CZ307016B6

CZ307016B6 - Způsob stabilizace protilátek rozeznávajících 5-bromo-2´-deoxyuridin a/nebo 5-chloro-2´-deoxyuridin a/nebo 5-jodo-2´-deoxyuridin v místech inkorporace těchto nukleosidů do DNA po působení jednomocnou mědí a/nebo exonukleázou III

Info

Publication number: CZ307016B6
Application number: CZ2015-183A
Authority: CZ
Inventors: Karel Koberna; Anna Ligasová
Original assignee: Univerzita PalackĂ©ho v Olomouci
Priority date: 2015-03-13
Filing date: 2015-03-13
Publication date: 2017-11-15
Also published as: CZ2015183A3

Description

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu stabilizace protilátek rozeznávajících 5-bromo-2'-deoxyuridin a/nebo 5-chloro-2'-deoxyuridin a/nebo 5-jodo-2'-deoxyuridin ve dvouřetězcové DNA v místech inkorporace těchto nukleosidů do DNA po působení jednomocnou mědí a/nebo exonukleázou III.

Dosavadní stav techniky

Použití systémů pro detekci značené DNA založených na reakci specifické protilátky a značících nukleosidů, které jsou součástí DNA, se specifickými protilátkami je běžné jak v základním, tak aplikovaném výzkumu. Nejčastějším příkladem takto používaných nukleosidů je 5-bromo-2'deoxyuridin (BrdU), 5-chloro-2'-deoxyuridin (CldU) nebo 5-jodo-2'-deoxyuridin (IdU), dále jen značené nukleosidy. Použití značených nukleosidů dovoluje např. rychlou analýzu buněčných populací z hlediska jejich proliferační aktivity.

Jelikož tyto specifické značící nukleosidy jsou ve struktuře dvouřetězcové DNA zpravidla nepřístupné pro reakci s protilátkou, jsou pro jejich zpřístupnění v buňkách a tkáních používány speciální kroky (např. Genes Dev, 14, 2855-2868; J Cell Sci, 115, 4037^1051; PLoS One, 7, e52584), které jsou naprosto klíčové pro následující detekce značené dvouřetězcové DNA. Příkladem těchto kroků je použití roztoků kyseliny chlorovodíkové (depurinace), hydroxidu sodného (rozvolnění struktury DNA v důsledku deprotonace nukleobází), použití DNázy I nebo směsi DNázy I a exonukleázy, použití jednomocných iontů mědi nebo kombinace jednomocných iontů mědi a následného použití exonukleázy. V závislosti na typu zpřístupnění a intenzitě působení dochází k menším nebo větším poškozením DNA a dalších buněčných struktur, přičemž systémy založené na enzymatickém přístupu, případně založené na působení mědi jsou především s ohledem na nižší stupeň poškození buněčné struktury výhodnější než systémy založené na působení kyseliny nebo hydroxidu.

Podstata vynálezu

Naše výsledky ukázaly, že veškeré systémy založené na působení mědi a/nebo na použití exonukleázy III jsou velice citlivé ke kvalitě použité protilátky. Obecně protilátky s nižší afinitou vůči značeným nukleosidům neposkytují dostatečný signál, případně je tento signál velice nestabilní a v průběhu času dochází k jeho ztrátě. Předkládaná přihláška vynálezu popisuje postup umožňující efektivní stabilizaci protilátek v místech inkorporace značených nukleosidů při použití systémů pro zpřístupnění značených nukleosidů pomocí měďných iontů a/nebo exonukleázy

III. Systém je založen na inkubaci vzorku se značenými nukleosidy v buněčné DNA v roztoku obsahujícím formaldehyd. Tento krok je použit po ovlivnění buněk nebo tkání měďnými ionty a/nebo exonukleázou III a reakci s protilátkami rozeznávajícími BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU. Příklady provedení zahrnují jak případ, kdy je použit protilátkový systém založený na dvou protilátkách, kdy je v prvním kroku provedena reakce s tzv. primární protilátkou, která specificky rozeznává BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU (dále jen primární protilátka), následně je tato protilátka stabilizována v místě inkorporace značeného nukleosidů pomocí roztoku formaldehydu a pak je provedena reakce s druhou, tzv. sekundární protilátkou (dále jen sekundární protilátka), která specificky rozeznává primární protilátku, tak i případ, kdy je použita protilátka rozeznávající BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU a tato protilátka je konjugována s dalšími látkami např. typu fluorochromů nebo biotinu nebo dalšími látkami. Výsledky ukázaly, že stabilizační krok založený na inkubaci vzorků v roztoku formaldehydu zpravidla negativně neovlivňuje následnou reakci

- 1 CZ 307016 B6 primárních protilátek se sekundárními protilátkami a rovněž je plně slučitelný s detekcí pomocí protilátek konjugovaných s dalšími látkami např. typu fluorochromů nebo biotinu nebo dalšími látkami. Příklady provedení demonstrují, že přístup je využitelný ve všech situacích, kdy je použita jednomocná měď a/nebo exonukleáza III jako součást protokolu pro odhalení značených nukleosidů v buněčné DNA. To zahrnuje veškeré případy, kdy jsou měďné ionty použity samostatně nebo v kombinaci s exonukleázou III, tak případy, kdy je exonukleáza III použita samostatně např. v případě řezů nebo v kombinaci např. s kyselinou případně s DNázou I.

Objasnění výkresu

Obr. 1 Na obrázku jsou znázorněny výsledky detekce BrdU inkorporovaného v buněčné DNA po použití jednomocné mědi a exonukleázy lil s použitím (plus) nebo bez použití (mínus) stabilizačního kroku pomocí formaldehydu (FA). Pro detekci BrdU bylo použito několik různých klonů primárních protilátek proti BrdU. Protilátky byly nebo nebyly po reakci fixovány formaldehydem a následně byly detekovány pomocí sekundární protilátky konjugované s fluorochromem. Graf ukazuje signál v jádrech replikujících buněk (buněk obsahujících BrdU). Z grafu je patrné, že působení formaldehydu výrazně zvyšuje signál u všech použitých protilátek.

Příklady uskutečnění vynálezu

Seznam použitých zkratek

HeLa DMEM PBS BrdU CldU IdU	buněčná linie lidských epiteliálních buněk Dulbeccova modifikace Eaglova média fosfátem pufrovaný fyziologický roztok 5-bromo-2'-deoxyuridin 5-chloro-2'-deoxyuridin 5-jodo-2'-deoxyuridin
S-MEM HC1	modifikace Eaglova minimálního média pro suspenzní buňky kyselina chlorovodíková

Příklad 1

Stabilizace protilátek rozeznávajících BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU v DNA v místech inkorporace těchto nukleosidů po působení měďnými ionty a exonukleázou III v buňkách přisedlých na podložních sklíčkách.

Následující postup popisuje stabilizaci protilátek namířených proti BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU v HeLa buňkách přisedlých na podložních sklíčkách po působení měďnými ionty a exonukleázou

III. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.

A) Lidské HeLa buňky (dále jen vzorky) byly pěstovány v Petriho miskách na kruhových sklech o průměru 12 mm v růstovém médiu DMEM s L-glutaminem (Gibco) s 10% (obj./obj.) fetálním telecím sérem (PAA Laboratories), 1% (obj./obj.) gentamicinem a 3,7 g/l NaHCO₃ v atmosféře s 5% (obj./obj.) CO₂ při 37 °C.

B) Druhý den po pasáži byl do růstového média přidán BrdU v konečné koncentraci 10 pmol.l '. Vzorky byly inkubovány alternativně 10, 20, 30 nebo 60 minut v atmosféře s 5% (obj./obj.) CO₂

-2CZ 307016 B6 při 37 °C. Alternativně byl do růstového média přidán CldU nebo IdU ve stejné koncentraci jako

BrdU.

C) Následně bylo růstové médium odstraněno a nahrazeno pufrem (lx PBS, složení viz část Použité roztoky a chemikálie, přidány byly přibližně 1 až 2 ml pufru na 4 cm² plochy).

D) Pufr byl odstraněn a vzorky byly 10 minut fixovány 2% (hmotnost/obj.) roztokem formaldehydu v lx PBS (pH 7,4; 1 až 2 ml fixačního roztoku na 4 cm plochy).

Alternativně byly vzorky fixovány metanolem a následně acetonem. V tomto případě byla skla se vzorky nejdříve inkubována 10 minut v metanolu při teplotě -20 °C (přibližně 1 až 2 ml metanolu na 4 cm² plochy) a následně ponořena na 30 sekund do kádinky s 50 ml acetonu o teplotě místnosti, skla se vzorky pak byla usušena a po usušení položena do Petriho misky s lx PBS. V případě použití metanolu a acetonu následoval krok G).

E) Roztok formaldehydu byl odstraněn a vzorky byly převrstveny lx PBS (přibližně 1 až 2 ml lx PBS na 4 cm² plochy). Po 5 minutách byl pufr odstraněn a nahrazen novým o stejném složení. Tento krok byl opakován ještě jednou.

F) Následně byl pufr odstraněn. Vzorky byly 10 minut permeabilizovány alternativně v 0,1% nebo 0,2% nebo 0,5% (obj./obj.) roztokem Tritonu X-100 v lx PBS (přibližně 1 až 2 ml permeabilizačního roztoku na 4 cm² plochy). Po odstranění permeabilizačního roztoku byly vzorky převrstveny lx PBS (přibližně 1 až 2 ml lx PBS na 4 cm² plochy).

G) Po 5 minutách byl roztok lx PBS odstraněn a nahrazen stejným množstvím téhož roztoku. Tento krok byl opakován ještě jednou.

H) Z misek byl odstraněn roztok lx PBS, vzorky byly převrstveny stejným množstvím roztoku obsahujícím 10 mmol.f¹ askorbátu sodného, 4 mmol.f¹ síranu mědnatého, 20 mmol.f¹ glycinu a 100 mmol.f¹ chloridu sodného.

I) Petriho misky se vzorky na sklech byly přemístěny na třepačku (Thermomixer comfort, Eppendorf) a zde byly inkubovány 10 minut při rychlosti 300 otáček/minutu.

J) Inkubační roztok byl odstraněn a vzorky byly převrstveny roztokem 100 mmol.f¹ tris(hydroxymetyl)aminometamin s HC1 (dále jen 100 mmol.f¹ Tris-HCl), pH 7,5 (přibližně 1 až 2 ml roztoku na 4 cm² plochy). Po jedné minutě byl roztok 100 mmol.f¹ Tris-HCl odstraněn a nahrazen stejným množstvím roztoku 100 mmol.f¹ Tris-HCl. Tento krok byl opakován ještě jednou.

K) Petriho misky se vzorky na sklech byly přemístěny na třepačku (Thermomixer comfort, Eppendorf) a zde byly inkubovány 10 minut při rychlosti 300 otáček/minutu.

L) Skla se vzorky byla vyjmuta pomocí pinzety z Petriho misky a přebytek roztoku byl odsát pomocí filtračního papíru tak, že skla se vzorky byla položena stranou bez vzorků na filtrační papír. Skla se vzorky byla položena na kapky 100 mmol.l¹ Tris-HCl, pH 7,5 na parafilmu (50 μΐ/kapka). Skla směřovala vrstvou se vzorky směrem dolů do kapky.

M) Následně byly vzorky inkubovány 30 minut s myší protilátkou rozeznávající BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU (konečná koncentrace protilátky byla alternativně 0,1; 1; 10, 100 a 200 μg/ml) a exonukleázou III (konečná koncentrace IU/ μΐ, Fermentas; viz část Použité roztoky a chemikálie) v roztoku lx pufru pro exonukleázu III (66 mmol.f¹ Tris (pH 8,0 při 30 °C), 0,66 mmol.l ¹MgCl₂; viz část Použité roztoky a chemikálie) na kapkách o velikosti 20 μΐ.

-3 CZ 307016 B6

N) Skla se vzorky byla přenesena na kapku roztoku 100 mmol.l“¹ Tris-HCl a 100 mmol.l”¹ NaCl, pH 7,5. Po 5 minutách byla skla se vzorky přenesena na novou kapku roztoku 100 mmol.l¹ TrisHCl a 100 mmol.r¹ NaCl, pH 7,5, alternativně byl tento krok vynechán a pokračovalo se krokem O.

O) Skla se vzorky byla přenesena na kapku roztoku lx PBS. Po 5 minutách byla skla se vzorky přenesena na novou kapku roztoku lx PBS. Tento krok byl ještě jednou opakován. Alternativně byl tento krok vynechán nebo spočíval jen v jediném přenesení na kapku lx PBS.

P) Skla se vzorky byla okamžitě přenesena na kapku roztoku alternativně 0,1%; 0,5%; 1%; 2%; 10% nebo 20% formaldehydu v lx PBS a inkubována alternativně po dobu 1,10 nebo 60 minut.

R) Skla se vzorky byla přenesena na kapku roztoku lx PBS. Po 5 minutách byla skla se vzorky přenesena na novou kapku roztoku lx PBS. Tento krok byl ještě jednou opakován.

Q) Skla se vzorky byla přenesena na kapku roztoku 100 mmol.l¹ Tris-HCl a 100 mmol.r¹ NaCl, pH 7,5. Po 5 minutách byla skla se vzorky přenesena na novou kapku roztoku 100 mmol.r¹ TrisHCl a 100 mmol.l“¹ NaCl, pH 7,5. Tento krok byl ještě jednou opakován. Alternativně byl místo Tris-HCl použit lx PBS.

R) Skla se vzorky byla inkubována 30 minut s kozí anti-myší protilátkou konjugovanou s fluorochromem Cy3 (Jackson Immunoresearch Laboratories, ředění 1:100 ve 100 mmol.r¹ Tris-HCl a 100 mmol.l¹ NaCl, pH 7,5) na kapkách o velikosti 20 μΐ. Alternativně byl namísto Tris-HCl použit lxPBS.

S) Skla se vzorky byla přenesena na kapku 100 mmol.r¹ Tris-HCl a 100 mmol.l“¹ NaCl, pH 7,5 (50 μΐ). Po 5 minutách byla skla s buňkami přenesena na novou kapku 100 mmol.l“¹ Tris-HCl a 100 mmol.l”¹ NaCl, pH 7,5. Tento krok byl ještě třikrát opakován. Alternativně byl namísto Tris-HCl použit lx PBS. Následně byla skla se vzorky přenesena na kapku destilované vody (50 μΐ). Po 5 minutách byla skla se vzorky přenesena na novou kapku destilované vody. Tento krok byl ještě třikrát opakován.

T) Nakonec byla voda ze skel odsáta pomocí filtračního papíru, skla byla položena na nový filtrační papír vzorky nahoru a usušena.

U) Po usušení byla skla položena na kapíčky (2 μΐ) připraveného roztoku 50% glycerinu na podložním skle. Vzorky směřovaly do kapičky roztoku. Jemným tlakem pomocí pinzety na horní stranu skel se vzorky došlo k roztažení roztoku po celé ploše skel. Signál byl detekován pomocí fluorescenčního mikroskopu.

Příklad 2

Stabilizace protilátek rozeznávajících BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU v DNA v místech inkorporace těchto nukleosidů po působení měďnými ionty a exonukleázou III ve tkáních.

Následující postup popisuje stabilizaci protilátek namířených proti BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU ve tkáních po působení měďnými ionty a exonukleázou III. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.

A) Třídenní potkaní samci byli usmrceni dekapitací a následně jim byla vyjmuta játra. Játra byla nakrájena na malé kousky (3 mm - nejdelší rozměr) a položena do Petriho misek s HeLa buňkami inkubovanými jeden den v růstovém médiu DMEM s L-glutaminem (Dulbeccova modifikace Eaglova média, Gibco) s 10% (obj./obj.) fetálním telecím sérem (PAA Laboratories), 1% (obj./obj.) gentamicinem a 3,7 g/1 NaHCO₃. Do média s kousky jater byl přidán BrdU v konečné

-4CZ 307016 B6 koncentraci 10 μιηοΙ.Γ¹ a játra byla v tomto médiu inkubována 30 minut v atmosféře s 5% (obj./obj.) CO₂ při 37 °C. Alternativně byl do růstového média namísto BrdU přidán IdU nebo

CldU ve stejné koncentraci jako BrdU.

B) Následně bylo růstové médium odstraněno a kousky jater byly převrstveny pufrem (lx PBS, složení viz část Použité roztoky a chemikálie, přidány byly přibližně 1 až 2 ml pufru na 4 cm²plochy). Po 5 minutách byl pufr odstraněn a nahrazen stejným množstvím lx PBS stejného složení. Tento krok byl ještě jednou opakován.

C) Kousek jater byl dán mezi dvě kruhová skla o průměru 12 mm potažené 1% (hmotnost/obj.) želatinou a tkáň byla roztažena po povrchu skel pomocí jemného tlaku pinzetou na sklo. Skla byla oddělena a obě byla dána do Petriho misky s lx PBS a to tak, že skla směrovala vzorky tkání nahoru do roztoku.

D) V dalších krocích bylo postupováno dle kroků uvedených v Příkladu 1 (D až U).

Příklad 3

Stabilizace protilátek rozeznávajících BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU v DNA v místech inkorporace těchto nukleosidů po působení měďnými ionty a exonukleázou III v suspenzních buňkách fixovaných formaldehydem.

Následující postup popisuje stabilizaci protilátek namířených proti BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU po působení měďnými ionty a exonukleázou III v suspenzních buňkách fixovaných formaldehydem. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.

A) Lidské HeLa S3 buňky (dále jen vzorky) byly pěstovány v kultivačních lahvích (objem lahví byl 50 ml), které byly třepány, v růstovém médiu S-MEM (modifikace Eaglova minimálního média pro suspenzní buňky, Sigma) s 2 mmol.L¹ L-glutaminem a s 5% (obj./obj.) fetálním telecím sérem (PAA Laboratories) a 1% (obj./obj.) gentamycinem v atmosféře s 5% (obj./obj.) CO₂při 37 °C. Buněčná suspenze obsahovala přibližně 5 až 8 x 10 buněk na 1 mililitr.

B) Druhý den po pasáži byl do růstového média přidán BrdU v konečné koncentraci 10 mmol.L¹. Vzorky byly inkubovány 10 minut v atmosféře s 5% (obj./obj.) CO₂ při 37 °C. Alternativně byl do růstového média přidán CldU nebo IdU ve stejné koncentraci jako BrdU.

C) Následně byla suspenze buněk přenesena do 15 mililitrové centrifugační zkumavky a vzorky byly odstřeďovány 1 minutu při 180g. Supematant byl odstraněn (ve zkumavce bylo ponecháno 200 μ! média) a ke vzorkům bylo přidáno nové médium (10 ml). Vzorky byly rozsuspendovány a následně opět odstřeďovány 1 minutu při 180g. Supematant byl odstraněn (ve zkumavce bylo ponecháno 200 μΐ média) a k peletu vzorků byl přidán 1 ml nového média. Pelet vzorků byl rozsuspendován.

D) 50 μΐ kapka suspenze buněk byla přenesena na kruhová skla o průměru 13 mm potažené vrstvou poly-L-lysinu (způsob přípravy těchto skel je popsán v části Použité roztoky a chemikálie). Po 2 minutách byl přebytek média odsát pomocí filtračního papíru tak, že byl filtrační papír jemně přiložen k hraně skla. Skla byla položena do 2% (hmotnost/obj.) roztoku formaldehydu v Petriho misce a vzorky byly fixovány 10 minut. Skla byla umístěna do Petriho misek tak, že směřovala vzorky nahoru do roztoku.

-5 CZ 307016 B6

E) V dalších krocích bylo postupováno podle bodů E až S Příkladu 1.

Navržený postup lze použít i při práci se suspenzí buněk po celou dobu jejich zpracování například pro FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting). V tomto případě bylo postupováno dle bodu A až C Příkladu 3, následně podle bodu D až S Příkladu 1 s tím, že při odstraňování veškerých roztoků, přidávání nových a při promývání byly buňky odstřeďovány 1 minutu při 180g, následně byl odstraněn supernatant (ve zkumavce bylo ponecháno 200 μΐ roztoku), k buňkám byl přidán nový roztok dle rozpisu v Příkladu 1 (2 ml), buňky v něm byly rozsuspendovány a inkubovány po doby uvedené v jednotlivých bodech Příkladu 1. V bodu D byl použit jen formaldehyd. V bodu S nebyla použita voda, ale buňky byly ponechány ve 100 mmol.Γ¹ Tris-HCl a 100 mmol.l¹ NaCl, pH 7,5. V průběhu těchto kroků byly buňky třepány na třepačce (Vortex Wizard,VELP Scientifica, při 300 otáčkách za minutu).

Příklad 4

Stabilizace protilátek rozeznávajících BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU v DNA v místech ínkorporace těchto nukleosidů po působení měďnými ionty v buňkách přisedlých na podložních sklíčkách.

Následující postup popisuje stabilizaci protilátek namířených proti BrdLJ a/nebo CldU a/nebo IdU po působení měďnými ionty v buňkách přisedlých na podložních sklíčkách. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.

Bylo postupováno stejně jako v Příkladu 1 s tím rozdílem, že v bodu M byly vzorky inkubovány 30 minut s myší anti-bromodeoxyuridinovou protilátkou bez exonukleázy III v roztoku 100 mmol.l¹ Tris-HCl a 100 mmol.l¹ NaCl, pH 7,5.

Příklad 5

Stabilizace protilátek rozeznávajících BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU v DNA v místech inkorporace těchto nukleosidů po působení měďnými ionty ve tkáních.

Následující postup popisuje stabilizaci protilátek namířených proti BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU nukleosidů po působení měďnými ionty ve tkáních. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.

Bylo postupováno stejně jako v Příkladu 2 s tím rozdílem, že inkubace s myší anti-bromodeoxyuridinovou protilátkou probíhala bez exonukleázy III v roztoku 100 mmol.l’¹ Tris-HCl a 100 mmol.F¹ NaCl, pH 7,5.

Příklad 6

Stabilizace protilátek rozeznávajících BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU v DNA v místech inkorporace těchto nukleosidů po působení měďnými ionty v suspenzních buňkách.

Následující postup popisuje stabilizaci protilátek namířených proti BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU po působení měďnými ionty v suspenzních buňkách. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.

-6CZ 307016 B6

Bylo postupováno stejně jako v Příkladu 3 s tím rozdílem, že inkubace s myší anti-bromodeoxyuridinovou protilátkou probíhala bez exonukleázy III v roztoku 100 mmol.l“¹ Tris-HCl a 100 mmol.r¹ NaCl, pH 7,5.

Příklad 7

Stabilizace protilátek rozeznávajících BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU v DNA v místech inkorporace těchto nukleosidů po působení nízkou koncentrací kyseliny chlorovodíkové (HC1) a exonukleázou III v buňkách pěstovaných na podložních sklech, tkáních a v suspenzních buňkách.

Následující postup popisuje stabilizaci protilátek namířených proti BrdU, CldU nebo IdU po působení nízkou koncentrací kyseliny chlorovodíkové a exonukleázou III v buňkách pěstovaných na podložních sklech, tkáních a v suspenzních buňkách.

Bylo postupováno podle Příkladů 1 až 3 s těmito rozdíly:

Namísto roztoku obsahujícího 10 mmol.r¹ askorbátu sodného, 4 mmol.l ¹ síranu měďnatého, 20 mmol.l¹ glycinu a 100 mmol.l ¹ chloridu sodného byl použit roztok 50 mmol.l¹ HC1, ve kterém byly vzorky třepány 20 minut při teplotě 24 °C.

Příklad 8

Stabilizace protilátek rozeznávajících BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU v DNA v místech inkorporace těchto nukleosidů po působení DNázou I a exonukleázou III v buňkách pěstovaných na podložních sklech, tkáních a v suspenzních buňkách.

Následující postup popisuje stabilizaci protilátek namířených proti BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU po působení DNázou I a exonukleázou III v buňkách pěstovaných na podložních sklech, tkáních a v suspenzních buňkách.

Bylo postupováno podle Příkladů 1 až 3 s těmito rozdíly:

Po promytí vzorků v lx PBS (bod G, Příklad 1) byla v případě vzorků na sklech skla se vzorky vyjmuta pomocí pinzety z Petriho misky a přebytek roztoku byl odsát pomocí filtračního papíru tak, že skla se vzorky byla položena stranou bez vzorků na filtrační papír. Skla se vzorky byla položena na kapky 100 mmol.l ¹ Tris-HCl, pH 7,5 na parafilmu (50 μΐ/kapka). Skla směrovala vrstvou se vzorky směrem dolů do kapky. Následně byly vzorky inkubovány 30 minut s DNázou I (20 U/ml, Fermentas; viz část Použité roztoky a chemikálie) v roztoku 10 mmol.l¹ Tris (pH 7,5 při 25 °C), 2,5 mmol.r¹ MgCl2, 0,1 mmol.r¹ CaCl2 na kapkách o velikosti 20 μΐ. Poté byly vzorky promyty stejně jako v bodu G Příkladu 1 v lx PBS. Následně bylo pokračováno 30 minutovou inkubaci s myší anti-bromodeoxyuridinovou protilátkou a exonukleázou III (1U/ μΐ, Fermentas) v roztoku 66 mmol.l ¹ Tris (pH 8,0 při 30 °C), 0,66 mmol.r¹ MgCl₂.na kapkách o velikosti 20 μΐ a dále dle bodu N až U Příkladu 1.

Příklad 9

Stabilizace protilátek rozeznávajících BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU v DNA v místech inkorporace těchto nukleosidů alternativně po působení měďnými ionty a/nebo exonukleázou III, nízkou koncentrací HC1 a exonukleázou III nebo DNázou I a exonukleázou III v buňkách pěstovaných na podložních sklech, tkáních a v suspenzních buňkách za použití protilátky, která je přímo konjugovaná s fluorochromy.

-7CZ 307016 B6

Následující postup popisuje stabilizaci protilátek namířených proti BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU alternativně po působení měďnými ionty a/nebo exonukleázou III, nízkou koncentrací HC1 a exonukleázou III nebo DNázou I a exonukleázou III v buňkách pěstovaných na podložních sklech, tkáních a v suspenzních buňkách.

Bylo postupováno podle Příkladů 1 až 8 s těmito rozdíly:

Byla použita myší protilátka namířená proti BrdU, která byla konjugovaná alternativně s fluorochromem FITC (Fluorescein isothiocyanát) nebo Tetrametylrodaminem nebo cyaninovým fluorochromem Cy5 nebo Cy3 a bod Q a R byl ve všech případech vynechán.

Příklad 10

Stabilizace protilátek rozeznávajících BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU v DNA v místech inkorporace těchto nukleosidů po působení nízkou koncentrací kyseliny chlorovodíkové a exonukleázou III v suspenzních buňkách fixovaných etanolem.

Následující postup popisuje stabilizaci protilátek namířených proti BrdU /nebo CldU a/nebo IdU po působení měďnými ionty a exonukleázou III v suspenzních buňkách fixovaných etanolem. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.

A) Lidské HeLa S3 buňky (dále jen vzorky) byly pěstovány v kultivačních lahvích (objem lahví byl 50 ml), které byly třepány, v růstovém médiu S-MEM (modifikace Eaglova minimálního média pro suspenzní buňky, Sigma) s 2 mmol.T¹ L-glutaminem, 5% (obj./obj.) fetálním telecím sérem (PAA Laboratories) a 1% (obj./obj.) gentamicinem v atmosféře s 5% (obj./obj.) CO₂ při 37 °C. Buněčná suspenze obsahovala přibližně 5 až 8 x 10⁵ buněk na 1 mililitr.

B) Druhý den po pasáži byl do růstového média přidán BrdU v konečné koncentraci 10 mmold¹. Vzorky byly inkubovány 10 minut v atmosféře s 5% (obj./obj.) CO₂ při 37 °C. Alternativně byl do růstového média přidán CldU nebo IdU ve stejné koncentraci jako BrdU.

C) Následně byla suspenze buněk obsahující asi 0,5 až 1,5 miliónu buněk přenesena do centrifugační zkumavky a vzorky byly odstřeďovány 1 minutu při 180g. Supematant byl odstraněn.

D) Ke vzorkům bylo přidáno 2 ml 70% (obj./obj.) etanolu vychlazeného v ledové lázni. Po 5 minutách inkubace na pokojové teplotě byly ke vzorkům přidány 2 ml roztoku lx PBS. Vzorky byly rozsuspendovány a následně odstřeďovány 1 minutu při 180g. Supematant byl odstraněn, ke vzorkům byly přidány 2 ml nového roztoku lx PBS, vzorky byly rozsuspendovány a následně opět odstředěny. Tento krok byl opakován ještě jednou.

E) Supematant byl odstraněn. Ke vzorkům bylo přidáno 2 ml alternativně 20, 40, 80 a 160 mmold’ HC1. Vzorky byly přemístěny na třepačku (Thermomixer comfort, Eppendorf) a zde byly inkubovány alternativně 1, 2, 5, 10, 20, 30 nebo 60 minut při rychlosti 300 otáček/minutu. V některých provedeních inkubace v roztoku kyseliny proběhla bez třepání.

F) Vzorky byly odstřeďovány 1 minutu při 180g. Supematant byl odstraněn, ke vzorkům byly přidány 2 ml 100 mmol.l¹ Tris-HCl, pH 7,5. Tento krok byl opakován ještě jednou. Alternativně byl namísto roztoku Tris-HCl použit roztok lx PBS.

G) Vzorky byly odstřeďovány 1 minutu při 180g. Supematant byl odstraněn. Ke vzorkům bylo přidáno alternativně 100, 200 nebo 500 μΐ roztoku myší protilátky rozeznávající BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU (konečná koncentrace protilátky byla alternativně 0,1; 1; 10, 100 a 200 pg/ml) konjugované s fluorochromem a exonukleázy III (konečná koncentrace alternativně 0,2; 1 nebo

-8CZ 307016 B6

U/μΙ, Fermentas) v roztoku lx pufru pro exonukleázu III (66 mmol.l^-1 Tris (pH 8,0 při 30 °C),

0,66 mmol.r¹ MgCl₂). Vzorky byly inkubovány alternativně při teplotě 10, 20, 25, 37 nebo 40 °C na třepačce při rychlosti 300 otáček/minutu.

H) Ke vzorkům byly přidány 2 ml 100 mmol.r¹ Tris-HCl, pH 7,5. Vzorky byly odstřeďovány 1 minutu při 180g. Supematant byl odstraněn, k peletě vzorků byly přidány 2 ml mmol.I”¹ TrisHCl, pH 7,5. Tento krok byl opakován ještě jednou. Alternativně byl namísto roztoku Tris-HCl použit roztok lx PBS. V některých provedeních následoval ihned po prvním přidání 1 ml 100 mmol.l¹ Tris-HCl, pH 7,5 nebo 1 x PBS krok I.

I) Vzorky byly odstřeďovány 1 minutu při 180g. Supematant byl odstraněn. Ke vzorkům byly přidány 2 ml 2% formaldehydu v lx PBS a vzorky byly inkubovány po dobu 10 minut na pokojové teplotě.

J) Vzorky byly odstřeďovány 1 minutu při 1 180g. Supematant byl odstraněn. Ke vzorkům byly přidány 2 ml 100 mmol.T¹ Tris-HCl, pH 7,5. Vzorky byly odstřeďovány 1 minutu při 180g. Supematant byl odstraněn, k peletě vzorků byly přidány 2 ml 100 mmol.l^-1 Tris-HCl, pH 7,5. Tento krok byl opakován ještě jednou. Alternativně byl namísto roztoku Tris-HCl použit roztok lxPBS.

Použité roztoky a chemikálie:

1. Fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (PBS) lOx PBS (desetinásobně koncentrovaný roztok PBS):

1,4 mol.F¹ NaCl mmol.l ¹ KC1 mmol.l ¹ Na₂HPO₄ mmol.l^-1 KH₂PO₄

Uvedené složky byly rozpuštěny v destilované vodě a pH bylo upraveno do rozmezí 7,3 až 7,4.

lx PBS (fosfátem pufrovaný fyziologický roztok připravený desetinásobným ředěním lOx PBS)

2. Příprava polylysinových skel pro ukotvení suspenzních buněk

Kruhová skla s průměrem 12 mm byla vložena do 50 ml kádinky s 20 ml 96% (obj./obj.) etanolu. Po 10 minutách byla pomocí pinzety přenesena do Petriho misky vyložené filtračním papírem a usušena. Skla byla následně na dobu 1 minuty ponořena do 0,01% (hmotnost/obj.) roztoku poly-L-lysinu v DMEM, následně byla ponořena na 30 sekund do lx PBS a pak ještě jednou na 30 sekund do nového lx PBS. Tento krok byl ještě 3x opakován. Nakonec byla skla položena na filtrační papír a usušena.

3. Roztok exonukleázy III s protilátkou:

Destilovaná voda lx pufr pro exonukleázu III (Fermentas, 2 μΐ lOx koncentrovaného pufřu do 20 μΐ směsi), tento pufr je dodáván jako lOx koncentrovaný, složení lOx koncentrovaného pufru je následující: 660 mmol.f¹ Tris-HCl (pH 8,0 při 30 °C), 6,6 mmol.l¹ MgCl₂.

-9CZ 307016 B6

Exonukleáza III (200 U/μΙ, Fermentas), konečná koncentrace 1 U/μΙ

Myší anti-bromodeoxyuridinová protilátka (ředění dle návodu dodavatele protilátky)

Definice jednotky exonukleázy III

Jedna jednotka (U) enzymu uvolní za 30 minut 1 nmol produktu z DNA E. coli při 37 °C. Enzymatická aktivita byla měřena v následující směsi: 50 mmol.l“¹ Tris-HCl (pH 8,0), io 5 mmol.r¹ MgCl₂, 1 mmol.l ¹ dithiothreitol a 0,05 mmol.l ¹ sonikované DNA z E. coli.

4. Roztok DNázy I:

Destilovaná voda x pufr pro DNázu I (Fermentas, 2 μΐ lOx koncentrovaného pufru do 20 μΐ směsi), tento pufr je dodáván jako lOx koncentrovaný, složení lOx koncentrovaného pufru je následující: 100 mmol.r¹ Tris-HCl (pH 7,5 při 25 °C), 25 mmol.l¹ MgCl2 a 1 mmol.l“¹ CaCl2.

DNáza I (1 U/μΙ, Fermentas), konečná koncentrace 20 U/μΙ

Definice jednotky exonukleázy III

Jedna jednotka (U) enzymu úplně degraduje 1 pg plazmidové DNA za 10 minut při 37 °C. Enzymatická aktivita byla měřena v následující směsi: 10 mmol.l“¹ Tris-HCl (pH 7,5 při 25 °C), 2,5 mmol.l“¹ MgCl2, 0,1 mmol.l“¹ CaCl2 a 1 pg pUC19 DNA

Průmyslová využitelnost

Způsob stabilizace protilátek rozeznávající BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU v DNA v místech inkorporace těchto nukleosidů podle předkládaného vynálezu lze využít v případech, kdy je důle35 žité šetrné zpřístupnění těchto nukleosidů ve struktuře DNA pro reakci se specifickými protilátkami a tyto protilátky přitom pro efektivní reakci s BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU běžně vyžadují zpřístupňující kroky, které výrazně poškozují DNA a buněčnou strukturu, přičemž protokoly založené na použití jednomocné mědi a/nebo exonukleáze bez použití námi popsaného přístupu poskytují nízký nebo žádný signál. V této souvislosti je možné mimo jiné předpokládat včlenění 40 tohoto způsobu do komerčně dostupných sad pro detekci replikace DNA.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob stabilizace protilátek rozeznávají 5-bromo-2'-deoxyuridin (BrdU) a/nebo 5-chloro2'-deoxyuridin (CldU) a/nebo 5-jodo-2'-deoxyuridin (IdU) v DNA v místech lokalizace těchto nukleosidů po působení jednomocnou mědí a/nebo exonukleázou III, vyznačené tím, že vzorky s DNA, která obsahuje BrdU, IdU nebo CldU, se po působení jednomocnou mědí a/nebo exonukleázou III a inkubaci s protilátkou rozeznávající BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU inkubují v roztoku formaldehydu.
2. Způsob stabilizace protilátek rozeznávající BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU v DNA v místech lokalizace těchto nukleosidů po působení jednomocnou mědí a/nebo exonukleázou III podle nároku 1, vyznačené tím, že jako vzorky jsou použity buňky nebo tkáně.
3. Způsob stabilizace protilátek rozeznávající BrdU a/nebo CldU a/nebo IdU v DNA v místech inkorporace těchto nukleosidů po působení jednomocnou mědí a/nebo exonukleázou III, podle nároků la2, vyznačené tím, že jsou použity nekonjugované protilátky nebo protilátky konjugované s dalšími látkami, s výhodou vybranými ze skupiny fluorochromů.