následoval bod T. V případě použití protilátky bez fluorochromu následoval bod R.

V některých provedeních byl krok N vynechán a pokračovalo se okamžitě po kroku M volitelnými kroky O až Q.

Kroky O až Q jsou volitelné kroky pro zvýšení signálu.

-3CZ 28964 Ul

O) Skla se vzorky byla přenesena na kapku roztoku lx PBS. Okamžitě nebo po 5 minutách byla skla se vzorky přenesena na novou kapku roztoku lx PBS. Tento krok byl ještě jednou opakován.

P) Skla se vzorky byla okamžitě přenesena na kapku roztoku 2% formaldehydu v lx PBS a inkubována alternativně po dobu 10, 20 nebo 30 minut při teplotě místnosti. Následně byla skla se vzorky přenesena na kapku roztoku lx PBS. Po 5 minutách byla skla se vzorky přenesena na novou kapku roztoku lx PBS a následně ještě na jednu kapku lx PBS. V případě, že byla použita protilátka konjugovaná s fluorochromem, následoval bod S. V případě, že byla použita nekonjugovaná protilátka, následoval bod Q.

Q) Skla se vzorky byla přenesena na kapku roztoku 100 mmol.l’¹ Tris-Cl a 100 mmol.l'¹ NaCl, pH 7,5. Po 5 minutách byla skla se vzorky přenesena na novou kapku roztoku 100 mmol.l'¹Tris-Cl a 100 mmol.l¹ NaCl, pH 7,5 stejného složení. Tento krok byl ještě jednou opakován. V některých provedeních byl tento krok vynechán.

R) Skla se vzorky byla inkubována 30 minut s protilátkou konjugovanou s fluorochromem Cy3 reagující s protilátkou proti BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU (1 až 100 pg/ml ve 100 mmol.l'¹Tris-Cl a 100 mmol.l'¹ NaCl, pH 7,5) na kapkách o velikosti 20 pl. Alternativně byl namísto roztoku Tris-Cl s NaCl použit roztok lx PBS.

S) Skla se vzorky byla přenesena na kapku 100 mmol.l'¹ Tris-Cl a 100 mmol.l'¹ NaCl, pH7,5 (50 pl). Po 5 minutách byla skla s buňkami přenesena na novou kapku 100 mmol.l'¹ Tris-Cl a 100 mmol.l'¹ NaCl, pH 7,5stejného složení. Tento krok byl ještě třikrát opakován. Alternativně byl namísto roztoku Tris-Cl použit roztok lx PBS. Následně byla skla se vzorky přenesena na kapku destilované vody (50 pl). Po 5 minutách byla skla se vzorky přenesena na novou kapku destilované vody. Tento krok byl ještě třikrát opakován.

T) Nakonec byla voda ze skel odsáta pomocí filtračního papíru, skla byla položena na nový filtrační papír vzorky nahoru a usušena.

U) Po usušení byla skla položena na kapičky (3 pl) připraveného roztoku 50% glycerinu na podložním skle. Vzorky směřovaly do kapičky roztoku. Jemným tlakem pomocí pinzety na horní stranu skel se vzorky došlo k roztažení roztoku po celé ploše skel. Signál byl detekován pomocí fluorescenčního mikroskopu.

Příklad 2

Zpřístupnění a detekce míst s inkorporovaným BrdU, CldU nebo IdU ve struktuře DNA pomocí nízké koncentrace kyseliny a exonukleázy III ve tkáních.

Následující postup popisuje zpřístupnění a detekci míst s inkorporovaným BrdU, CldU nebo IdU ve tkáních po působení nízké koncentrace kyseliny a exonukleázy III. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.

A) Třídenní potkaní samci byli usmrceni dekapitací a následně jim byla vyjmuta játra. Játra byla nakrájena na malé kousky (3 mm - nejdelší rozměr) a položena do Petriho misek s HeLa buňkami inkubovánými jeden den v růstovém médiu DMEM s L-glutaminem (Dulbeccova modifikace Eaglova média, Gibco) s 10% (obj./obj.) fetálním telecím sérem (PAA Laboratories), 1% (obj./obj.) gentamicinem a 3,7 g/1 NaHCO₃. Do média s kousky jater byl přidán BrdU v konečné koncentraci 10 pmol.l'¹ a játra byla v tomto médiu inkubována 30 minut v atmosféře s 5% (obj ./obj.) CO₂ při 37 °C. Alternativně byl do růstového média namísto BrdU přidán IdU nebo CldU ve stejné koncentraci jako BrdU.

B) Následně bylo růstové médium odstraněno a kousky jater byly převrstveny pufrem (lx PBS, složení viz část Použité roztoky a chemikálie, přidány byly přibližně 1 až 2 ml pufru na 4 cm²plochy). Po 5 minutách byl pufr odstraněn a nahrazen stejným množstvím lx PBS stejného složení. Tento krok byl ještě jednou opakován.

C) Kousek jater byl dán mezi dvě kruhová skla o průměru 12 mm potažené 1% (hmotnost/obj.) želatinou a tkáň byla roztažena po povrchu skel pomocí jemného tlaku pinzetou na sklo. Skla

-4CZ 28964 Ul byla oddělena a obě byla dána do Petriho misky s lx PBS a to tak, že skla směrovala vzorky tkání nahoru do roztoku.

D) V dalších krocích bylo postupováno dle kroků uvedených v Příkladu 1 (D-U).

Příklad 3

Zpřístupnění a detekce míst s inkorporovaným BrdU, CldU nebo IdU ve struktuře DNA pomocí nízké koncentrace kyseliny a exonukleázy III v suspenzních buňkách.

Následující postup popisuje zpřístupnění a detekci míst s inkorporovaným BrdU, CldU nebo IdU po působení nízkých koncentrací kyseliny a exonukleázou III v suspenzních buňkách. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.

A) Lidské HeLa S3 buňky (dále jen vzorky) byly pěstovány v kultivačních lahvích (objem lahví byl 50 ml), které byly třepány, v růstovém médiu S-MEM (modifikace Eaglova minimálního média pro suspenzní buňky. Sigma) s 2 mmol.l·¹ L-glutaminem, s 5% (obj./obj.) fetálním telecím sérem (PAA Laboratories) a 1% (obj./obj.) gentamicinem v atmosféře s 5% (obj./obj.) CO₂ při 37 °C. Buněčná suspenze obsahovala přibližně 5 až 8 x 10⁵ buněk na 1 mililitr.

B) Druhý den po pasáži byl do růstového média přidán BrdU v konečné koncentraci 10 pmol.l·¹. Vzorky byly inkubovány alternativně 10, 20, 40 nebo 80 minut nebo 24 hodin v atmosféře s 5% (obj./obj.) CO₂ při 37 °C. Alternativně byl do růstového média přidán CldU nebo IdU ve stejné koncentraci jako BrdU.

C) Následně byla suspenze buněk přenesena do 15 mililitrové centrifugační zkumavky a vzorky byly odstřeďovány 1 minutu při 180g. Supernatant byl odstraněn (ve zkumavce bylo ponecháno 200 μΐ média) a ke vzorkům bylo přidáno nové médium (10 ml). Vzorky byly rozsuspendovány a následně opět odstřeďovány 1 minutu při 180g. Supernatant byl odstraněn (ve zkumavce bylo ponecháno 200 μΐ média) a k peletu vzorků byl přidán 1 ml nového média. Pelet vzorků byl rozsuspendován.

D) 50 μΐ kapka suspenze buněk byla přenesena na kruhová skla o průměru 12 mm potažené vrstvou poly-L-lysinu (způsob přípravy těchto skel je popsán v části Použité roztoky a chemikálie). Po 2 minutách byl přebytek média odsát pomocí filtračního papíru tak, že byl filtrační papír jemně přiložen k hraně skla. Skla byla položena do 2% (hmotnost/obj.) roztoku formaldehydu v Petriho misce a vzorky byly fixovány 10 minut. Skla byla umístěna do Petriho misek tak, že směřovala vzorky nahoru do roztoku.

Ε) V dalších krocích bylo postupováno podle bodů E-U Příkladu 1.

Navržený postup lze použít i při práci se suspenzí buněk po celou dobu jejich zpracování například pro FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting). V tomto případě bylo postupováno dle bodu A-C Příkladu 3, následně podle bodu D-S Příkladu 1 s tím, že při odstraňování veškerých roztoků, přidávání nových a při promývání byly buňky odstřeďovány 1 minutu při 180g, následně byl odstraněn supernatant (ve zkumavce bylo ponecháno 200 μΐ roztoku), k buňkám byl přidán nový roztok dle rozpisu v příkladu 1 (2 ml), buňky v něm byly rozsuspendovány a inkubovány po doby uvedené v jednotlivých bodech příkladu 1. V bodu S nebyla použita voda, ale buňky byly ponechány ve 100 mmol.l·¹ Tris-Cl a 100 mmol.l¹ NaCl, pH 7,5 nebo v lx PBS. V průběhu těchto kroků byly buňky třepány na třepačce (Vortex Wizard, VELP Scientifica, při 300 otáčkách za minutu).

Příklad 4

Zpřístupnění a detekce míst s inkorporovaným BrdU, CldU nebo IdU ve struktuře DNA pomocí nízké koncentrace kyseliny a exonukleázy III v suspenzních buňkách fixovaných etanolem.

Následující postup zpřístupnění a detekci míst s inkorporovaným BrdU, CldU nebo IdU po působení nízkých koncentrací kyseliny a exonukleázou III v suspenzních buňkách fixovaných etanolem. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.

-5CZ 28964 Ul

A) Lidské HeLa S3 buňky (dále jen vzorky) byly pěstovány v kultivačních lahvích (objem lahví byl 50 ml), které byly třepány, v růstovém médiu S-MEM (modifikace Eaglova minimálního média pro suspenzní buňky, Sigma) s 2 mmol.l·^{1 * * *} L-glutaminem, s 5% (obj./obj.) fetálním telecím sérem (PAA Laboratories) a 1% (obj./obj.) gentamicinem v atmosféře s 5% (obj./obj.) CO₂ pri 37 °C. Buněčná suspenze obsahovala přibližně 5 až 8 x 10⁵ buněk na 1 mililitr.

B) Druhý den po pasáži byl do růstového média přidán BrdU v konečné koncentraci 10 pmol.l¹. Vzorky byly inkubovány alternativně 10, 20, 40 nebo 80 minut nebo 24 hodin v atmosféře s 5% (obj./obj.) CO₂ při 37 °C. Alternativně byl do růstového média přidán CldU nebo IdU ve stejné koncentraci jako BrdU.

C) Následně byla suspenze buněk obsahující asi 0,5 až 1,5 miliónu buněk přenesena do centrifugační zkumavky a vzorky byly odstřeďovány 1 minutu při 180g. Supematant byl odstraněn.

D) Ke vzorkům bylo přidáno 2 ml 70% etanolu vychlazeného v ledové lázni. Po 5 minutách inkubace na pokojové teplotě byly přidány 2 ml roztoku lx PBS. Vzorky byly rozsuspendovány a následně opět odstřeďovány 1 minutu při 180g. Supematant byl odstraněn, k peletě vzorků byly přidány 2 ml nového média, pelet vzorků byl rozsuspendován a následně opět odstředěn. Tento krok byl opakován ještě jednou.

E) Supematant byl odstraněn. Ke vzorkům bylo přidáno 2 ml alternativně 20, 40, 80 a 160 mmol.l¹ HC1 nebo HBr nebo HI nebo H₂SO₄. Vzorky byly přemístěny na třepačku (Thermomixer comfort. Eppendorf) a zde inkubovány alternativně 1, 2, 5, 10, 20, 30 nebo 60 minut pri rychlosti 300 otáček/minutu. V některých provedeních inkubace v roztoku kyseliny proběhla bez třepání.

F) Vzorky byly odstřeďovány 1 minutu při 180g. Supematant byl odstraněn, k peletě vzorků byly přidány 2 ml 100 mmol.l¹ Tris-Cl, pH 7,5. Tento krok byl opakován ještě jednou. Alternativně byl namísto roztoku Tris-Cl použit roztok lx PBS.

G) Vzorky byly odstřeďovány 1 minutu při 180g. Supematant byl odstraněn. Ke vzorkům bylo přidáno alternativně 100, 200 nebo 500 μΐ roztoku protilátky-namířené proti BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU (konečná koncentrace protilátky byla 1 až 100 pg/ml) konjugované s fluorochromem a exonukleázy III (konečná koncentrace alternativně 0,2; 1 nebo 10 U/μΙ, Fermentas) v roztoku lx pufru pro exonukleázu III (66 mmol.l¹ Tris (pH 8,0 při 30 °C), 0,66 mmol.l'¹ MgCl₂). Vzorky byly inkubovány alternativně při teplotě 10, 20, 25, 37 nebo 40 °C na třepačce při rychlosti 300 otáček/minutu.

H) Ke vzorkům byly přidány 2 ml 100 mmol.l'¹ Tris-Cl, pH 7,5. Vzorky byly odstřeďovány 1 minutu při 180g. Supematant byl odstraněn, k peletě vzorků byly přidány 2 ml 100 mmol.l¹Tris-Cl, pH 7,5. Tento krok byl opakován ještě jednou. Alternativně byl namísto roztoku Tris-Cl použit roztok lx PBS. V některých provedeních následovaly ihned po prvním přidání 2 ml 100 mmol.l¹ Tris-Cl, pH 7,5 nebo lx PBS kroky I-J.

I) Vzorky byly odstřeďovány 1 minutu při 180g. Supematant byl odstraněn. Ke vzorkům byly přidány 2 ml 2% (hmotnost/objem) formaldehydu v lx PBS a vzorky byly inkubovány po dobu 10 minut na pokojové teplotě.

J) Vzorky byly odstřeďovány 1 minutu při 180g. Supematant byl odstraněn. Ke vzorkům byly přidány 2 ml 100 mmol.l'¹ Tris-Cl, pH 7,5. Vzorky byly odstřeďovány 1 minutu při 180g. Supernatant byl odstraněn, k peletě vzorků byly přidány 2 ml 100 mmol.l¹ Tris-Cl, pH 7,5. Tento krok byl opakován ještě jednou. Alternativně byl namísto roztoku Tris-Cl použit roztok lx PBS. Použité roztoky a chemikálie:

1. Fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (PBS) lOx PBS (desetinásobně koncentrovaný roztok PBS):

1,4 mol.l¹ NaCl 26 mmol.l'¹ KC1

-6CZ 28964 Ul mmol.l’¹ Na2HPO4 14 mmol.r¹ KH2PO₄

Uvedené složky byly rozpuštěny v destilované vodě a pH bylo upraveno do rozmezí 7,3 až 7,4 lx PBS (fosfátem pufrovaný fyziologický roztok připravený desetinásobným ředěním lOx PBS)

2. Příprava polylysinových skel pro ukotvení suspenzních buněk

Kruhová skla s průměrem 12 mm byla vložena do 50 ml kádinky s 20 ml 96% (obj./obj.) etanolu. Po 10 minutách byla pomocí pinzety přenesena do Petriho misky vyložené filtračním papírem a usušena. Skla byla následně na dobu 1 minuty ponořena do 0,01% (hmotnost/obj.) roztoku poly-L-lysinu v DMEM, následně byla ponořena na 30 sekund do lx PBS a pak ještě jednou na 30 sekund do nového lx PBS. Tento krok byl ještě 3x opakován. Nakonec byla skla položena na filtrační papír a usušena.

3. Roztok exonukleázy III s protilátkou

Destilovaná voda lx pufr pro exonukleázu III (Fermentas, 2 μΐ lOx koncentrovaného pufru do 20 μΐ směsi), tento pufr je dodáván jako lOx koncentrovaný, složení lOx koncentrovaného pufru je následující: 660 mmolT¹ Tris-HCl (pH 8,0 pri 30 °C), 6,6 mmol.r¹ MgCl₂.

Exonukleáza III (200 U/μΙ, Fermentas), konečná koncentrace 1 U/ μΐ

Anti-bromodeoxyuridinová protilátka (ředění dle návodu dodavatele protilátky)

Definice jednotky exonukleázy III

Jedna jednotka (U) enzymu uvolní za 30 minut 1 nmol produktu z DNA E. coli při 37 °C. Enzymatická aktivita byla měřena v následující směsi: 50 mmol.l¹ Tris-HCl(pH 8,0), 5 mmol.r¹MgCl₂, 1 mmol.l'¹ dithiothreitol a 0,05 mmol.l¹ sonikované DNA z E. coli.

Průmyslová využitelnost

Sadu pro zpřístupnění specifických pyrimidinových nukleosidů ve struktuře dvouřetězcové DNA podle předkládaného vynálezu lze využít v případech, kdy je důležité šetrné zpřístupnění nukleosidů ve struktuře DNA pro reakci se specifickými protilátkami. Její uplatnění je rovněž výhodné v případě provádění analýz buněčného cyklu.

NÁROKY NA OCHRANU

Claims

NÁROKY NA OCHRANU

1. Sada pro zpřístupnění specifických pyrimidinových nukleosidů ve struktuře dvouřetězcové DNA pro reakci s protilátkami, reagujícími s těmito nukleosidy, vyznačující se tím, že obsahuje:

- kyselinu

- exonukleázu III

- protilátku reagující s pyrimidinovými nukleosidy

- s výhodou roztok formaldehydu
2 výkresy

-7CZ 28964 Ul

Výkresy Obrázek 1

Obrázek 2

-8CZ 28964 Ul

Frekvence Frekvence