CZ307807B6 - Způsob zvýšení signálu protilátek rozeznávajících 5-bromo-2'-deoxyuridin a/nebo 5-chloro-2'-deoxyuridin a/nebo 5-jodo-2'-deoxyuridin v místech inkorporace těchto nukleosidů do DNA po působení DNázy I - Google Patents

Způsob zvýšení signálu protilátek rozeznávajících 5-bromo-2'-deoxyuridin a/nebo 5-chloro-2'-deoxyuridin a/nebo 5-jodo-2'-deoxyuridin v místech inkorporace těchto nukleosidů do DNA po působení DNázy I Download PDF

Info

Publication number
CZ307807B6
CZ307807B6 CZ2016-87A CZ201687A CZ307807B6 CZ 307807 B6 CZ307807 B6 CZ 307807B6 CZ 201687 A CZ201687 A CZ 201687A CZ 307807 B6 CZ307807 B6 CZ 307807B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
deoxyuridine
dna
samples
mmol
pbs
Prior art date
Application number
CZ2016-87A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ201687A3 (cs
Inventor
Karel KOBERNA
Anna Ligasová
Original Assignee
Univerzita Palackého v Olomouci
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univerzita Palackého v Olomouci filed Critical Univerzita Palackého v Olomouci
Priority to CZ2016-87A priority Critical patent/CZ307807B6/cs
Publication of CZ201687A3 publication Critical patent/CZ201687A3/cs
Publication of CZ307807B6 publication Critical patent/CZ307807B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/21—Endodeoxyribonucleases producing 5'-phosphomonoesters (3.1.21)
    • C12Y301/21001—Deoxyribonuclease I (3.1.21.1)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5306—Improving reaction conditions, e.g. reduction of non-specific binding, promotion of specific binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/117—Modifications characterised by incorporating modified base
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2549/00—Reactions characterised by the features used to influence the efficiency or specificity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2496/00—Reference solutions for assays of biological material

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Způsob dovoluje efektivně zvýšit signál protilátek rozeznávajících 5-bromo-2´-deoxyuridin a/nebo 5-chloro-2´-deoxyuridin a/nebo 5-jodo-2´-deoxyuridin v DNA v místech inkorporace těchto nukleosidů do DNA po působení DNázou I. Způsob spočívá v inkubaci vzorků, po působení DNázy I a protilátky, v roztoku formaldehydu a je využitelný jak v případě, že jsou použity systémy založené na dvou protilátkách, tak systémy založené na protilátce konjugované s různými látkami typu fluorochromů nebo biotinu.

Description

Oblast techniky
Vynález se týká způsobu zvýšení signálu při detekci 5-bromo-2’-deoxyuridinu a/nebo 5-chloro -2’-deoxyuridinu a/nebo 5-jodo-2’-deoxyuridinu ve dvouřetězcové DNA v místech inkorporace těchto nukleosidů do DNA po působení DNázy I a použití protilátek rozeznávajících tyto nukleosidy.
Dosavadní stav techniky
Detekce značené DNA založené na reakci specifické protilátky a značících nukleosidů, které jsou součástí DNA, se specifickými protilátkami jsou běžné jak v základním, tak aplikovaném výzkumu a používají se např. při charakterizaci buněčného cyklu. Příkladem takto používaných nukleosidů je 5-bromo-2’-deoxyuridin (BrdU), 5-chloro-2’-deoxyuridin (CldU) nebo 5-jodo2’-deoxyuridin (IdU). dále jen značené nukleosidy.
Značené nukleosidy jsou ve struktuře dvouřetězcové DNA zpravidla nepřístupné pro reakci s protilátkou a pro jejich zpřístupnění v buňkách a tkáních jsou používány speciální kroky (např. Genes Dev, 14, 2855-2868; J Cell Sci, 115, 4037-4051; PLoS One, 7, e52584), které jsou naprosto klíčové pro následující detekce značené dvouřetězcové DNA. Jednou z metod je použití DNázy I nebo kombinace DNázy I a exonukleázy, přičemž použití cxonukleázy zvyšuje signál (např. Cytometry, 14, 640-648).
Podstata vynálezu
Naše výsledky ukázaly, že signál po použití DNázy I je v buňkách a tkáních značených BrdU nebo CldU nebo IdU silně závislý na kvalitě použité protilátky rozeznávající tyto nukleosidy. Některé protilátky poskytly jen velice slabý signál. V některých případech byl signál nedetekovatelný. K zásadnímu zvýšení signálu došlo až po aplikaci roztoku formaldehydu (viz obrázek). Obecně platilo, že čím kratší byl Čas mezi aplikací formaldehydu a ukončením reakce s protilátkou, tím bylo zvýšení signálu vyšší. Tento krok byl dostatečný u většiny protilátek k získání vysokého signálu. U některých z testovaných protilátek došlo do půl hodiny po aplikaci primární protilátky bez ovlivnění formaldehydem téměř k úplné ztrátě signálu. Příklady provedení zahrnují jak případ, kdy je detekční systém založený na detekci v jednom nebo dvou krocích. V případě jednokrokové detekce je protilátka rozeznávající BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU přímo konjugována s dalšími látkami např. typu fluorochromů nebo biotinu. V případě detekce ve dvou krocích je po reakci s primární protilátkou, která specificky rozeznává BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU (dále jen primární protilátka) provedena ve druhém kroku reakce s druhou, tzv. sekundární protilátkou (dále jen sekundární protilátka), která specificky rozeznává primární protilátku. Tato sekundární protilátka je konjugována s dalšími látkami např. typu fluorochromů nebo biotinu.
Objasnění výkresů
Obrázek Na obrázku jsou znázorněny výsledky detekce BrdU inkorporovaného v buněčné DNA po použití DNázy I s použitím (plus) nebo bez použití (mínus) formaldehydu (FA). Pro detekci BrdU byly použity dva různé klony primárních protilátek namířených proti BrdU (B44, Bu20a).
- 1 CZ 307807 B6
Vzorky buněk byly nebo nebyly po reakci s anti-BrdU protilátkou fixovány formaldehydem, promyty v PBS a pak inkubovány se sekundární protilátkou konjugovanou s fluorochromem.
Příklady uskutečnění vynálezu
Seznam použitých zkratek
DAPI 4’,6-diamidino-2-fenylindol
HeLa buněčná linie lidských epiteliálních buněk
DMEM Dulbeccova modifikace Eaglova média
PBS fosfátem pufrovaný fyziologický roztok
BrdU 5-bromo-2’-deoxyuridin
CldU 5-chloro-2’-deoxyuridin
IdU 5-jodo-2’-deoxyuridin
S-MEM modifikace Eaglova minimálního média pro suspenzní buňky
HC1 kyselina chlorovodíková
Příklad 1
Zvýšení signálu pří použití protilátek rozeznávajících BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU v DNA v místech inkorporace těchto nukleosidů po působení DNázy I v buňkách přisedlých na podložních sklíčkách.
Následující postup popisuje zvýšení signálu při použití protilátek namířených proti BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU v HeLa buňkách přisedlých na podložních sklíčkách po působení DNázy I. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.
A) Lidské HeLa buňky (dále jen vzorky) byly pěstovány v Petriho miskách na kruhových sklech o průměru 12 mm v růstovém médiu DM EM s L-glutaminem (Gibco) s 10 % (obj./obj.) fetálním telecím sérem (PAA Laboratories), 1 % (obj./obj.) gentamicinem a 3,7 g/1 NalICCL v atmosféře s 5 % (obj./obj.) CO2 při 37 °C.
B) Druhý den po pasáži byl do růstového média přidán BrdU v konečné koncentraci 10 pmol.L1. Vzorky byly inkubovány alternativně 10; 20; 30 nebo 60 minut v atmosféře s 5% (obj./obj.) CO2 při 37 °C. Alternativně byl do růstového média přidán CldU nebo IdU ve stejné koncentraci jako BrdU.
C) Následně bylo růstové médium odstraněno a nahrazeno pufirem (lx PBS, složení viz část Použité roztoky a chemikálie, přidány byly přibližně 1 až 2 ml pufru na 4 cm2 plochy).
D) Pufir byl odstraněn a vzorky byly 10 minut fixovány 2 % (hmotnost/obj.) roztokem formaldehydu v lx PBS (pH 7,4; 1 až 2 ml fixačního roztoku na 4 cm2 plochy). Alternativně byly vzorky fixovány metanolem a následně acetonem. V tomto případě byla skla se vzorky nejdříve inkubována 10 minut v metanolu při teplotě -20 °C (přibližně 1 až 2 ml metanolu na 4 cm2 plochy) a následně ponořena na 30 sekund do kádinky s 50 ml acetonu o teplotě místnosti, skla se vzorky pak byla usušena a po usušení položena do Petriho misky s lx PBS. V případě použití metanolu a acetonu následoval krok H).
E) Roztok formaldehydu byl odstraněn a vzorky byly převrstveny lx PBS (přibližně 1 až 2 ml lx PBS na 4 cm2 plochy). Po 5 minutách byl pufir odstraněn a nahrazen novým o stejném složení. Tento krok byl opakován ještě jednou.
-2CZ 307807 B6
F) Následně byl pufr odstraněn. Vzorky byly 10 minut permeabilizovány alternativně 0,1%; 0,2% nebo 0,5% (obj./obj.) roztokem Tritonu X-100 v lx PBS (přibližně 1 až 2 ml permeabilizačního roztoku na 4 cm2 plochy). Po odstranění permeabilizačního roztoku byly vzorky převrstveny lx PBS (přibližně 1 až 2 ml lx PBS na 4 cm2 plochy).
G) Po 5 minutách byl roztok lx PBS odstraněn a nahrazen stejným množstvím téhož roztoku. Tento krok byl opakován ještě jednou.
H) Roztok lx PBS byl odstraněn a vzorky byly převrstveny roztokem 100 mmol.F1 tris(hydroxymetyl)aminometanu s HC1 (dále jen 100 mmol.F1 Tris-HCl), pH 7,5 (přibližně 1 až 2 ml roztoku na 4 cm2 plochy). Po jedné minutě byl roztok 100 mmol.F1 Tris-HCl odstraněn a nahrazen stejným množstvím roztoku 100 mmol.F1 Tris-HCl. Tento krok byl opakován ještě jednou.
I) Skla se vzorky byla vyjmuta pomocí pinzety z Petriho misky a přebytek roztoku byl odsát pomocí filtračního papíru tak, že skla se vzorky byla položena stranou bez vzorků na filtrační papír. Skla se vzorky byla položena na kapky 100 mmol.F1 Tris-HCl, pH 7,5 na parafilmu (50 μΐ/kapka). Skla směřovala vrstvou se vzorky směrem dolů do kapky.
J) Následně byly vzorky inkubovány 30 minut s myší protilátkou rozeznávající BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU (konečná koncentrace protilátky byla alternativně 0,1; 1; 10; 100 nebo 200 pg/ml) a DNázou 1 (konečná koncentrace byla alternativně 1; 2; 20 nebo 50 U/ml, ThermoFisher Scientific) v lx pufru pro DNázu I (viz použité roztoky a chemikálie) na kapkách o velikosti 40 μΐ. V některých provedeních byla použita protilátka konjugována s fluorochromem.
K) Skla se vzorky byla přenesena na kapku roztoku lx PBS. Alternativně okamžitě, po 20 sekundách nebo po 5 minutách byla skla se vzorky přenesena na novou kapku roztoku lx PBS. Tento krok byl ještě jednou opakován. V některých provedeních byl tento krok vynechán nebo spočíval jen v jediném přenesení na kapku lx PBS.
L) Následně byla skla se vzorky okamžitě přenesena na kapku alternativně 0,1%; 0,5%; 1%; 2%; 10% nebo 20% roztoku formaldehydu v lx PBS a inkubována alternativně po dobu 1; 10 nebo 60 minut.
M) Skla se vzorky byla přenesena na kapku roztoku lx PBS. Po 5 minutách byla skla se vzorky přenesena na novou kapku roztoku lx PBS. Tento krok byl ještě jednou opakován. V provedeních, kde byla v kroku J použita protilátka konjugována s fluorochromem, bylo pokračováno krokem P.
N) Skla se vzorky byla přenesena na kapku roztoku 100 mmol.F1 Tris-HCl a 100 mmol.F1 NaCl, pH 7,5. Po 5 minutách byla skla se vzorky přenesena na novou kapku roztoku 100 mmol.F1 TrisHCl a 100 mmol.F1 NaCl, pH 7,5. Tento krok byl ještě jednou opakován. Alternativně byl místo roztoku 100 mmol.F1 Tris-HCl a 100 mmol.F1 NaCl, pH 7,5 použit lx PBS.
O) Skla se vzorky byla inkubována 30 minut s kozí anti-myší protilátkou konjugovanou s fluorochromem Cy3 (Jackson Immunoresearch Laboratories, ředění 1:100 ve 100 mmol.F1 TrisHCl a 100 mmol.F1 NaCl, pH 7,5) na kapkách o velikosti 20 μΐ. Alternativně byl namísto roztoku 100 mmol.F1 Tris-HCl a 100 mmol.F1 NaCl, pH 7,5 použit lx PBS.
P) Skla se vzorky byla přenesena na kapku 100 mmol.F1 Tris-HCl a 100 mmol.F1 NaCl, pH 7,5 (50 μΐ/kapka). Po 5 minutách byla skla s buňkami přenesena na novou kapku 100 mmol.F1 Tris-HCl a 100 mmol.F1 NaCl, pH 7,5. Tento krok byl ještě třikrát opakován. Alternativně byl namísto roztoku 100 mmol.F1 Tris-HCl a 100 mmol.F1 NaCl, pH 7,5 použit lx PBS. Následně byla skla se vzorky přenesena na kapku destilované vody (50 μΐ). Po 5 minutách byla skla se vzorky přenesena na novou kapku destilované vody. Tento krok byl ještě třikrát opakován.
-3CZ 307807 B6
Q) Nakonec byla voda ze skel odsáta pomocí filtračního papíru, skla byla položena na nový filtrační papír vzorky nahoru a usušena.
R) Po usušení byla skla položena na kapičky (3 μΐ) připraveného roztoku 50% glycerinu na podložním skle. Vzorky směřovaly do kapičky roztoku. Jemným tlakem pomocí pinzety na horní stranu skel se vzorky došlo k roztažení roztoku po celé ploše skel. Signál byl detekován pomocí fluorescenčního mikroskopu.
Příklad 2
Zvýšení signálu při použití protilátek rozeznávajících BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU v DNA v místech inkorporace těchto nukleosidů po působení DNázy I ve tkáních.
Následující postup popisuje zvýšení signálu při použití protilátek namířených proti BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU ve tkáních po působení DNázy I. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.
A) Třídenní potkaní samci byli usmrceni dekapitací a následně jim byla vyjmuta játra. Játra byla nakrájena na malé kousky (3 mm - nej delší rozměr) a položena do Petriho misek s HeLa buňkami inkubovanými jeden den v růstovém médiu DMEM s L-glutaminem (Dulbeccova modifikace Eaglova média, Gibco) s 10% (obj./obj.) fetálním telecím sérem (PAA Laboratories), 1% (obj./obj.) gentamicinem a 3,7 g/1 NaHCO3. Do média s kousky jater byl přidán BrdU v konečné koncentraci 10 pmol.l-1 a játra byla v tomto médiu inkubována 30 minut v atmosféře s 5% (obj./obj.) CO2 při 37 °C. Alternativně byl do růstového média namísto BrdU přidán IdU nebo CldU ve stejné koncentraci jako BrdU.
B) Následně bylo růstové médium odstraněno a kousky jater byly převrstveny pufirem (lx PBS, složení viz část Použité roztoky a chemikálie, přidány byly přibližně 1 až 2 ml pufru na 4 cm2 plochy). Po 5 minutách byl pufir odstraněn a nahrazen stejným množstvím lx PBS stejného složení. Tento krok byl ještě jednou opakován.
C) Kousek jater byl dán mezi dvě kruhová skla o průměru 12 mm potažené 1% (hmotnost/obj.) želatinou a tkán byla roztažena po povrchu skel pomocí jemného tlaku pinzetou na sklo. Skla byla oddělena a obě byla dána do Petriho misky s lx PBS a to tak, že skla směrovala vzorky tkání nahoru do roztoku.
D) dalších krocích bylo postupováno dle kroků uvedených v Příkladu 1 (D až R).
Příklad 3
Zvýšení signálu při použití protilátek rozeznávajících BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU v DNA v místech inkorporace těchto nukleosidů po působení DNázy I v suspenzních buňkách fixovaných formaldehydem.
Následující postup popisuje zvýšení signálu při použití protilátek namířených proti BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU po působení DNázy I v suspenzních buňkách fixovaných formaldehydem. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.
A) Lidské HeLa S3 buňky (dále jen vzorky) byly pěstovány v kultivačních lahvích (objem lahví byl 50 ml), které byly třepány, v růstovém médiu S-MEM (modifikace Eaglova minimálního média pro suspenzní buňky. Sigma) s 2 mmol.L1 L-glutaminem, s 5% (obj./obj.) fetálním telecím sérem (PAA Laboratories) a 1% (obj./obj.) gentamicinem v atmosféře s 5% (obj./obj.) CO2 při 37 °C. Buněčná suspenze obsahovala přibližně 5 až 8 x 105 buněk na 1 mililitr.
-4CZ 307807 B6
B) Druhý den po pasáži byl do růstového média přidán BrdU v konečné koncentraci 10 pmol.l-1. Vzorky byly inkubovány 10 minut v atmosféře s 5% (obj/obj.) CO? při 37 °C. Alternativně byl do růstového média přidán CldU nebo IdU ve stejné koncentraci jako BrdU.
C) Následně byla suspenze buněk přenesena do 15 mililitrové centrifugační zkumavky a vzorky byly odstřeďovány 5 minut při 180 g. Supernatant byl odstraněn (ve zkumavce bylo ponecháno 200 μΐ média) a ke vzorkům bylo přidáno nové médium (10 ml). Vzorky byly rozsuspendovány a následně opět odstřeďovány 5 minut při 180 g. Supernatant byl odstraněn (ve zkumavce bylo ponecháno 200 μΐ média) a k peletu vzorků byl přidán 1 ml nového média. Pelet vzorků byl rozsuspendován.
D) 50 μΐ kapka suspenze buněk byla přenesena na kruhová skla o průměru 12 mm potažené vrstvou poly-L-lysinu (způsob přípravy těchto skel je popsán v části Použité roztoky a chemikálie). Po 2 minutách byl přebytek média odsát pomocí filtračního papíru tak, že byl filtrační papír jemně přiložen k hraně skla. Skla byla položena do 2% (hmotnost/obj.) roztoku formaldehydu v Petriho misce a vzorky byly fixovány 10 minut. Skla byla umístěna do Petriho misek tak, že směřovala vzorky nahoru do roztoku.
E) V dalších krocích bylo postupováno podle bodů E až R Příkladu 1.
Navržený postup lze použít i při práci se suspenzí buněk po celou dobu jejich zpracování například pro FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting). V tomto případě bylo postupováno dle bodu A až C Příkladu 3, následně podle bodu D až R Příkladu 1 s tím, že při odstraňování veškerých roztoků, přidávání nových a při promývání byly buňky odstřeďovány 5 minut při 180 g, následně byl odstraněn supernatant (ve zkumavce bylo ponecháno 200 μΐ roztoku), k buňkám byl přidán nový roztok dle rozpisu v Příkladu 1 (2 ml), buňky v něm byly rozsuspendovány a inkubovány po doby uvedené v jednotlivých bodech Příkladu 1. V bodu D byl použít jen roztok formaldehydu. V bodu R nebyla použita voda, ale buňky byly ponechány ve 100 mmol.F1 Tris-HCl a 100 mmol.F1 NaCl, při 7,5. V průběhu těchto kroků byly buňky třepány na třepačce (Vortex Wizard,VELP Scientifica, při 300 otáčkách za minutu).
Příklad 4
Zvýšení signálu při použití protilátek rozeznávajících BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU v DNA v místech inkorporace těchto nukleosidů po působení DNázy I v suspenzních buňkách fixovaných etanolem.
Následující postup popisuje zvýšení signálu při použití protilátek namířených proti BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU po působení DNázy 1 v suspenzních buňkách fixovaných etanolem. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev,
A) Lidské HeLa S3 buňky (dále jen vzorky) byly pěstovány v kultivačních lahvích (objem lahví byl 50 ml), které byly třepány, v růstovém médiu S-MEM (modifikace Eaglova minimálního média pro suspenzní buňky. Sigma) s 2 mmol.F1 L-glutaminem, 5% (obj./obj.) fetálním telecím sérem (PAA Laboratories) a 1% (obj./obj.) gentamicinem v atmosféře s 5% (obj./obj.) CO? při 37°C.
B) Druhý den po pasáží byl do růstového média přidán BrdU v konečné koncentraci 10 pmol.F1. Vzorky byly inkubovány 10 nebo 30 minut v atmosféře s 5% (obj./obj.) CO? při 37 °C. Alternativně byl do růstového média přidán CldU nebo IdU ve stejné koncentraci jako BrdU.
C) Následně byla suspenze buněk přenesena do centrifugační zkumavky a vzorky byly odstřeďovány 5 minut při 180 g. Supernatant byl odstraněn.
-5CZ 307807 B6
D) Ke vzorkům bylo přidáno 10 ml roztoku lxPBS a vzorky byly odstřeďovány 5 minut při 180 g.
E) 7 ml PBS bylo odstraněno a k buňkám bylo přidáno 7 ml 96% (obj./obj.) vychlazeného etanolu (-20 °C) a vzorky byly inkubovány v roztoku etanolu při -20 °C po dobu 2 hodin.
F) Vzorky byly odstřeďovány 5 minut při 180 g. Supematant byl odstraněn a ke vzorkům bylo přidáno 10 ml 100 mmol.F1 Tris-HCl, pH 7,5. Tento krok byl ještě jednou opakován.
G) Vzorky byly odstřeďovány 5 minut při 180 g. Supematant byl odstraněn. Ke vzorkům bylo přidáno alternativně 100; 200 nebo 500 μΐ roztoku myší protilátky rozeznávající BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU (konečná koncentrace protilátky byla alternativně 0,1; 1; 10; 100 nebo 200 pg/ml) konjugované nebo nekonjugované s fluorochromem a DNázy I (konečná koncentrace byla alternativně 1; 2; 20 nebo 50 U/ml, ThermoFisher Scientific) v pufiru pro DNázu I (viz použité roztoky a chemikálie). Vzorky byly inkubovány alternativně při teplotě 10; 20; 25; 37 nebo 40 °C na třepačce při rychlosti 300 otáček za minutu. V některých provedeních byla detekce BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU provedena podle (Cytometry, 14, 640-648) včetně použití exonukleázy III, kdy po inkubaci s protilátkou následoval krok K.
H) Ke vzorkům byly přidány 3 ml lx PBS. Vzorky byly odstřeďovány 5 minut při 180 g. V některých provedeních nebyly vzorky odstřeďovány.
I) V provedeních, kdy byly vzorky v kroku H odstřeďovány, byl supematant odstraněn. Ke všem vzorkům byly přidány alternativně 3 ml 0,2%; 2%; 4%; 10% nebo 20% formaldehydu v lx PBS a vzorky byly inkubovány po dobu 10 minut.
J) Vzorky byly odstřeďovány 5 minut při 180 g a supematant byl odstraněn. Následně bylo ke vzorkům přidáno 10 ml roztoku 100 mmol.F1 Tris-HCl a 100 mmoLF1 NaCl, pH 7,5. Tento krok byl ještě jednou opakován. Alternativně byl místo roztoku 100 mmol.F1 Tris-HCl a 100 mmol.F1 NaCl, pH 7,5 použit lx PBS. V případě, že byla v kroku G použita protilátka konjugovaná s fluorochromem, byl krok J posledním krokem.
K) Vzorky bvly odstřeďovány 5 minut při 180 g a supematant byl odstraněn. Ke vzorkům bylo přidáno alternativně 100; 200 nebo 500 μΐ roztoku anti-myší protilátky konjugované s fluorochromem Cy3 (Jackson Immunoresearch Laboratories, ředění 1:100 ve 100 mmol.F1 TrisHCl a 100 mmol.F1 NaCl, pH 7,5). Alternativně byl namísto roztoku 100 mmol.F1 Tris-HCl a 100 mmol.F1 NaCl, pH 7,5 použit lx PBS. Vzorky byly inkubovány na třepačce při 300 rpm po dobu 30 minut.
L) Ke vzorkům byly přidány 2 ml 100 mmol.F1 Tris-HCl, 100 mmol.F1 NaCl, pH 7,5. Vzorky byly odstřeďovány 5 minut při 180 g. Tento krok byl opakován ještě jednou.
Použité roztoky a chemikálie:
1. Fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (PBS) lOx PBS (desetinásobně koncentrovaný roztok PBS):
1,4 mol.F1 NaCl mmol.F1 KC1 mmol.F1 NazHPCF mmol.l1 KH2PO4
Uvedené složky bvly rozpuštěny v destilované vodě a pH bylo upraveno do rozmezí 7,3 až 7,4
-6CZ 307807 B6 lx PBS (fosfátem pufrovaný fyziologický roztok připravený desetinásobným ředěním lOx PBS)
2. Příprava polylysinových skel pro ukotvení suspenzních buněk
Kruhová skla s průměrem 12 mm byla vložena do 50 ml kádinky s 20 ml 96% (obj./obj.) etanolu. Po 10 minutách byla pomocí pinzety přenesena do Petriho misky vyložené filtračním papírem a usušena. Skla byla následně na dobu 1 minuty ponořena do 0,01% (hmotnost/obj.) roztoku polyL-lysinu v DMEM, následně byla ponořena na 30 sekund do lx PBS a pak ještě jednou na 30 sekund do nového lx PBS. Tento krok byl ještě 3x opakován. Nakonec byla skla položena na filtrační papír a usušena.
3. Roztok DNázy I:
p— Destilovaná voda
- lx pufr pro DNázu I (ThermoFisher Scientific, 2 I lOx koncentrovaného pufru do 20 μΐ směsi), tento pufr je dodáván jako lOx koncentrovaný, složení lOx koncentrovaného pufru je následující: 100 mmol.l-1 Tris-HCl (pH 7,5 při 23°C), 25 mmol.l-1 MgCF a 1 mmol.l-1 CaCF.
- DNáza 1(1 U/μΙ, ThermoFisher Scientific)
- Myší anti-bromodeoxyuridinová protilátka (ředění dle návodu dodavatele protilátky)
Průmyslová využitelnost:
Způsob zvýšení signálu protilátek rozeznávající BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU v DNA v místech lokalizace těchto nukleosidů podle předkládaného vynálezu lze využít v případech, kdy je důležité šetrné zpřístupnění těchto nukleosidů ve struktuře DNA pomocí DNázy I. Přístup významně zvyšuje signál a je tudíž možné mimo jiné předpokládat včlenění tohoto způsobu do komerčně dostupných sad pro detekci replikace DNA.
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (2)

1. Způsob zvýšení signálu při detekci 5-bromo-2’-deoxyuridinu a/nebo 5-chloro-2’deoxyuridinu a/nebo 5-jodo-2’-deoxyuridinu ve dvouřetězcové DNA v místech inkorporace těchto nukleosidů do DNA v buňkách a tkáních po působení DNázy I a použití protilátek rozeznávající tyto nukleosidy, vyznačující se tím, že vzorky s DNA, která obsahuje 5-bromo-2’deoxyuridin, 5-chloro-2’-deoxyuridin nebo 5-jodo-2’-deoxyuridin, se po působení DNázy I a inkubaci s protilátkou rozeznávající 5-bromo-2’-deoxyuridin a/nebo 5-chloro-2’-deoxyuridin a/nebo 5-jodo-2’-deoxyuridin inkubují v roztoku formaldehydu.
2. Způsob zvýšení signálu podle nároku 1, vyznačující se tím, že pro detekci jsou použity nekonjugované protilátky nebo protilátky přímo konjugovány s fluorochromem.
CZ2016-87A 2016-02-16 2016-02-16 Způsob zvýšení signálu protilátek rozeznávajících 5-bromo-2'-deoxyuridin a/nebo 5-chloro-2'-deoxyuridin a/nebo 5-jodo-2'-deoxyuridin v místech inkorporace těchto nukleosidů do DNA po působení DNázy I CZ307807B6 (cs)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2016-87A CZ307807B6 (cs) 2016-02-16 2016-02-16 Způsob zvýšení signálu protilátek rozeznávajících 5-bromo-2'-deoxyuridin a/nebo 5-chloro-2'-deoxyuridin a/nebo 5-jodo-2'-deoxyuridin v místech inkorporace těchto nukleosidů do DNA po působení DNázy I

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2016-87A CZ307807B6 (cs) 2016-02-16 2016-02-16 Způsob zvýšení signálu protilátek rozeznávajících 5-bromo-2'-deoxyuridin a/nebo 5-chloro-2'-deoxyuridin a/nebo 5-jodo-2'-deoxyuridin v místech inkorporace těchto nukleosidů do DNA po působení DNázy I

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ201687A3 CZ201687A3 (cs) 2017-08-23
CZ307807B6 true CZ307807B6 (cs) 2019-05-22

Family

ID=59655748

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2016-87A CZ307807B6 (cs) 2016-02-16 2016-02-16 Způsob zvýšení signálu protilátek rozeznávajících 5-bromo-2'-deoxyuridin a/nebo 5-chloro-2'-deoxyuridin a/nebo 5-jodo-2'-deoxyuridin v místech inkorporace těchto nukleosidů do DNA po působení DNázy I

Country Status (1)

Country Link
CZ (1) CZ307807B6 (cs)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ28964U1 (cs) * 2015-05-12 2015-12-14 Univerzita PalackĂ©ho v Olomouci Sada pro zpřístupnění specifických pyrimidinových nukleosidů ve struktuře dvouřetězcové DNA pro reakci s protilátkami, které s těmito nukleosidy reagují

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ28964U1 (cs) * 2015-05-12 2015-12-14 Univerzita PalackĂ©ho v Olomouci Sada pro zpřístupnění specifických pyrimidinových nukleosidů ve struktuře dvouřetězcové DNA pro reakci s protilátkami, které s těmito nukleosidy reagují

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Anna Ligasová et al: Atomic Scissors: A New Method of Tracking the 5-Bromo-2′-Deoxyuridine-Labeled DNA In Situ 2012 PLoS One 7(12): e52584 *
Anna Ligasová, et al: The Fingerprint of Anti-Bromodeoxyuridine Antibodies and Its Use for the Assessment of Their Affinity to 5-Bromo-2'-Deoxyuridine in Cellular DNA under Various Conditions 2015 PLoS One 10(7): e0132393 *

Also Published As

Publication number Publication date
CZ201687A3 (cs) 2017-08-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Rauvala et al. The adhesive and neurite-promoting molecule p30: analysis of the amino-terminal sequence and production of antipeptide antibodies that detect p30 at the surface of neuroblastoma cells and of brain neurons.
Paul et al. Streptavidin-coated magnetic beads for DNA strand separation implicate a multitude of problems during cell-SELEX
Castello et al. Comprehensive identification of RNA-binding proteins by RNA interactome capture
Conchinha et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: brain, choroid, lung, and muscle
CN111304208B (zh) 一种特异性结合p-糖蛋白的核酸适配体、制备方法及其应用
DK2634195T3 (en) Separation of living pristine neurons
WO2011034115A1 (ja) アビジンとビオチン誘導体の解離方法及び解離剤
CA3026318C (en) Process for generation, identification and isolation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and cardiomyocyte subpopulations
CN105462919A (zh) 一种从脐带华通氏胶组织中分离提取hUC-MSC的方法
CN113480619A (zh) 多肽及其在新型冠状病毒检测中的应用
CN105424450A (zh) 悬浮细胞球免疫荧光染色方法及染色装置
JP2018527404A (ja) 環状ｒｇｄ細胞結合モチーフ及びその使用
CN109023535A (zh) 一种用抗体针对无识别标记蛋白或细胞裂解物的dna编码化合物筛选方法
Marsden et al. The βL integrin subunit is necessary for gastrulation in sea urchin embryos
Toda et al. Effect of hydrogel elasticity and ephrinB2-immobilized manner on Runx2 expression of human mesenchymal stem cells
CZ307807B6 (cs) Způsob zvýšení signálu protilátek rozeznávajících 5-bromo-2'-deoxyuridin a/nebo 5-chloro-2'-deoxyuridin a/nebo 5-jodo-2'-deoxyuridin v místech inkorporace těchto nukleosidů do DNA po působení DNázy I
KR101168224B1 (ko) 항-ｔｍ4ｓｆ1 항체를 이용한 중간엽줄기세포 동정방법 및 그 조성물
US20050214873A1 (en) Antibody for isolating and/or identifying mesenchymal stem cells, and method for isolating and/or identifying mesenchymal stem cells
CN104911187B (zh) 结核分枝杆菌标准株H37Rv的DNA适配子及其制备方法
CN106399316B (zh) 用于识别Gremlin-1的核酸适配子及其应用
CZ28964U1 (cs) Sada pro zpřístupnění specifických pyrimidinových nukleosidů ve struktuře dvouřetězcové DNA pro reakci s protilátkami, které s těmito nukleosidy reagují
CZ2011324A3 (cs) Zpusob eliminace antigenních vlastností 5-ethynyl-2´-deoxyuridinu a 5-ethynyluridinu pri detekci nukleových kyselin
CZ307016B6 (cs) Způsob stabilizace protilátek rozeznávajících 5-bromo-2´-deoxyuridin a/nebo 5-chloro-2´-deoxyuridin a/nebo 5-jodo-2´-deoxyuridin v místech inkorporace těchto nukleosidů do DNA po působení jednomocnou mědí a/nebo exonukleázou III
CN115717145A (zh) 一种靶向tshr蛋白的核酸适体、核酸适体衍生物及其应用
JP2907473B2 (ja) 細胞選別技術及びその利用

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20200216