CN111304208B

CN111304208B - 一种特异性结合p-糖蛋白的核酸适配体、制备方法及其应用

Info

Publication number: CN111304208B
Application number: CN202010108188.7A
Authority: CN
Inventors: 李玉娟; 梁敏; 武广霞; 郭晶晶; 邓玉林
Original assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Current assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Priority date: 2020-02-21
Filing date: 2020-02-21
Publication date: 2021-09-21
Anticipated expiration: 2040-02-21
Also published as: CN111304208A

Abstract

本发明涉及一种特异性结合P‑糖蛋白的核酸适配体、制备方法及其应用，属于生物技术领域。所述核酸适配体的核苷酸序列选自序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.14；是通过SELEX技术结合表面修饰的磁珠对原始随机寡核苷酸文库进行筛选、扩增、测序制备得到；所述核酸适配体分子量小，可以化学合成，成本低；亲和性和特异性强；便于标记；重复性和稳定性好，易于保存。可制作成荧光分子探针，实现生物体外组织、细胞上P‑gp的荧光可视化以及量化；可以特异性的结合P‑gp，抑制P‑gp的功能，成为P‑gp功能的潜在核酸型抑制剂。

Description

一种特异性结合P-糖蛋白的核酸适配体、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种特异性结合P-糖蛋白的核酸适配体、制备方法及其应用，属于核酸适配体技术领域。

背景技术

P-糖蛋白(P-gp)是由mdr 1基因编码的一种药物外排蛋白，在体内广泛分布于脑内毛细血管内皮细胞，肠道柱状上皮细胞，肝细胞面向胆小管的腔膜面等，与底物结合后将其从细胞浆中排出细胞，对药物在体内吸收、分布、代谢、排泄有重要的作用，它的底物广泛，其中包括黄酮类、查耳酮类、生物碱类、皂苷类等天然产物。研究表明P-gp的外排功能与肿瘤细胞的多药耐药性有关，寻找P-gp低毒、高效抑制剂成为抗肿瘤的有效策略之一。目前P-gp的经典抑制剂如维拉帕米、LY33597等，因其活性低、特异性差、细胞毒性高等缺陷，尚未广泛应用。

核酸适配体是利用指数富集的配体系统进化(SELEX)技术筛选得到的能特异结合靶物质的寡核苷酸片段。SELEX技术是上世纪90年代由Tuerk和Ellington等人发明的一种新的组合化学技术。它利用分子生物学技术，构建人工合成的随机寡核苷酸文库，其中随机序列长度一般在20～40nt左右，两端引物序列一般在20nt左右，文库容量大约在10¹⁴～10¹⁵范围内。由于单链寡核苷酸随机序列，尤其是RNA序列容易形成凸环、发卡、假节、G-四聚体等二级结构，故能与蛋白质、肽段、药物、氨基酸、有机化合物、甚至是金属离子相结合，形成具有很强结合力的复合体。SELEX技术具有经济、简便、快速等特点。与其他组合化学库如随机肽库、抗体库、噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸随机文库中筛选出的核酸适配体具有很多优势：(1)寡核苷酸本身分子量较小，易于合成，便于后续试验；(2)某些核酸适配体具有强于抗体的亲和性和特异性，无免疫原性；(3)核苷酸的化学结构和性质提供了易于标记的特性；(4)稳定性好，半衰期短，易于保存和运输，对高温和剧烈环境不敏感。(5)核酸适配体较于抗体易合成。因此，寡核苷酸核酸适配体在生物荧光可视化领域具有良好的应用前景，可以克服传统抗体在血液存在时间长，产生较高背景信号从而影响可视化效果的缺陷，可实现生物体外的组织、细胞水平上生物过程的可见、描述及定量。

目前，与P-gp具有高特异性和高亲和力的核酸适配体尚无相关报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种特异性结合P-糖蛋白的核酸适配体、制备方法及其应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种特异性结合P-糖蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸系列选自核苷酸序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.14的一种。

一种特异性结合P-糖蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体是与所述核苷酸序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.14中的一种序列一致性为60％以上，并且具有相同功能的核苷酸序列。

一种特异性结合P-糖蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体是与所述核苷酸序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.14的一种序列杂交，并且具有相同功能的寡核苷酸序列。

一种特异性结合P-糖蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体是与所述核苷酸序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.14的一种序列转录的RNA序列。

一种特异性结合P-糖蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体是与所述核苷酸序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.14的一种序列的不少于一个位置的A、T、C或G被稀有碱基甲基化嘌呤、二氢嘧啶或次黄嘌呤置换所得到的具有相同功能的核苷酸序列。

一种特异性结合P-糖蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体是与所述核苷酸序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.14的一种序列的任何位置删除或增加部分寡核苷酸残基所得到的具有相同功能的核苷酸序列。

一种特异性结合P-糖蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体是与所述核苷酸序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.14的一种序列的不少于一个位置进行磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、同位素化、结合生物素、结合地高辛、结合荧光物质、结合纳米发光材料或酶标记修饰所得到的具有相同功能的核苷酸序列。

一种特异性结合P-糖蛋白的核酸适配体的制备方法，所述方法步骤包括：

(1)将P-gp以共价结合形式固定在甲苯磺酰基修饰的磁珠上，得到共价结合P-gp的甲苯磺酰基修饰的磁珠；

(2)以所述共价结合P-gp的甲苯磺酰基修饰的磁珠为靶目标进行P-gp核酸适配的第1轮SELEX筛选：将所述共价结合P-gp的甲苯磺酰基修饰的磁珠与初始ssDNA文库进行孵育，解离得到ssDNA，进行PCR，得到PCR产物；

(3)将所述PCR产物利用链霉亲和素修饰的磁珠结合碱变性的方法制备得到ssDNA；

(4)得到的ssDNA将作为次级库用与下一轮的SELEX筛选：之后每一轮SELEX筛选均按照所述步骤(2)中第1轮SELEX筛选的方法进行；其中，每隔4轮筛选要进行1次反筛选；

(5)经过10轮的SELEX筛选后得到的ssDNA经PCR扩增的产物克隆至菌株中，培养后得到菌落后挑菌、测序，得到本发明所述的一种P-糖蛋白核酸适配体的核苷酸序列。

一种特异性结合P-糖蛋白的核酸适配体的应用，所述核酸适配体结合荧光物质后作为P-gp荧光可视化观察的分子工具使用。

一种特异性结合P-糖蛋白的核酸适配体的应用，所述核酸适配体作为P-糖蛋白抑制剂使用。

有益效果

本发明所述核酸适配体与P-gp具有高特异性和高亲和力。可制作成荧光分子探针，实现生物体外组织、细胞上P-gp的荧光可视化以及量化；可以特异性的结合P-gp，抑制P-gp的功能，成为P-gp功能的潜在核酸型抑制剂。

附图说明

图1为实施例1所述方法中第1～10轮SELEX筛选出的ssDNA与P-gp结合力结果。

图2为实施例2中20×物镜下的Cy5标记的SEQ ID No.6的荧光颜色。

图3为实施例2中20×物镜下的DAPI的荧光颜色。

图4为实施例2中20×物镜下的荧光颜色结果。

图5为实施例2中40×物镜下的荧光颜色结果。

图6为实施例3中对照组与模拟失重组荧光颜色后的有效荧光点数结果。

图7为实施例4中各组细胞内Rho 123的荧光强度结果。

图8为实施例5中各组细胞内Rho 123的荧光强度结果。

图9为实施例6中各组细胞内Rho 123的荧光强度结果。

图10为实施例7中各组细胞内Rho 123的荧光强度结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

以下实施例中：

若如特殊说明，所用试剂的百分数均为质量百分数。

所述核酸适配体记为Apt1～Apt14。

各荧光探针标记的荧光素及其激发波长与发射波长，如表1所示。

表1

实施例1

一种特异性结合P-糖蛋白的核酸适配体的制备方法：

本实施例中用于SELEX筛选的初始随机寡核苷酸(ssDNA)文库和引物序列由上海生工生物工程有限公司合成，其中初始随机寡核苷酸文库中有45个碱基为随机产生，36个固定碱基序列，序列表示如下：

5′-ATCCAGAGTGACGCAGCANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTGGACACGGTGGCTTAGT-3′。

上游引物序列为：5′-ATCCAGAGTGACGCAGCA-3′。

下游引物序列为：5′-ACTAAGCCACCGTGTCCA-3′。

生物素修饰上游引物：5′-biotin-C6-ATCCAGAGTGACGCAGCA-3′。

生物素修饰下游引物：5′-biotin-C6-ACTAAGCCACCGTGTCCA-3′。

甲苯磺酰基修饰的磁珠(TMB磁珠)和链霉亲和素修饰的磁珠(SMB磁珠)购于Dynal，Norway公司，PCR试剂盒购于Promega公司，柱式PCR产物纯化试剂盒购于SangonBiotech公司，Tran1-T1载体和pEASY-T1克隆试剂盒购于北京全式金公司，P-gp购于Cloud-Clone Corp公司。

(1)用甲苯磺酰基修饰的磁珠，按照磁珠的使用说明书将P-gp以共价结合形式固定在所述甲苯磺酰基修饰的磁珠上，得到共价结合P-gp的甲苯磺酰基修饰的磁珠；

(2)以所述共价结合P-gp的甲苯磺酰基修饰的磁珠为靶目标进行P-gp核酸适配的第1轮SELEX筛选：将所述共价结合P-gp的甲苯磺酰基修饰的磁珠与1OD的初始ssDNA文库在37℃孵育2h，之后进行磁力分离，200μL PBS(磷酸盐缓冲液)清洗3遍，加入40μL TE缓冲液(购自北京索莱宝科技有限公司)，振荡混匀后，置于95℃水浴中15min，磁力分离，获得4μL含有ssDNA的TE溶液，将所述含有ssDNA的TE溶液为模板，以上游引物和生物素修饰的下游引物使用PCR试剂盒进行PCR，得到PCR扩增的产物，将所述产物取5μL进行4％琼脂糖凝胶电泳，判断扩增程度和质量，剩余产物用柱式PCR产物纯化试剂盒进行纯化，除去多余的酶引物等小分子。

(3)用酶标仪测定纯化后双链DNA(dsDNA)浓度，根据测得的dsDNA浓度，及SMB磁珠的推荐固载量(100ng dsDNA/5μL SMB磁珠)，计算相应的SMB磁珠的用量；取相应体积的SMB磁珠，清洗后与纯化后的dsDNA混合，置于37℃孵育30min，用磷酸盐吐温缓冲液(PBST)清洗3遍，200μL 100mM NaOH溶液使dsDNA碱变性，磁力分离，去除磁珠，得到ssDNA溶液，加入40μL 1M NaH₂PO₄(pH 3.9)中和溶液中多余的NaOH，得到与靶分子具有亲和力的ssDNA。

(4)得到的ssDNA将作为次级库用与下一轮的SELEX筛选：之后每一轮SELEX筛选均按照所述步骤(2)中第1轮SELEX筛选的方法进行，不同的是随着筛选的进行，PCR中引物的用量和热循环次数随之变化，具体的为：第1轮～第5轮引物用量为2.5μL(10μM)，热循环15次；第6轮引物为5μL(10μM)，热循环20次；第7轮～第8轮引物用量为2.5μL(10μM)，热循环15次；第9轮～第10轮引物用量为5μL(10μM)，热循环20次。其中，每隔4轮筛选要进行1次反筛选，即使用未固定P-gp的甲苯磺酰基磁珠为靶目标与前一轮SELEX筛选得到的ssDNA文库进行孵育，2h后磁力分离去除磁珠，这样便可将与磁珠特异性结合的ssDNA除去，避免磁珠对筛选的影响。经过10轮的SELEX筛选，将每1轮制备出的ssDNA与等摩尔质量的P-gp进行酶联免疫吸附试验，对各轮ssDNA与P-gp的结合量和结合能力进行表征。如图1所示，图1中左侧纵坐标表示吸光度，横坐标1～10分别表示1～10轮SELEX的筛选制备出的ssDNA，与等摩尔质量的P-gp、卵清蛋白、牛血清白蛋白(BSA)进行酶联免疫吸附试验后的样品。可以看到，通过10轮的筛选，P-gp与ssDNA的结合力不再升高，达到饱和状态，所以在第10轮筛选之后，终止SELEX筛选。

(5)在得到第10轮SELEX筛选出的ssDNA之后，对所述第10轮SELEX筛选出的ssDNA进行PCR扩增，使用的引物是上游引物和下游引物，引物用量5μL(10μM)，热循环20次，扩增结束后电泳检测，产物条带明亮清晰。使用pEASY-T1克隆试剂盒将第10轮SELEX筛选出的ssDNA经PCR扩增的产物克隆至Tran1-T1感受态细胞中，经过热激、孵育后，均匀的将其涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养12小时，菌株菌落呈白色原斑状，清晰明显，挑选其中的单个菌落，置于LB液体培养集中，37℃培养12小时，然后进行测序，所述核酸适配体的核苷酸系列选自核苷酸序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.14的一种(序列方向为5′到3′端)。

核苷酸序列表中SEQ ID No.1所述的核苷酸序列：

5′-ATCCAGAGTGACGCAGCACGCGCTCGGGTAAAGAAGTTGTCGTGTGAGGATTGCCAGGTCTGCTGGACACGGTGGCTTAGT-3′

核苷酸序列表中SEQ ID No.2所述的核苷酸序列：

5′-ATCCAGAGTGACGCAGCATACCGCAGAATAACACCCTCATATATCTAGTCTTTACTCCCCCTTTGGACACGGTGGCTTAGT-3′

核苷酸序列表中SEQ ID No.3所述的核苷酸序列：

5′-ATCCAGAGTGACGCAGCAGCCAAGATAAGGTGAAATTTTCCTGCTCACAGGAGGACGCGTTCATGGACACGGTGGCTTAGT-3′

核苷酸序列表中SEQ ID No.4所述的核苷酸序列：

5′-ATCCAGAGTGACGCAGCAGGACCTCGCCTTCAATGCGGACCGCACCTCTCACATACACTCCTATGGACACGGTGGCTTAGT-3′

核苷酸序列表中SEQ ID No.5所述的核苷酸序列：

5′-ATCCAGAGTGACGCAGCATACCCATCCATATCCGACCCCCCCCTGGAAGACCTAAATCTGTCCTGGACACGGTGGCTTAGT-3′

核苷酸序列表中SEQ ID No.6所述的核苷酸序列：

5′-ATCCAGAGTGACGCAGCAGGGGGTGGGTGGGGGCATGTTGTAGTGCTGATGTGTGGGGGTGGGTGGACACGGTGGCTTAGT-3′

核苷酸序列表中SEQ ID No.7所述的核苷酸序列：

5′-ATCCAGAGTGACGCAGCACCCGTTATTGACTACCGACTAGCATGATTTGGCTTACCTTTGGAGTGGACACGGTGGCTTAGT-3′

核苷酸序列表中SEQ ID No.8所述的核苷酸序列：

5′-ATCCAGAGTGACGCAGCAAGATCCTCATACCTGCACCCCGACTTGTTCTCCTACCCCCATTATTGGACACGGTGGCTTAGT-3′

核苷酸序列表中SEQ ID No.9所述的核苷酸序列：

5′-ATCCAGAGTGACGCAGCAACAACGGCTTTTCCCTGTGTGCAAACCATGTAAGTCCTTCCAGAGTGGACACGGTGGCTTAGT-3′

核苷酸序列表中SEQ ID No.10所述的核苷酸序列：

5′-ATCCAGAGTGACGCAGCATGTAGCCGTAATCTTACGTTATGCGGGTTGCAACTTGGGCTCGTGTGGACACGGTGGCTTAGT-3′

核苷酸序列表中SEQ ID No.11所述的核苷酸序列：

5′-ATCCAGAGTGACGCAGCAGGAGGTGGAAAGCAAAGTCCCATCAATTGGACTTTATGGGAGTTGTGGACACGGTGGCTTAGT-3′

核苷酸序列表中SEQ ID No.12所述的核苷酸序列：

5′-ATCCAGAGTGACGCAGCATCCCTCCAACAATGCCTCAATTCCACCCATAGACTCTCAACTACGTGGACACGGTGGCTTAGT-3′

核苷酸序列表中SEQ ID No.13所述的核苷酸序列：

5′-ATCCAGAGTGACGCAGCAGCATAAGGGGTAGGAGGATTTGTGTTGGTATTGTTTGGAGTTTAGTGGACACGGTGGCTTAGT-3′

核苷酸序列表中SEQ ID No.14所述的核苷酸序列：

5′-ATCCAGAGTGACGCAGCATGGCGAGAAGTGGCTGTACAGACTATATATGTGTGAGATAGTGTGTGGACACGGTGGCTTAGT-3′

经核酸多序列比对程序Clustal X软件分析，实验筛选得到的14条适配体，其一级序列结构存在结构相似性，均具备TTTTCC、CCCCC、TGGG等重复序列。用mfold工具模拟适配体的二级结构，结果显示，适配体的二级结构主要是凸环和口袋，且No.2、No.3、No.8和No.12号适配体的特点是序列在5′到3′端形成单一的53-59个碱基的大口袋，在随机序列区或3′端形成2～3个小茎环；而No.1、No.4-No.7、No.9-No.11、No.13和No.14号适配体的特点是序列从5′到3′端形成单一的23～46个碱基的口袋，在口袋上的5′端、随机序列区或3′端形成2～4个较大的茎环。其二级结构如下所示：

所述SEQ ID No.1所述的核苷酸序列具有下述结构：

所述SEQ ID No.2所述的核苷酸序列具有下述结构：

所述SEQ ID No.3所述的核苷酸序列具有下述结构：

所述SEQ ID No.4所述的核苷酸序列具有下述结构：

所述SEQ ID No.5所述的核苷酸序列具有下述结构：

所述SEQ ID No.6所述的核苷酸序列具有下述结构：

所述SEQ ID No.7所述的核苷酸序列具有下述结构：

所述SEQ ID No.8所述的核苷酸序列具有下述结构：

所述SEQ ID No.9所述的核苷酸序列具有下述结构：

所述SEQ ID No.10所述的核苷酸序列具有下述结构：

所述SEQ ID No.11所述的核苷酸序列具有下述结构：

所述SEQ ID No.12所述的核苷酸序列具有下述结构：

所述SEQ ID No.13所述的核苷酸序列具有下述结构：

所述SEQ ID No.14所述的核苷酸序列具有下述结构：

实施例2

一种P-gp核酸适配体对人脑微管内皮细胞(HBMECs)中P-gp的荧光可视化应用：

(1)培养HBMECs：实验使用的HBMECs购自赛百慷上海生物技术股份有限公司，并按照1％的双抗(青链霉素混合液(100×)；北京索莱宝科技有限公司)、10％的血清(四季青胎牛血清；浙江天杭生物科技有限公司)与RPMI-1640培养基(美国Gibco公司)配制成细胞培养液。将细胞按照1×10⁵个/mL的密度接种到confocal小皿(美国Corning公司)中，置于37℃、5％CO₂浓度的细胞培养箱中培养1～2天，使倒置显微镜下观察到细胞铺满皿底的80％。

(2)将贴壁生长良好的HBMECs用2mL的4％多聚甲醛组织细胞固定液(北京索莱宝科技有限公司)在室温下处理15min。弃去固定液后，加入2mL的磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗3次，每次PBS的加入量为2mL。然后加入2mL、5％BSA(北京索莱宝科技有限公司)室温封闭2h。回收封闭液后，加入2mL Cy5标记的Apt 6(合成自上海生工生物工程有限公司，稀释比例1:400)，在4℃摇床下孵育过夜。回收P-gp适配体，加入PBS清洗3次(PBS的用量为2mL/次)后，加入2mL DAPI(上海赛默飞世尔科技有限公司，稀释比例1:200)，常温染色15min。用PBS清洗3次后，弃去皿中溶液。

(3)在荧光共聚焦显微镜下观察，选择400nm和650nm两个通道的激发波长，分别在20×、40×物镜下观察细胞的荧光染色情况，随机挑选观察视野并拍照后进行分析。其中，20×物镜下，Cy5标记的Apt 6的荧光颜色为红色，如图2所示；DAPI的荧光颜色为蓝色，如图3所示；用DAPI染色后的HBMECs的P-gp核酸适配体的荧光图如图4所示，40×物镜下的荧光染色图如图5所示，实验结果表明，P-gp荧光适配体对HBMECs上P-gp蛋白的染色能够呈现出良好的细胞结构特征，可以成为P-gp荧光可视化观察的分子工具。

实施例3

一种荧光核酸适配体对大鼠脑组织冷冻切片上P-gp的可视化及量化研究：

(1)选取11周龄健康的SPF级SD雄性大鼠共6只(购自中国药品生物制品鉴定所实验动物资源中心)，分为两组并编号，每组3只，一组为对照组，另一组为模拟失重组。实验开始前进行一周的适应性喂养，之后对模拟失重组的大鼠进行尾悬吊，对照组正常饲养。21天后，将两组大鼠用3％戊巴比妥钠麻醉，收集脑样并制作脑组织冷冻切片。

(2)对大鼠脑组织切片进行荧光染色，染色步骤如下：

①将Ⅷ因子相关抗原抗体(北京博奥森生物技术有限公司)按1:200比例稀释，与用0.2％曲拉通-100处理10min、5％牛血清白蛋白封闭1h的脑组织切片孵育，放入4℃摇床过夜(Ⅷ因子相关抗原抗体可以对组织切片上的HBMECs进行特异性的识别)；然后在室温下，脑组织切片与FITC标记的二抗孵育2h；

②将Cy5标记的Apt 6(合成自上海生工生物工程有限公司)按1:200比例稀释，与①中的脑组织切片室温下孵育1h；

③将DAPI染料按1:50比例稀释，在室温下与②中脑组织切片孵育10min；用甘油封片剂处理脑组织切片，供倒置荧光显微镜观察使用。

(3)将(2)中处理得到的玻片置于倒置荧光显微镜下观察，随机统计5个视野中的Ⅷ因子相关抗原抗体、Cy5标记的Apt 6和DAPI三种荧光颜色重合的荧光点数(记为有效荧光点)，结果如图6所示，结果表明，Cy5标记的Apt 6对大鼠脑组织切片上P-gp具有良好的特异性识别能力，并且通过对照组与模拟失重组的对比可实现对P-gp的量化性描述。

实施例4

一种P-gp核酸适配体对正常培养的HBMECs上P-gp功能的抑制性实验研究：

(1)将生长状态良好的人脑微管内皮细胞(HBMECs)以2×10⁵～5×10⁵个/mL的密度接种到96孔板中(3599，美国corning公司)，每孔100μL，复孔为4。该实验分别为阴性对照组、阳性对照组、Apt 1实验组和Apt 6实验组，其中阴性对照组为PBS，阳性对照为环孢菌A(cyclosporine A)，将孔板放进37℃、5％CO₂的培养箱中培养12h，使细胞贴壁生长。

(2)将P-gp的底物Rho 123按表2的配比分别与PBS、cyclosporine A、Apt 1、Apt 6以及培养基配制成混合溶液(Apt 1和Apt 6的贮存浓度为100μM；cyclosporine A的贮存浓度为10000μM；Rho 123的贮存浓度为2500μM)。弃去96孔板中的培养基并用PBS清洗两遍，每组中加入对应的混合溶液(100μL/孔)，并将孔板用锡箔纸包裹后，放入培养箱中培养2h。

表2

(3)弃去96孔板中的溶液，用PBS清洗3次，每孔加入0.1％的曲拉通-100(北京索莱宝科技有限公司)，置于培养箱中15min后将每孔溶液平行转移至96孔荧光用孔板中(3603，corning公司)，最后用酶标仪检测每孔的荧光强度(激发光波长485nm；发射光波长535nm)。

(4)使用prism软件对数据进行分析，结果如图7所示，结果表明Apt 1和Apt 6对正常培养的HBMECs上的P-gp功能均具有抑制效果，且Apt 6的抑制效果具有显著性(与阴性对照组相比，**P＜0.01)。

实施例5

一种P-gp核酸适配体对模拟微重力效应下的HBMECs上P-gp功能的抑制性实验研究：

(1)将生长状态良好的HBMECs以1×10⁶个/mL的密度接种到T25培养瓶中(美国corning公司)，并放进37℃、5％CO₂的培养箱中培养24h，使细胞贴壁生长。然后将T25培养瓶取出，用培养基加满，并用封口膜封缠好，放入到四口模具中，并将模具固定在三维双轴回转仪上(SM-31，中科院空间科学与应用研究中心)，设置参数为内框30rpm/min，外框30rpm/min。模拟微重力效应24h后，取出T25培养瓶，弃去培养基，用胰酶消化细胞，重悬细胞后调整细胞密度为2×10⁵～5×10⁵个/mL，并将细胞以500μL/管转移至15mL离心管(美国corning公司)中。该实验分别设置阴性对照组、阳性对照组、Apt 1实验组和Apt 6实验组，其中阴性对照为PBS，阳性对照为环孢菌A(cyclosporine A)。

(2)按表3的配比将Rho 123分别与PBS、cyclosporine A、Apt 1、Apt 6以及培养基配制成混合溶液(Apt 1和Apt 6的贮存浓度为100μM；cyclosporine A的贮存浓度为10000μM；Rho 123的贮存浓度为2500μM)。对离心管中悬浮的细胞进行离心(1000rpm，5min)，弃去上清培养基，每组中加入对应混合溶液(500μL/管)，并将离心管用锡箔纸包裹后，放入培养箱中培养2h。

表3

(3)取出离心管后，用PBS清洗3次，每次均用离心机离心后弃去上层洗液。然后，每管中加入0.1％的曲拉通-100(北京索莱宝科技有限公司)溶液500μL，置于培养箱中15min后用移液枪将每组溶液转移至96孔荧光用孔板中(3603，corning公司)，100μL/孔，2个复孔。最后用酶标仪检测每孔的荧光强度(激发光波长485nm；发射光波长535nm)。

(4)使用prism软件对数据进行分析，结果如图8所示，结果表明，Apt 1和Apt 6对模拟微重力效应下的HBMECs上的P-gp功能具有抑制效果，且Apt 1对P-gp功能的抑制具有显著性(与阴性对照组相比，****P＜0.0001)。

实施例6

一种P-gp核酸适配体对正常培养的Caco-2细胞上P-gp功能的抑制性研究：

(1)将生长状态良好的Caco-2细胞以2×10⁵～5×10⁵个/mL的密度接种到96孔板中(3599，美国corning公司)，每孔100μL，复孔为4。该实验共设置3组，分别为阴性对照组、阳性对照组以及实验组，其中阴性对照为PBS，阳性对照为cyclosporine A，实验组为Apt 6，并将孔板放进37℃、5％CO₂的培养箱中培养12h，使细胞贴壁生长。

(2)按表4的配比将Rho 123分别与PBS、cyclosporine A、Apt 6以及培养基配制成混合溶液(Apt 1和Apt 6的贮存浓度为100μM；cyclosporine A的贮存浓度为10000μM；Rho123的贮存浓度为2500μM)。弃去96孔板中的培养基并用PBS清洗两遍，每组中再加入对应的混合溶液(100μL/孔)，并将孔板用锡箔纸包裹后，放入培养箱中培养2h。

表4

(3)弃去96孔板中的混合溶液，用PBS清洗3次，每孔加入0.1％的曲拉通-100(北京索莱宝科技有限公司)溶液，置于培养箱中15min后将每孔溶液平行转移至96孔荧光用孔板中(3603，corning公司)，最后用酶标仪检测每孔的荧光强度(激发光波长485nm；发射光波长535nm)。

(4)使用prism软件对数据进行分析，结果如图9所示，结果表明，Apt 6对正常培养的Caco-2上的P-gp功能具有抑制效果，且Apt 6对P-gp功能的抑制具有显著性(与阴性对照相比，**P＜0.05)。

实施例7

一种P-gp核酸适配体在模拟微重力效应下的Caco-2细胞上P-gp功能的抑制性研究：

(1)将生长状态良好的Caco-2细胞以1×10⁶个/mL的密度接种到T25培养瓶中(美国corning公司)，并放进37℃、5％CO₂的培养箱中培养，使细胞贴壁生长。然后将T25培养瓶取出，用培养基加满，并用封口膜封缠好，放入到四口模具中，并将模具固定在三维双轴回转仪上(SM-31，中科院空间科学与应用研究中心)，设置参数为内框30r/min，外框30rpm/min。模拟微重力效应24h后，取出T25培养瓶，弃去培养基，用胰酶消化细胞，重悬细胞后调整细胞密度为2×10⁵～5×10⁵个/mL，并将细胞以500μL/管转移至15mL离心管(美国corning公司)中。该实验共设置3组，分别为阴性对照组、阳性对照组以及实验组，其中阴性对照为PBS，阳性对照为cyclosporine A，实验组为Apt 6。

(2)按表5的配比将Rho 123分别与PBS、cyclosporine A、Apt 6以及培养基配制成混合溶液(Apt 1和Apt 6的贮存浓度为100μM；cyclosporine A的贮存浓度为10000μM；Rho123的贮存浓度为2500μM)。对离心管中悬浮的细胞进行离心(1000rpm，5min)，弃去上清培养基，每组中再加入对应的混合溶液，每管仍500μL，并将离心管用锡箔纸包裹后，放入培养箱中培养2h。

表5

(3)取出离心管后，用PBS清洗3次，每次均用离心机离心后弃去上层洗液。然后，每管加入0.1％的曲拉通-100(北京索莱宝科技有限公司)溶液500μL，置于培养箱中15min后用移液枪将每组溶液转移至96孔荧光用孔板中(3603，corning公司)，100μL/孔，2个复孔。最后用酶标仪检测每孔的荧光强度(激发光波长485nm；发射光波长535nm)。

(4)使用prism软件对数据进行分析，结果如图10所示，结果表明，Apt 6对模拟微重力效应下的Caco-2上的P-gp功能具有抑制效果，且Apt 6对P-gp功能的抑制效果具有显著性(与阴性对照相比，***P＜0.001)。

实施例8

一组P-gp核酸适配体在SD大鼠体内对鼠脑中P-gp功能的抑制性研究：

(1)选取11周龄健康的SPF级SD雄性大鼠共4只(购自中国药品生物制品鉴定所实验动物资源中心)，分为两组并编号，每组2只，一组为对照组，另一组为适配体组。实验开始前进行一周的适应性喂养。

(2)用乙醚对SD大鼠进行麻醉，经股静脉注射生理盐水(对照组)和Apt 6(适配体组)，其中适配体的注射剂量为4OD/100g(大鼠体重)。10min后，每组大鼠均注射Rho 123溶液，注射剂量为0.02mg/100g(大鼠体重)。45min后，用3％的戊巴比妥钠麻醉大鼠，并取血样、脑样。

(3)精密称取鼠脑样本适量，加入4倍体积预冷的生理盐水制成匀浆。将脑匀浆和血样本按比例混匀(生理盐水：样品：甲醇＝1：1：3)，然后离心取上清待测，离心条件为4℃，12000g，10min。此外，需制作系列浓度梯度的Rho 123标准曲线。

(4)采用紫外荧光酶标仪测定脑组织和血浆中Rho 123的荧光强度(激发光波长485nm；发射光波长535nm)，并通过Rho 123的标准曲线计算脑组织中的Rho 123浓度与血浆中的Rho 123浓度，最终结果以二者的比值(脑血比)表示，以评价P-gp的功能。

实验结果表明对照组大鼠血液、脑中Rho 123含量分别是46.39±8.67、20.0±2.99ng/mL，注射Apt 6的大鼠血液、脑中含量分别是47.57±6.73、27.9±2.81ng/mL，两组的脑血比分别是0.432±0.016、0.588±0.024ng/mL。与对照组相比，给与了Apt 6后鼠脑中Rho 123的含量显著上升(**P＜0.05)，且脑血比增加，Apt 6表现出了对鼠脑中P-gp功能的抑制作用。

综上所述，发明包括但不限于以上实施例，凡是在本发明的精神和原则之下进行的任何等同替换或局部改进，都将视为在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种特异性结合P-糖蛋白的核酸适配体，其特征在于：所述核酸适配体的核苷酸序列选自核苷酸序列表中SEQ ID No.1或SEQ ID No.6。

2.一种如权利要求1所述的特异性结合P-糖蛋白的核酸适配体的应用，其特征在于：如核苷酸序列表中SEQ ID No.6所述核酸适配体结合荧光物质后作为P-gp荧光可视化观察的分子工具使用。

3.一种如权利要求1所述的一种特异性结合P-糖蛋白的核酸适配体的应用，其特征在于：所述核酸适配体在制备P-糖蛋白功能抑制剂中的应用。