CZ303252B6 - Zpusob eliminace antigenních vlastností 5-ethynyl-2´-deoxyuridinu a 5-ethynyluridinu pri detekci nukleových kyselin - Google Patents
Zpusob eliminace antigenních vlastností 5-ethynyl-2´-deoxyuridinu a 5-ethynyluridinu pri detekci nukleových kyselin Download PDFInfo
- Publication number
- CZ303252B6 CZ303252B6 CZ20110324A CZ2011324A CZ303252B6 CZ 303252 B6 CZ303252 B6 CZ 303252B6 CZ 20110324 A CZ20110324 A CZ 20110324A CZ 2011324 A CZ2011324 A CZ 2011324A CZ 303252 B6 CZ303252 B6 CZ 303252B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- azido
- deoxyuridine
- dimethylamine
- edu
- ethynyl
- Prior art date
Links
- QCWBIPKYTBFWHH-FDDDBJFASA-N 1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-ethynylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C#C)=C1 QCWBIPKYTBFWHH-FDDDBJFASA-N 0.000 title claims abstract description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 230000008030 elimination Effects 0.000 title claims description 13
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 title claims description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 11
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 title description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 16
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 16
- CDEURGJCGCHYFH-DJLDLDEBSA-N 5-ethynyl-2'-deoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C#C)=C1 CDEURGJCGCHYFH-DJLDLDEBSA-N 0.000 claims description 74
- -1 N- (1-azido-3,6,9-trioxaundecyl) dimethylamine Chemical compound 0.000 claims description 22
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 20
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 12
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 claims description 7
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 claims description 7
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 6
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 6
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 claims description 6
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims description 6
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 claims description 6
- DIYVEJXQDMOGEL-UHFFFAOYSA-N 2-isothiocyanato-6-methylheptane Chemical compound CC(C)CCCC(C)N=C=S DIYVEJXQDMOGEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- WXZXTRCKSOLGKX-UHFFFAOYSA-N 1,3-diazidopropane Chemical compound [N-]=[N+]=NCCCN=[N+]=[N-] WXZXTRCKSOLGKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- YKPFXAHKQLQHCJ-UHFFFAOYSA-N 1-azidopropan-2-ol Chemical compound CC(O)CN=[N+]=[N-] YKPFXAHKQLQHCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- JIQVRHWKIDNQLC-UHFFFAOYSA-N 2-(2-azidoethoxy)ethanamine Chemical compound NCCOCCN=[N+]=[N-] JIQVRHWKIDNQLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- CGJFKQFYZOARRV-UHFFFAOYSA-N 2-(2-azidoethoxy)ethanol Chemical compound OCCOCCN=[N+]=[N-] CGJFKQFYZOARRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- OPAACBJNVVLPKI-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]-N,N-dimethylethanamine Chemical compound CN(CCOCCOCCN=[N+]=[N-])C OPAACBJNVVLPKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- PMNIHDBMMDOUPD-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]ethanol Chemical compound OCCOCCOCCN=[N+]=[N-] PMNIHDBMMDOUPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- MBQYGQMGPFNSAP-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound OCCOCCOCCOCCN=[N+]=[N-] MBQYGQMGPFNSAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- CSTIZSQKHUSKHU-UHFFFAOYSA-N 2-azidoethanamine Chemical compound NCCN=[N+]=[N-] CSTIZSQKHUSKHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- BSULWPSUVMOMAN-UHFFFAOYSA-N 2-azidoethanol Chemical compound OCCN=[N+]=[N-] BSULWPSUVMOMAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- OYBOVXXFJYJYPC-UHFFFAOYSA-N 3-azidopropan-1-amine Chemical compound NCCCN=[N+]=[N-] OYBOVXXFJYJYPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- WHVSIWLMCCGHFW-UHFFFAOYSA-N 3-azidopropan-1-ol Chemical compound OCCCN=[N+]=[N-] WHVSIWLMCCGHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- LFMZGBHJJNIRKH-UHFFFAOYSA-N 4-azidobutan-1-amine Chemical compound NCCCCN=[N+]=[N-] LFMZGBHJJNIRKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- GNKNOJSLSUIQNP-UHFFFAOYSA-N 5-azido-N,N-dimethylpentan-1-amine Chemical compound CN(C)CCCCCN=[N+]=[N-] GNKNOJSLSUIQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- NLRIZTOLWRMVKT-UHFFFAOYSA-N 5-azidopentyl(trimethyl)azanium Chemical compound C[N+](CCCCCN=[N+]=[N-])(C)C NLRIZTOLWRMVKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- IAEQLDGVBVNGQO-UHFFFAOYSA-N 6-azido-n,n-dimethylhexan-1-amine Chemical compound CN(C)CCCCCCN=[N+]=[N-] IAEQLDGVBVNGQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- YJVGYJQCVHYVGU-UHFFFAOYSA-N 6-azidohexyl(trimethyl)azanium Chemical compound C[N+](CCCCCCN=[N+]=[N-])(C)C YJVGYJQCVHYVGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical class CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- NGMZPEYWPOPXIB-UHFFFAOYSA-N azido(methylsulfanyl)methane Chemical compound CSCN=[N+]=[N-] NGMZPEYWPOPXIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- RXFCVYTXNKIGJI-UHFFFAOYSA-N azidomethylsulfanylmethylbenzene Chemical compound C(C1=CC=CC=C1)SCN=[N+]=[N-] RXFCVYTXNKIGJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 150000001649 bromium compounds Chemical class 0.000 claims description 4
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 claims description 4
- ZKSQVHRFOHCYAS-UHFFFAOYSA-N diazonio-[2-[2-(trimethylazaniumyl)ethoxy]ethyl]azanide Chemical compound C[N+](C)(C)CCOCCN=[N+]=[N-] ZKSQVHRFOHCYAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 150000004694 iodide salts Chemical class 0.000 claims description 4
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 claims description 4
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical class OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 4
- 125000005490 tosylate group Chemical group 0.000 claims description 4
- FEJUFSSWIQWAOC-UHFFFAOYSA-N 1,2-diazidoethane Chemical compound [N-]=[N+]=NCCN=[N+]=[N-] FEJUFSSWIQWAOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- DKSSOUDMDHTFRY-UHFFFAOYSA-N 2-(2-azidoethoxy)-N,N-dimethylethanamine Chemical compound CN(C)CCOCCN=[N+]=[N-] DKSSOUDMDHTFRY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- ZHWGWSYNZIZTFL-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]ethanamine Chemical compound NCCOCCOCCN=[N+]=[N-] ZHWGWSYNZIZTFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- HTTNJQAFJLVWCN-UHFFFAOYSA-N 3-azidopropane-1,2-diol Chemical compound OCC(O)CN=[N+]=[N-] HTTNJQAFJLVWCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- WGADDEKJDQGLOF-UHFFFAOYSA-N 4-azido-n,n-dimethylbutan-1-amine Chemical compound CN(C)CCCCN=[N+]=[N-] WGADDEKJDQGLOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- NESRXKQZCRBRDL-UHFFFAOYSA-N 5-azidopentan-1-amine Chemical compound NCCCCCN=[N+]=[N-] NESRXKQZCRBRDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- CLQMAUAPICAWGT-UHFFFAOYSA-N 6-azidohexan-1-amine Chemical compound NCCCCCCN=[N+]=[N-] CLQMAUAPICAWGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- KAWXOFVNMTULCZ-UHFFFAOYSA-N 2-azidoethyl(trimethyl)azanium Chemical compound C[N+](C)(C)CCN=[N+]=[N-] KAWXOFVNMTULCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 2-propanol Substances CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- UGCQSNBUMGFAFD-UHFFFAOYSA-N 3-azido-n,n-dimethylpropan-1-amine Chemical compound CN(C)CCCN=[N+]=[N-] UGCQSNBUMGFAFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 2
- QYAPHLRPFNSDNH-MRFRVZCGSA-N (4s,4as,5as,6s,12ar)-7-chloro-4-(dimethylamino)-1,6,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4,4a,5,5a-tetrahydrotetracene-2-carboxamide;hydrochloride Chemical compound Cl.C1=CC(Cl)=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]4(O)C(=O)C3=C(O)C2=C1O QYAPHLRPFNSDNH-MRFRVZCGSA-N 0.000 claims 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 claims 1
- WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-1-[4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 31
- AGFIRQJZCNVMCW-UAKXSSHOSA-N 5-bromouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 AGFIRQJZCNVMCW-UAKXSSHOSA-N 0.000 abstract description 4
- FHIDNBAQOFJWCA-UAKXSSHOSA-N 5-fluorouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(F)=C1 FHIDNBAQOFJWCA-UAKXSSHOSA-N 0.000 abstract description 4
- JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N Cu2+ Chemical compound [Cu+2] JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- 229910001431 copper ion Inorganic materials 0.000 abstract description 3
- XQFRJNBWHJMXHO-UHFFFAOYSA-N 1-[4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-iodopyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 54
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 54
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 32
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 31
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 29
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 29
- NJCXGFKPQSFZIB-RRKCRQDMSA-N 5-chloro-1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Cl)=C1 NJCXGFKPQSFZIB-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 23
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 23
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 19
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 18
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 16
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 16
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 13
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 9
- ROSDSFDQCJNGOL-UHFFFAOYSA-N Dimethylamine Chemical compound CNC ROSDSFDQCJNGOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 6
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- NXVNRWIFHDPANC-DJLDLDEBSA-N 5-acetyl-1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C(=O)C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 NXVNRWIFHDPANC-DJLDLDEBSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 102000006835 Lamins Human genes 0.000 description 4
- 108010047294 Lamins Proteins 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 210000005053 lamin Anatomy 0.000 description 4
- 235000010378 sodium ascorbate Nutrition 0.000 description 4
- PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M sodium ascorbate Substances [Na+].OC[C@@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M 0.000 description 4
- 229960005055 sodium ascorbate Drugs 0.000 description 4
- PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M sodium-L-ascorbate Chemical compound [Na+].OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 3
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- RTPRAKAOERJPIJ-UHFFFAOYSA-N N(=[N+]=[N-])CCOCCOCCOCC[N+](C)(C)C Chemical compound N(=[N+]=[N-])CCOCCOCCOCC[N+](C)(C)C RTPRAKAOERJPIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012650 click reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 239000008098 formaldehyde solution Substances 0.000 description 3
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 3
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- MNVPEHHHGCEGFZ-UHFFFAOYSA-N 1,3-diazidopropan-2-ol Chemical compound [N-]=[N+]=NCC(O)CN=[N+]=[N-] MNVPEHHHGCEGFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HROPUYBDUIHROX-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]ethoxy]-N,N-dimethylethanamine Chemical compound CN(CCOCCOCCOCCN=[N+]=[N-])C HROPUYBDUIHROX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 2
- ZAFOMNHJENYVBF-UHFFFAOYSA-N N(=[N+]=[N-])CCOCCOCC[N+](C)(C)C Chemical compound N(=[N+]=[N-])CCOCCOCC[N+](C)(C)C ZAFOMNHJENYVBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical class O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 2
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 2
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 2
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 2
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N (R)-(-)-Propylene glycol Chemical compound C[C@@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- HGHAWOKGZGDPKH-PNHWDRBUSA-N 1-[(2r,3r,4s,5r)-2-ethynyl-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidine-2,4-dione Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(C#C)N1C(=O)NC(=O)C=C1 HGHAWOKGZGDPKH-PNHWDRBUSA-N 0.000 description 1
- FPVCVHVTMPCZTH-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]ethoxy]ethanamine Chemical compound NCCOCCOCCOCCN=[N+]=[N-] FPVCVHVTMPCZTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XIXCIVDAWWCJJR-UHFFFAOYSA-N 2-dimethylaminoethylazide Chemical compound CN(C)CCN=[N+]=[N-] XIXCIVDAWWCJJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BUVSBIKCBLHNCG-UFLZEWODSA-N 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoic acid;azide Chemical compound [N-]=[N+]=[N-].N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 BUVSBIKCBLHNCG-UFLZEWODSA-N 0.000 description 1
- CDEURGJCGCHYFH-UHFFFAOYSA-N 5-ethynyl-1-[4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(C#C)=C1 CDEURGJCGCHYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 101000954509 Trichosurus vulpecula Very early lactation protein Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 150000001345 alkine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N alpha-acetylene Natural products C#C HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 125000000852 azido group Chemical group *N=[N+]=[N-] 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000002534 ethynyl group Chemical group [H]C#C* 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N monopropylene glycol Natural products CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- CIBMHJPPKCXONB-UHFFFAOYSA-N propane-2,2-diol Chemical compound CC(C)(O)O CIBMHJPPKCXONB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013772 propylene glycol Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000002718 pyrimidine nucleoside Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Popsaný zpusob dovoluje efektivne eliminovat 5-ethynyl-2´-deoxyuridin inkorporovaný v DNA nebo 5-ethynyluridin inkorporovaný v RNA jako antigen, který je rozeznáván protilátkami, primárne namírenými proti strukturne podobným molekulám. Príkladem takových molekul jsou 5-brom-2´-deoxyuridin, 5-chlor-2´-deoxyuridin, 5-jod-2´-deoxyuridin ci 5-bromuridin a 5-fluoruridin. Zpusob je založen na reakci 5-ethynyl-2´-deoxyuridinu v DNA nebo 5-ethynyluridinu v RNA s malými azidovanými molekulami v prostredí s mednými ionty, provádené pred reakcí s protilátkou, rozeznávající 5-ethynyl-2´-deoxyuridin a 5-ethynyluridin.
Description
Oblast techniky
Vynalez se týká způsobů eliminace 5-ethynyi-2'-deoxy uridinu a 5-ethynyluridinu jako antigenů rozeznávaných protilátkami, reagujícími s uvedenými molekulami. Příkladem takových protilátek, které reagují s molekulou 5-ethynyl-2'-deoxyuridinu nebo 5-ethynyluridinu, jsou některé protilátky rozeznávající analogy thymidinu, jako 5-brom-2'-deoxyuridin. 5~chlor-2'-deoxyuridin, 5-jod-2'-deoxyundin, 5-bromuridin nebo 5-fluorurÍdin. Tento přístup dovoluje cíleně eliminovat antigenní vlastnosti 5-ethynyl-2'-deoxyuridinu a 5-ethynyluridinu, které by komplikovaly například detekci replikované DNA nebo nově syntetizované RNA.
Dosavadní stav techniky
Použití systémů, založených na reakci nukleosidů v DNA nebo RNA se specifickými protilátkami, je běžné jak v základním, tak aplikovaném výzkumu. Příkladem takto používaných nukleosidů jsou 5-brom-2'-deoxyuridin (BrdU), 5-ehlor-2'-deoxyuridin (CldU), 5-jod-2'-deoxyuridin (IdU), 5-bromuridin (BrU) nebo 5-fluoruridin (FU). Jejich použití dovoluje např. rychlou analýzu buněčných populací z hlediska jejich proliferační aktivity. Další využití uvedených systémů zahrnuje izolace fragmentů DNA značených modifikovanými nukleosidy. Své uplatnění mají i ve výzkumu DNA replikace a transkripce. Jednou z nových metod, používaných právě pro detekci replikované DNA nebo nově syntetizované RNA, je použití 5-ethynyl-2'-deoxyuridinu (EdU) a 5-ethynyluridinu (EU) ajejich následná detekce pomocí tzv, click reakce (Jao and Salic, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 2008, 105, 15779 až 15784; Salic and Mitchison, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 2008. 105, 2415 až 2420; Chehrehas et al., Journal of Neuroscience Methods 2009, 177, 122 až 130), Ta spočívá v reakci alkynu s azidoderivátem fluorochromu nebo biotinu nebo digoxigeninu či jiné relativně velké molekuly, která později slouží k detekci EdU v prostředí jednomocných iontů mědi. K azidům mohou být případně připojeny i jiné molekuly, které slouží jako značky. Příkladem je BrdU-azid (Cappella P. et al., Cytometry 2008, 73, 626 až 63), který se detekuje pomocí anti-BrdU protilátky bez potřeby použití HCI pro denaturaci DNA.
Současná detekce BrdU (alternativně i CldU nebo IdU) pomocí protilátek a EdU prostřednictvím azidovaných fluorochromů, případně např. azidovaného biotinu, digoxigeninu nebo jiné relativně velké molekuly, která později slouží k detekci EdU, je však podle našich zjištění komplikována několika skutečnostmi. Tyto skutečnosti komplikují i současnou detekci BrU nebo FU a EU. Hlavní nevýhodou je fakt, že jak EdU, tak i EU jsou zpravidla rozeznávány protilátkami, které reagují se strukturně podobnými molekulami, jakými jsou právě BrdU, CldU, IdU, BrU nebo FU. Jednou z výjimek je klon MoBu-1 (Bradford and Clarke, Current Protocols in Cytometry, 2011, 55, chapter, 7, unit 7.38). Navíc při click reakci, v níž reagují EdU v DNA nebo EU v RNA s velkými azidovánými molekulami, reagují tyto azidované molekuly jen s částí molekul EdU nebo EU, pravděpodobně ze sterických důvodů. Velká část EdU nebo EU tak zůstává v DNA nebo RNA neoznačena a může reagovat s protilátkami, pro které je důležitá oblast v okolí polohy 5 uracilové části molekuly EdU nebo EU. Po reakci s azidovanou molekulou je však tato oblast pro protilátku nedostupná. Ačkoli podle našich výsledků lze molekuly inkorporovaného EdU přeměnit na 5-acetyl-2'-deoxyuridin (AdU) pomocí koncentrovaných roztoků kyselin, tento krok s sebou přináší jen částečné řešení uvedeného problému. Pro úplnou přeměnu je nutné použít vysoce koncentrované kyseliny, což vede ve svém důsledku k rozsáhlému poškození buněčné struktury. Navíc řada protilátek proti BrdU, CldU a IdU současně rozeznává i AdU. V případě EU pak nelze tento přístup použít vůbec, neboť použitím koncentrovaných kyselin dojde k celkové degradaci RNA.
- 1 CZ 303252 B6
Podstata vynálezu
Podle tohoto vynálezu je řešením výše zmíněných problémů použití malých azidovaných ne5 fluoreskujících molekul, které vzhledem ke svým rozměrům reagují s inkorporovaným EdU nebo EU daleko účinněji než relativně velké molekuly azidovaných fluorochromů, případně např. azidovaného biotinu, digoxigeninu nebo jiné relativně velké molekuly běžně používaných k detekcím EdU/EU. Nespornou výhodou navrhovaných molekul je rovněž skutečnost, že nefluoreskují a tudíž jejich případná vazba na DNA, RNA nebo proteiny nevede ke zvýšení pozadí. Použít lze io tyto malé molekuly: azidomethylfenylsulfid, 2-azidoethanol, azidomethylbenzylsulfid, azidomethylmethylsulfíd, 3-azido-l,2-propandiol, l,3-diazido-2-propanol, 3-azido-2-propanol, 3azidopropanol, 1,3-diazidopropan, 1,2-diazidoethan, 2-(2-azidoethoxy)ethanol, 8-azido-3,6— dioxaoktanol, 11 -azido-3,6,9-trioxaundekanol, 2-azidoethylamin, 3-azidopropy lamin, 4-azidobutylamin, 5-azidopentylamin, 6-azidohexylamin, 2-(2-azidoethoxy)ethylamin, 8-azido-3,615 dioxaoktylamin, 1 l-azido-3,6,9-trioxaundecylamin, N-(2-azidoethyl)di methy lamin, N-(3azidopropyl)dimethylamin, N-(4-azidobutyl)dimethylamin, N-(5~azidopentyl)dimethylamin, N(6-azidohexyl)dimethylamin, N-{5 azido-3-oxapentyl)dimethylamin, N-(8-azido-3,6-dioxaoktyl)dimethylamin, N—(t l-azido-3,6,9-trioxaundecyl)dimethylamin, dále chloridy, bromidy, jodidy, sulfáty, chloristany, tosyláty, mesyláty, nitráty, tetrafiuorboráty a hexafluorfosfáty, N-(220 azidoethyl)trimethy lamonia, N-(3-azidopropyl)tri methy lamonia, N-(4-azidobutyl)trimethyl· amonia, N-(5-azidopentyl)trimethylamonia, N-(6-azidohexyl)trimethylamonia, N-(5-azido-3oxapentyl)trimethylamonia, N-(8-azido-3,6-dioxaoktyl)trimethylamonia či N-(l l-azido-3,6,9trioxaundecyl)trimethylamonia, nebo jejich kombinaci. Pri eliminaci nezreagovaného EdU/EU se využije rovněž princip click reakce, pri němž reakce mezi terminálním ethynylem molekuly EdU (EU) a azidoskupinou malé molekuly probíhá v prostředí obsahující měďné ionty. Je to stejný princip, jaký se využívá i pri detekcích EdU v DNA nebo EU v RNA. Reakce s malou nefluoreskuj ící azidovanou molekulou se provede až po reakci s azidovanou molekulou s fluorochromem nebo s biotinem či digoxigeninem nebo s jinou relativně velkou molekulou, která později slouží k detekci EdU. Tento přístup umožňuje účinně eliminovat antigenní vlastnosti EdU (EU) vůči protilátkám, které by jinak s těmito molekulami reagovaly. Jedná se o protilátky, pro jejichž vazbu na uvedené molekuly analogů thymidinu je důležitá jejich modifikace v pozici 5, tedy protilátky specificky reagující např. sBrdU,CldU,IdU nebo BrU, případně FU.
Podstatou předkládaného vynálezu je tedy způsob eliminace 5-ethynyl-2'-deoxyuridÍnu a 535 ethynyluridinu jako antigenů, rozeznávaných protilátkami reagujícími s uvedenými molekulami při detekci nukleových kyselin, vyznačující se tím, že vzorky obsahující DNA s inkorporovaným 5-ethynyl-2'-deoxyuridinem nebo RNA s inkorporovaným 5-ethynyluridinem se ve vodných roztocích obsahujících měďné ionty inkubují s malou azidovanou nefluoreskující sloučeninou zvolenou ze skupiny, zahrnující azidomethylfenylsulfid, 2-azidoethanol, azidomethyl benzy 1to sulfid, azidomethylmethylsulfid, 3-azÍdo-l,2-propandiol, l,3-diazido-2~propanol, 3-azido-2propanol, 3-azidopropanol, 1,3-diazidopropan, 1,2-diazidoethan, 2-(2-azidoethoxy)ethanol, 8azido-3,6-díoxaoktanol, 11 -azido-3,6,9-trioxaundekanol, 2-azidoethylamin, 3-azidopropy 1amin, 4-azidobutylamin, 5-azidopentylamin, 6-azidohexylamin, 2-(2-azidoethoxy)ethytamin, 8-azido-3,6-dioxaoktylamin, 1 l-azido-3,6,9-trioxaundecylamin, N~(2-azidoethyl)dimethyl45 amin, N-(3-azidopropyl)dimethylamin, N-(4-azidobutyl)dimethylamin, N-(5-azidopentyl)dimethylamin, N-(6-azidohexyl)dimethylamin, N-(5-azido-3-oxapentyl)di methy lamin, N-(8azido-3,6-dioxaoktyl)dimethylamin, N-(l l-azido-3,6,9-trioxaundecyl)dimethylamin, dále chloridy, bromidy, jodidy, sulfáty, chloristany, tosyláty, mesyláty, nitráty, tetrafiuorboráty a hexafluorfosfáty, N-(2-azidoethyl)tri methy lamonia, N-(3-azidopropyl)trimethylamonia, N50 (4-azidobutyl)trimethylamonia, N-(5-azidopentyl)trimethylamonia, N-(6-azidohexyl)trimethylamonia, N-(5-azido-3~oxapentyl)trimethy lamonia, N-(8-azido-3,6—dioxaoktyl)trimethylamonia či N-(l 1-azido-3,6,9-trioxaundecyl)trimethylamonia, nebo jejich kombinace, čímž se účinně blokuje interakce 5-ethynyl-2'-deoxyuridinu nebo 5-ethynyluridinu s protilátkami namířenými proti strukturně podobným molekulám.
-2CZ 303252 B6
Význakem uvedeného způsobu eliminace 5-ethynyl-2'deoxyuridinu a 5 ethynyluridinu jako antigenů, rozeznávaných protilátkami reagujícími s uvedenými molekulami pri detekci nukleových kyselin je skutečnost, že reakce s malou nefluoreskující azidovanou molekulou se provede mezi dvěma reakcemi, běžně používanými při detekci nukleových kyselin, tedy následně po reak5 ci nukleových kyselin s azidovanou molekulou s fluorochromem nebo biotinem ěi digoxigeninem případně jinou relativně velkou molekulou, která později slouží k detekci EdU a před reakcí specifických protilátek vůči nukleosidům obsaženým v detekovaných nukleových kyselinách.
Využití uvedeného přístupu lze předpokládat při současné lokalizaci BrdU (alternativně i CldU io nebo IdU) s EdU nebo BrU či FU s EU, případně EdU nebo EU s dalšími nukleosidy, pri jejichž detekci bude nutné potlačit schopnost protilátek rozeznávat EdU nebe EU. Předkládaný vynález bude tedy nej přínosnější při výrobě sad dodávaných pro základní výzkum, jako např. sady pro detekci replikované DNA nebo nově syntetizované RNA. Nespornou výhodou tohoto vynálezu je možnost použití širokého spektra protilátek proti BrdU, CldU, IdU, FU nebo BrU a případně i dalších nukleosidů bez potřeby selekce těch protilátek, které nevykazují afinitu vůči EdU nebo EU či AdU.
Autorům přihlášky není známo, že by tento přístup byl někdy použit pro eliminaci EdU nebo EU jako antigenů, který reaguje s protilátkami, které rozeznávají tyto molekuly.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1. Detekce EdU pomocí protilátky namířené proti BrdU bez použití popsaného vynálezu pro eliminaci EdU.
a) Detekce EdU pomocí azidováného fluorochromu
b) Detekce EdU pomocí protilátky
Obr. 2. Detekce EdU pomocí protilátky, namířené proti BrdU, po použití předloženého vynálezu k eliminaci EdU.
a) Detekce EdU pomocí azidovaného fluorochromu
b) Detekce EdU pomocí protilátky
Příklady provedení vynálezu
HeLa
DMEM PBS BrdU CldU IdU
FU BrU EdU EU
SMEM buněčná linie lidských epiteliálních buněk
Dulbeccova modifikace Eaglova média fosfátem pufrovaný fyziologický roztok
5-bromo-2—deoxyuridin
5-chloro-2'-deoxyuridin
5-jodo-2 '-deoxyuridin
5-fluoruridin
5-bromuridin
5-cthyny 1-2 '-deoxyuridin
5-ethynyluridin modifikace Eaglova minimálního média pro suspenzní buňky
- 3 CZ 303252 B6
Příklad 1
Eliminace EdU jako antigenu v buňkách přisedlých na podložní skla pomocí nefluoreskuj ících azidovaných látek.
Následující postup popisuje eliminaci EdU jako antigenu v HeLa buňkách přisedlých na podložních sklíčkách, ve kterých se provádí současná lokalizace EdU s BrdU, CldU nebo IdU, anebo v buňkách, ve kterých se provádí eliminace EdU v DNA bez inkorporovaného BrdU, CldU nebo IdU. Není-Π uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.
A) Lidské HeLa buňky (dále jen vzorky) byly pěstovány v Petriho miskách na kruhových sklech o průměru 13 mm v růstovém médiu DMEM s L-glutaminem, doplněném 10% (obj./obj.) fetálním telecím sérem (PAA Laboratories), 1% (obj./obj.) gentamicinem a 0,85 g/1 NaHCCf v atmosféře s 5% (obj./obj.) CO2 pri 37 °C.
B) Druhý den po pasáži byl do růstového média přidán EdU v konečné koncentraci 2 μιηοΙ.Γ1. Vzorky byly inkubovány 10 minut v atmosféře s 5% (obj./obj.) CO2 pri 37 °C. Dále následoval krok C. Alternativně bylo růstové médium obsahující EdU odstraněno a nahrazeno stejným množstvím média stejného složení bez EdU. Vzorky byly inkubovány 3 hodiny v atmosféře s 5% (obj./obj.) CO2 při 37 °C. Po třech hodinách byl do média přidán BrdU v konečné koncentraci 2 pmol.l Vzorky byly inkubovány 10 minut v atmosféře s 5% (obj./obj.) CO2 pri 37 °C. Namísto BrdU byl alternativně do růstového média přidán CldU nebo IdU ve stejné koncentraci jako BrdU. Pak následoval krok C.
C) Následně bylo růstové médium odstraněno a nahrazeno pufrem (lx PBS, složení viz část Použité roztoky a chemikálie, přidány byly přibližně 1 až 2 ml pufru na 4 cm2 plochy).
D) Pufr byl odstraněn a vzorky byly 10 minut fixovány 2% (hmotnost/obj.) roztokem formaldehydu v IxPBS (pH 7,4; I až 2 ml fixačního roztoku na 4 cm2 plochy).
Alternativně byly vzorky fixovány methanolem a následně acetonem. V tomto případě byla skla se vzorky nejdříve inkubována 10 minut v methanolu při teplotě -20 °C (přibližně 1 až 2 ml methanolu na 4 cm2 plochy) a následně ponořena na 30 sekund do kádinky s 50 ml acetonu o teplotě místnosti; skla se vzorky pak byla usušena a po usušení vložena do Petriho misky s lx PBS. V případě použití methanolu a acetonu následoval krok G).
E) Roztok formaldehydu byl odstraněn a vzorky byly převrstveny lx PBS (přibližně 1 až 2 ml 1 x PBS na 4 cm2 plochy). Po 5 minutách byl pufr odstraněn a nahrazen novým o stejném složení. Tento krok byl opakován ještě jednou.
F) Následně byl pufr odstraněn. Vzorky byly 10 minut permeabilizovány 0,2% (obj./obj.) roztokem Tritonu X-100 v lx PBS (přibližně 1 až 2 ml permeabilizačního roztoku na 4 cm2 plochy). Po odstranění permeabilizačního roztoku byly vzorky převrstveny lx PBS (přibližně 1 až 2 ml lx PBS na 4 cm2 kultivační plochy).
G) Po 5 minutách byl roztok lx PBS odstraněn a nahrazen stejným množstvím téhož roztoku. Tento krok byl opakován ještě jednou.
H) Z misek byl odstraněn roztok lx PBS, vzorky byly převrstveny stejným množstvím 0,5x PBS, po 1 minutě byl roztok 0,5x PBS odstraněn a nahrazen stejným množstvím 0,25x PBS. Nakonec byl uvedený roztok ze vzorků odstraněn a vzorky byly převrstveny destilovanou vodou (přibližně 1 až 2 ml vody na 4 cm2 kultivační plochy). Po 5 minutách byla voda odstraněna a nahrazena stejným množstvím destilované vody. Pak byla skla se vzorky vyjmuta pomocí pinzety
-4CZ 303252 B6 z Petriho misky a přebytek vody byl odsát pomocí filtračního papíru tak, že skla se vzorky byla položena stranou bez vzorků na filtrační papír. Poté byla skla se vzorky položena na kapky destilované vody na parafinu (50 μΙ/kapka). Skla směřovala vzorky směrem dolů do kapky vody.
I) Následně byl přebytek vody ze vzorků odsát pomocí filtračního papíru tak, že byl filtrační papír jemně přiložen k hraně skla a skla se vzorky byla přemístěna na 50μ1 kapku inkubační ho roztoku i s azidovanou značící látkou (IR-1; složení roztoku je uvedeno v části Použité roztoky a chemikálie) a inkubována 30 minut.
io J) Po inkubaci byly vzorky přeneseny na kapku destilované vody (50 μΙ). Po 5 minutách byly vzorky přeneseny na novou stejně veikou kapku destilované vody. Tento krok byi opakován ještě jednou.
K) Bod K byl alternativně proveden podle popisu v bodu K 1 nebo K 2 pro vzorky značené
EdU a BrdU (nebo CldU nebo IdU), nebo podle popisu v bodu K 3 pro vzorky značené výhradně EdU.
K 1
a) Následně byl přebytek vody ze vzorků odsát pomocí filtračního papíru tak, že byl filtrační papír jemně přiložen k hraně skla a skla se vzorky byla přemístěna do inkubační ho roztoku 2 v Petriho misce (IR-2; 1,5 ml roztoku na 9 cm2 plochy, složení inkubačního roztoku je uvedeno v části Použité roztoky a chemikálie). Alternativně byla Petriho miska zcela zaplněna IR-2. Tím došlo k minimalizaci provzdušňování směsi. V dalším případě byla plná Petriho miska po uzavře25 ní utěsněna omotáním parafilmem po celém obvodu, nebo byla směs po dobu inkubace probublávána dusíkem. Skla byla umístěna do Petriho misek tak, že směřovala vzorky nahoru do roztoku.
b) Petriho misky se vzorky na sklech byly přemístěny na třepačku (PS-M3D, Grant-Bio) a zde byly inkubovány alternativně po dobu 10 nebo 30 minut při rychlosti 30 otáček/minutu.
c) Inkubační roztok byl odstraněn a vzorky byly převrstveny destilovanou vodou (přibližně 1 až 2 ml vody na 4 cm2 plochy). Po jedné minutě byla voda odstraněna a nahrazena stejným množstvím vody. Tento krok byl opakován ještě jednou.
d) Voda byla odstraněna a nahrazena vymývacím roztokem (1,5 ml roztoku na 9 cm2 plochy). Složení vymývací ho roztoku je uvedeno v části Použité roztoky a chemikálie. Petriho misky se vzorky na sklech byly přemístěny na třepačku a zde byly inkubovány do odbarvení, minimálně ale 30 minut, nebo v případě nezabarvených vzorků 30 minut. V průběhu vymývání byla skla vždy po 10 minutách nadzvednuta pinzetou tak, aby došlo k vymytí prostoru pod skly a rovněž spodní strany skla. Skla byla v průběhu nadzvedávání zcela ponořena v roztoku,
e) Vymývací roztok byl odstraněn a vzorky byly převrstveny destilovanou vodou (přibližně 1 až 2 ml vody na 4 cm2 plochy). Po 2 minutách byla voda odstraněna a nahrazena stejným množstvím vody. Tento krok byl opakován ještě jednou.
f) Následně byly alternativně provedeny kroky I) nebo /7) po kterých pak následoval bod L.
I)
Z misek byla odstraněna voda, vzorky byly převrstveny stejným množstvím 100 mmol.]'1 TrisCl (pH 7,4), po jedné minutě byl roztok odstraněn a nahrazen stejným množstvím roztoku stejného složení. Tento krok byl ještě třikrát opakován. Dále byla skla se vzorky vyjmuta pomocí pinzety z Petriho misky a přebytek pufru byl odsát pomocí filtračního papíru tak, že skla se vzorky byla položena stranou bez vzorků na filtrační papír. Skla se vzorky byla položena na kapky
- 5 CZ 303252 B6
100 mmol.l 1 Tris-CI (pH 7,4) na parafinu (50 μΙ/kapka). Skla směřovala vrstvou se vzorky směrem dolů do kapky.
//)
Skla se vzorky byla vyjmuta pomocí pinzety z Petriho misky a přebytek vody byl odsát pomocí filtračního papíru tak, že skla byla položena stranou bez vzorků na filtrační papír. Skla se vzorky pak byla položena na kapky destilované vody na parafilmu (50 μΙ/kapka), Skla směřovala vrstvou se vzorky směrem dolů do kapky vody. Vzorky pak byly inkubovány 30 minut s exonukleáio zou lil (složení roztoku je uvedeno v části Použité roztoky a chemikálie) na kapkách o velikosti μί. Následně byla skla se vzorky přenesena na kapku 100 mmol.l 1 Tris-O (pH 7,4, 50 μΙ).
Po 2 minutách byla skla se vzorky přenesena na novou kapku roztoku stejného složení. Tento krok byl ještě třikrát opakován.
K2
a) Následně byl přebytek vody ze vzorků odsát pomocí filtračního papíru tak, že filtrační papír byl jemně přiložen k hraně skla a skla se vzorky byla přemístěna do Petriho misek se 4 mol.l 1 kyselinou chlorovodíkovou nebo 0,07 mol.l 1 hydroxidem sodným (přibližně 1 až 2 ml roztoku kyseliny nebo hydroxidu na 4 cm plochy), přičemž strana se vzorky směřovala nahoru do roztoku. Vzorky v kyselině chlorovodíkové byly inkubovány 20 minut při teplotě 25 °C. Vzorky v hydroxidu sodném byly inkubovány 3 minuty při teplotě 25 °C.
b) Z misek byl odstraněn roztok kyseliny nebo hydroxidu, vzorky byly převrstveny stejným množstvím 100 mmol.l1 Tris-CI (pH 7,4), po 1 minutě byl roztok nahrazen stejným množstvím roztoku stejného složení a tento krok ještě třikrát opakován.
c) Skla se vzorky pak byla vyjmuta pomocí pinzety z Petriho misky a přebytek roztoku byl odsát pomocí filtračního papíru tak, že skla se vzorky byla položena stranou bez vzorků na filtrační papír. Poté byla skla se vzorky položena na kapky 100 mmol.l“1 Tris-CI (pH 7,4; 50 μί) na parafilmu. Skla směřovala se vzorky směrem dolů do kapky vody.
K3
V případě vzorků značených jenom EdU následoval po bodu J okamžitě bod L.
L) Následně byl přebytek vody ze vzorků odsát pomocí filtračního papíru tak, že byl filtrační papír jemně přiložen k hraně skla a skla se vzorky byla poté přemístěna na kapku (50 μί) inkubačního roztoku 3 (IR-3; složení roztoku je uvedeno v části Použité roztoky a chemikálie) a inkubovány alternativně 1 minutu, 30 minut nebo 3 hodiny.
M) Po inkubaci byly vzorky přeneseny na kapku 100 mmol.l1 Tris—Cl (pH 7,4, 50 μΙ) a inkubovány 10 minut. Tento krok byl opakován ještě dvakrát.
Příklad 2
Eliminace EdU jako antigenů pomocí nefluoreskujících azidovaných látek v tkáních.
so Následující postup popisuje eliminaci EdU v jatemí tkáni třídenních potkanů, ve které se provádí současná lokalizace EdU s BrdU, CldU nebo IdU, nebo v tkáni, ve které se provádí eliminace EdU v DNA bez inkorporovaného BrdU, CldU nebo IdU. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.
-6 CZ 303252 B6
A) Třídenní potkaní samci byli usmrceni dekapitací a následně jim byla vyjmuta játra. Játra byla nakrájena na malé kousky (3 mm - nejdelší rozměr) a položena do Petriho misek s HeLa buňkami inkubovanými jeden den v růstovém médiu DMEM s L glutaminem. doplněném 10% (obj./obj.) fetálním telecím sérem (PAA Laboratories), 1% (obj,/obj.) gentamicinem a 0,85 g/l NaHCO?.
B) Do růstového média byl přidán EdU v konečné koncentraci 2 μπιοΙ.Γ1. Vzorky byly inkubovány 10 minut v atmosféře s 5% (obj./obj.) CO? pri 37 °C. Dále následoval krok C. Alternativně bylo růstové médium obsahující EdU odstraněno a nahrazeno stejným množstvím média stejného složení bez EdU. Kousky jater byly inkubovány 3 hodiny v atmosféře s 5% (obj./obj.) CO2 při 37 °C. Po třech hodinách byi do média přidán BrdU v konečné kuncentraci 2 μπιοΙ.Γ1. Kousky jater byly inkubovány 10 minut v atmosféře s 5% (obj./obj.) CO2 při 37 °C. Alternativně byl do listového média namísto BrdU přidán CldU nebo ídU ve stejné koncentraci jako BrdU. Pak následoval krok C.
C) Následně bylo růstové médium odstraněno a kousky jater byly převrstveny pufrem (lx PBS, složení viz část Použité roztoky a chemikálie, přidány byly přibližně 1 až 2 ml putřu na 4 cm kultivační plochy). Po 5 minutách byl pufr odstraněn a nahrazen stejným množstvím lx PBS stejného složení. Tento krok byl ještě jednou opakován.
D) Kousek jater byl vložen mezi dvě kruhová skla o průměru 13 mm potažené 1% (hmotnost/obj.) želatinou a tkáň byla po povrch skel roztažena pomocí jemného tlaku pinzetou na sklo. Skla byla oddělena a obě byla vložena do Petriho misky s lx PBS tak. že skla směřovala vzorky tkání nahoru do roztoku.
Ε) V dalších krocích bylo postupováno dle kroků uvedených v Příkladu 1 (D-M).
Příklad 3
Eliminace EdU jako antigenů pomocí nefluoreskujících azidovaných látek v suspenzntch buňkách.
Následující postup popisuje eliminaci EdU vsuspenzních HeLa S3 buňkách, u kterých se EdU lokalizuje současně s BrdU, CldU nebo IdU, nebo v buňkách, v nichž se provádí eliminace EdU v DNA bez inkorporovaného BrdU, CldU nebo IdU. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev,
A) Lidské HeLa S3 buňky (dále jen vzorky) byly pěstovány v kultivačních lahvích (objem lahví byl 50 ml), které byly třepány, v růstovém médiu S-MEM (modifikace Eaglova minimálního média pro suspenzní buňky, Sigma) s 2 mmol.l1 L glutaminem a s 10% (obj./obj.) fetálním telecím sérem (PAA Laboratories), 1% (obj./obj.) gentamicinem a 0,22% (hmotnost/obj.) NaHCO3 v atmosféře s 5% (obj./obj.) CO2 při 37 °C. Buněčná suspenze obsahovala přibližně 5 až 8 x 105 buněk na 1 mililitr.
B) Druhý den po pasáži byi do růstového média přidán EdU v konečné koncentraci 2 μιτιοΐ.1 Vzorky byly inkubovány 10 minut v atmosféře s 5% (obj./obj.) CO2 pri 37 °C.
C) Následně byla suspenze buněk přenesena do 15mililitrové centrifugační zkumavky a vzorky byly odstřeďovány 1 minutu při 180 g. Supematant byl odstraněn (ve zkumavce bylo ponecháno 200 μΐ média) a ke vzorkům bylo přidáno nové médium (10 ml). Vzorky byly rozsuspendovány a následně opět odstřeďovány 1 minutu pri 180 g. Supematant byl odstraněn (ve zkumavce bylo ponecháno 200 μΐ média) a k peletu vzorků bylo přidáno 10 ml nového média. Pelet vzorků byl rozsuspendován. Dále následoval buď bod E), nebo byly vzorky inkubovány 3 hodiny v atmosféře s 5% (obj./obj.) CO2 při 37 °C a následoval bod D).
-7CZ 303252 B6
D) Po třech hodinách byl do růstového média přidán BrdU v konečné koncentraci 2 μπιοΙ.Γ1. Vzorky byly inkubovány 10 minut v atmosféře s 5% (obj./obj.) CO2 pri 37 °C. Alternativně byl do růstového média namísto BrdU přidán CldU nebo IdU ve stejné koncentraci jako BrdU. Nás5 ledně byly vzorky odstřeďovány 1 minutu při 180 g. Supematant byl odstraněn (ve zkumavce bylo ponecháno 200 μΐ média) a ke vzorkům bylo přidáno nové médium (10 ml). Vzorky byly rozsuspendovány a následně opět odstřeďovány 1 minutu při 180 g. Supematant byl odstraněn (ve zkumavce bylo ponecháno 200 μΐ média) a k peletu vzorků bylo přidáno 10 ml nového média. Pelet vzorků byl rozsuspendován.
E) Vzorky byly rozsuspendovány a následně opět odstřeďovány 1 minutu při 180 g. Supematant byl odstraněn (ve zkumavce bylo ponecháno 200 μΐ média) a k peletu vzorků byl přidán 1 ml nového média. Pelet vzorků byl rozsuspendován. 50 μΙ kapka suspenze buněk byla přenesena na kruhová skla o průměru 13 mm, potažené vrstvou poly-L-lysinu (způsob přípravy těchto skel je popsán v Části Použité roztoky a chemikálie). Po 2 minutách byl přebytek média odsát pomocí filtračního papíru tak, že byl filtrační papír jemně přiložen k hraně skla. Skla byla položena do 2% (hmotnost/obj.) roztoku formaldehydu v Petriho misce a skla se vzorky byla fixována 10 minut. Skla byla umístěna do Petriho misek tak, že směřovala vzorky nahoru do roztoku.
F) V dalších krocích bylo postupováno podle bodů E-M příkladu 1.
Navržený postup lze použít i pri práci se suspenzí buněk po celou dobu jejich zpracování, například pro FACS (Fluorescence Activated Cell Sortin). V tomto případě bylo postupováno dle bodů A až D příkladu 3 a následně podle bodů D-M příkladu 1 s tím, že pri odstraňování veškerých roztoků, přidávání nových a pri promývání byly buňky odstřeďovány 1 minutu při 180 g, následně byl odstraněn supematant (ve zkumavce bylo ponecháno 200 μΙ roztoku), k buňkám byl přidán nový roztok dle rozpisu v příkladu 1 (2 ml), buňky v něm byly rozsuspendovány a inkubovány po doby, uvedené vjednotlivých bodech příkladu 1. V průběhu těchto kroků byly buňky třepány na třepačce (Vortex Wizard, VELP Scientifica, pri 300 otáčkách za minutu), V případě inkubace v IR byly zkumavky zcela naplněny IR a uzavřeny nebo probublávány dusíkem po celou dobu inkubace v IR.
Příklad 4
Eliminace EdU jako antigenu pomocí nefluoreskujících azidovaných látek v buňkách přisedlých na podložní skla, suspenzních buňkách a tkáních před inkubací, zpřístupňující pyrimidinové nukleosidy.
Následující postup popisuje alternativní eliminaci EdU jako antigenu v HeLa buňkách přisedlých na podložních sklíčkách, suspenzních HeLA S3 buňkách nebo v jaterní tkáni třídenních potkanů, u kterých se EdU lokalizuje současně s BrdU, CldU nebo IdU, anebo v buňkách, v nichž se eliminuje EdU v DNA bez inkorporovaného BrdU, CldU nebo IdU. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti a následovaly po sobě bez dalších prodlev.
Postup byl shodný s protokoly z příkladu 1, 2 a 3 s následujícími změnami;
Po bodu J příkladu 1 následovala nejdříve inkubace vzorků v IR-3 podle bodu L příkladu 1: Nejprve byl přebytek vody ze vzorků odsát pomocí filtračního papíru tak, že byl filtrační papír jemně přiložen k hraně skla a skla se vzorky byla přemístěna na kapku (50 μΙ) 1R-3 (složení roztoku je uvedeno v části Použité roztoky a chemikálie). Vzorky zde byly inkubovány alternativně 1 minutu, 30 minut nebo 3 hodiny. Po inkubaci byly vzorky přeneseny na kapku destilované vody (50 μΐ). Po 5 minutách byly vzorky přeneseny na novou stejně velkou kapku destilované vody. Tento krok byl opakován ještě jednou. Pak následoval bod K a po něm bod M podle příkladu I.
- 8 CZ 303252 B6
Příklad 5
Eliminace EU jako antigenu pomocí nefluoreskuj ících azidovaných látek v buňkách přisedlých 5 na podložní skla, suspenzních buňkách a tkáních.
Následující postup popisuje eliminaci EU jako antigenu v HeLa buňkách přisedlých na podložních sklíčkách, suspenzních HeLa S3 buňkách nebo v jatemí tkáni třídenních potkanů, u kterých se EU lokalizuje současně s BrU, případně FU, anebo v buňkách, v nichž se eliminuje EU v DNA io bez inkorporovaného BrU nebo FU. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.
Postup byl shodný s protokoly z příkladu I, 2 a 3 s následujícími změnami:
Vzorky byly místo s EdU inkubovány s EU, a to v konečné koncentraci 5 pmol.I1, vzorky byly stejně jako v případě EdU inkubovány 10 minut. Vzorky nebyly inkubovány s BrdU, CldU nebo IdU, ale byly inkubovány s BrU nebo FU v koncentraci 5 pmol.r’.
Byl zcela vynechán bod K.
Alternativně jsme použili postup popsaný v příkladu 4. V tomto případě byly vzorky rovněž místo s EdU inkubovány s EU, a to v konečné koncentraci 5 μιηοΙ.Γ1, vzorky byly stejně jako v případě EdU inkubovány 10 minut. Vzorky nebyly inkubovány s BrdU, CldU nebo IdU, ale byly inkubovány s BrU nebo FU v koncentraci 5 μπιοΙΤ1.
Byl zcela vynechán bod K.
Použité roztoky a chemikálie:
1. Fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (PBS) lOx PBS (desetinásobně koncentrovaný roztok PBS):
1,4 mol.F1 NaCl 26 mmol.l1 KC1
90 mmol.l1 Na2HPO4 mmol.l1 KH2PO4
Uvedené složky byly rozpuštěny v destilované vodě a pH upraveno do rozmezí 7,3 až 7,4 lx PBS (fosfátem pufrovaný fyziologický roztok v obvyklé koncentraci)
0,5x PBS (fosfátem pufrovaný fyziologický roztok v poloviční koncentraci)
0,25x PBS (fosfátem pufrovaný fyziologický roztok ve čtvrtinové koncentraci)
2. Inkubační roztok l (1R-1):
A.
a. Destilovaná voda
b. 100 mmol.r’ Tris-Cl, pH 7,4 50 c. 10 mmol.l 1 askorbát sodný
-9 CZ 303252 B6
d. 4 mmol.l 1 síran měďnatý
e. 20 gmol.l 1 tetramethylrhodamin-azid (TAMRA-azid)
Zmíněné složky IR byly přidávány v uvedeném pořadí.
B.
f. Destilovaná voda
g. 100 mmol.l 1 Tris-Cl, pH 7,4
h. 10 mmol.l·1 askorbát sodný
i. 4 mmol.l 1 síran měďnatý
j. 20 pmol.l 1 biotin-azid
Zmíněné složky IR byly přidávány v uvedeném pořadí.
2. Inkubační roztok 2 (IR 2):
a. Destilovaná voda
b. 10 mmol.l“1 askorbát sodný
c. 4 mmol.l“1 síran měďnatý
Zmíněné složky IR byly přidávány v uvedeném pořadí.
3. Inkubační roztok 3 (IR-3):
a. Destilovaná voda
b. 100 mmol.r1 Tris-Cl, pH 7,4
c. 10 mmoU“1 askorbát sodný
d. 4 mmol.l1 síran měďnatý
e. Alternativně 0,001; 2 nebo 100 mmol.r1 azidomethylfenylsulfid
Zmíněné složky IR byly přidávány v uvedeném pořadí.
Alternativně byl namísto azidomethylfenylsulfidu použit 2-azidoethanol, azidomethylbenzylsulfid, azidomethylmethylsulfíd, 3-azido-l,2-propandiol, l,3-diazido-2-propanol, 3-azido-2propanol, 3-azidopropanol, 1,3-diazidopropan, 1,2-diazidoethan, 2-(2-azidoethoxy)ethanol, 8azido-3,6-díoxaoktanol, 1 l-azído-3,6,9-trioxaundekanol, 2-azidoethy lamin, 3-azidopropylamin, 4-az ido buty lamin, 5-azidopenty lamin, 6-azidohexy lamin, 2-(2-azidoethoxy)ethy lamin, 8-azido-3,6-dioxaokty lamin, 11-azido-3,6,9-trioxaundecy lamin, N(2-azidoethyl)dimethyiamin, N-(3-azÍdopropyl)dimethy lamin, N—(4-az idobu ty l)d i methy lamin, N-(5-azidopentyI)dimethylamin, N-( 6-azidohexy l)d i methy lamin, N-( 5 -azido-3-oxape n ty l)d imethy lamin, N-(8azido~3,6-dioxaoktyl)dimethyíamin, N-(l l-azido-3,6,9-trioxaundecyl)dimethylamin, dále chloridy, bromidy, jodidy, sulfáty, chloristany, tosyláty, mesyláty, nitráty, tetrafluorboráty a hexafluorfosfáty, N-(2-azidoethy l)trimethylamonia, N-(3-azidopropyl)trimethylamonia, N-{4azidobutyljtrimethylamonia, N-(5-azidopentyl)trimethyIamonia, N-(6-azidohexyl)trimethylamonia, N-(5-azido-3-oxapentyl)trimethylamonia, N-(8-azido-3,6-díoxaoktyl)trimethylamonia čí N-(11-azido-3,6,9-trioxaundecy l)trimethylamonia ve stejné koncentraci jako azidomethylfenylsulfid, nebo byla použita kombinace uvedených látek,
CZ 303252 Bó
4. Vymývací roztok:
a. 100 mmol.l 1 Tris-HCl, pH 7,4
b. 100 mmol.l“1 NaCl
Roztok exonukleázy Ilí:
a) Destilovaná voda
b) !x pufr pro exonnkleázu 111 (Fermentas, 2 μΙ lOx koncentrovaného pufru do 20 μΐ směsi), tento pufr jc dodáván jako ÍOx koncentrovaný. Složení lOx koncentrovaného pufru ie následující; 660 mmol.l“1 Tris-HCl (pH 8,0 při 30 °C), 6,6 mmol.l1 MgCh.
c) IU/μΙ Exonukleáza Ilí (Fermentas)
Jedna jednotka (U) enzymu uvolni za 30 minut 1 mmol produktu z DNA E. coli při 37 °C. Enzymatická aktivita byla měřena v následující směsi: 50 mmol.l“1 Tris-HCl (pH 8,0), 5 mmol.l·1 MgCh, I mmol.l1 dithiothreitol a 0,05 mmol.l’1 ultrazvukem dezintegro vane (sonikované) DNA z E. coli.
6. Příprava polylysinových skel pro ukotveni suspenzních buněk
Kruhová skla s průměrem 13 mm byla položena do 50ml kádinky s 20 ml 96% (obj./obj.) ethanolu. Po 10 minutách byla pomocí pinzety přenesena do Petriho misky, ve které byl na dně položený filtrační papír a usušena. Skla byla na dob 1 minuty ponořena do 0,01% (obj./obj.) roztoku poly-L-lysinu v DMEM, následně na 30 sekund do Ix PBS a ještě jednou na 30 sekund do PBS. Tento krok byl ještě 3x opakován. Nakonec byla skla položena na filtrační papír a usušena.
Průmyslová využitelnost
Způsob eliminace EdU a EU jako antigenů rozeznávaného protilátkami reagujícími s uvedenými molekulami je využitelný v případech, kdy je nutné provádět několikanásobné detekce pomocí protilátek namířených proti strukturně podobné, současně detekované molekule. Jedná se např. o současnou lokalizaci BrdU a EdU nebo BrU a EU. V této souvislosti je možné mimo jiné předpokládat včlenění této procedury a jednotlivých použitých látek do sad pro detekci DNA nebo RNA.
Claims (2)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob eliminace 5-ethynyl-2'-deoxyuridinu a 5-ethynyluridinu jako antigenů, rozeznávaných protilátkami reagujícími s uvedenými molekulami při detekci nukleových kyselin, vyznačující se tím, že vzorky obsahující deoxyribonukleovou kyselinu s inkorporovaným 5-ethyny 1-2'-deoxyuridinem nebo ribonukleovou kyselinu s inkorporovaným 5-ethynyluridinem se ve vodných roztocích obsahujících měďné ionty inkubují s malou azídovanou nefluoreskující sloučeninou zvolenou ze skupiny, zahrnující azidomethyl fenyl sulfid, 2-azidoethanol, azidomethylbenzylsulfid, azidomethylmethylsulfid, 3-azido-l,2-propandiol, 1,3-diazido-2-propanol, 3-azido-2-propanol, 3-azidopropanol, 1,3-diazidopropan, 1,2-diazidoethan, 2(2-azidoethoxy)ethanol, 8-azido-3,6-dioxaoktanol, 1 l-azido-3,6,9-trioxaundekanol, 2-azidoethylamin, 3-azidopropy lamin, 4-azidobuty lamin, 5-azidopentylamin, 6-azidohexylamin, 2-(2azidoethoxy)ethylamin, 8-azido-3,6-dioxaoktylamin, 1 l-azido-3,6,9-trioxaundecylamin, N-(2- 11 CZ 303252 B6 azidoethyljdimethylamin, N-(3-azidopropyl)dimethylamin, N~{4-azidobutyl)dimethylamin, N~ (5-azidopentyl)dimethylamin, N-(6-azidohexyl)dimethy lamin, N-(5-azido-3—oxapentyl)dimethylamin, N-(8-azÍdo-3,6-dioxaoktyl)dimethylamin, N—< 1 1 -azido-3,6,9-trioxaundecyl)dimethylamin, dále chloridy, bromidy, jodidy, sulfáty, chloristany, tosyláty, mesyláty, nitráty, tetra5 fluorboráty a hexafluorfosfáty, N-(2-azidoethyl)trimethyIamonia, N-(3-azidopropyl)trimethylamonia, N-(4-az i dobutyl)tri methy lamonia, N-{5-azidopentyl)tr i methy lamonia, N-(6-azidohexyl)tr imethy lamonia, N-(5-azido-3-oxapentyl)trimethylamonia, N-(8-azido-3,6-dioxaoktyl)tri methy lamonia, N—(1I-azido-3,6,9-trioxaundecyl)tr i methy lamonia nebo jejich kombinace, čímž se účinně blokuje interakce 5-ethynyl-2'-deoxyurídinu nebo 5-ethynyluridinu s protito látkami namířenými proti strukturně podobným molekulám.
- 2. Způsob eliminace 5-ethynyl-2'-deoxyuridinu a 5-ethynyluridinu jako antigenů, rozeznávaných protilátkami reagujícími s uvedenými molekulami při detekci nukleových kyselin podle nároku 1, vyznačující se tím, že reakce s malou nefluoreskuj ící azidovanou moleku15 lou se provede mezi dvěma reakcemi, používanými při detekci nukleových kyselin, tedy- následně po reakci nukleových kyselin s azidovanou molekulou nesoucí fluorochrom nebo biotin nebo digoxigenin nebo jinou relativně velkou molekulu, která později slouží k detekci EdU a- před reakcí specifických protilátek vůči nukleosidům obsaženým v detekovaných nukleových kyselinách.2 výkresy- 12ί Z 303252 ΒυObr. ί
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20110324A CZ303252B6 (cs) | 2011-06-01 | 2011-06-01 | Zpusob eliminace antigenních vlastností 5-ethynyl-2´-deoxyuridinu a 5-ethynyluridinu pri detekci nukleových kyselin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20110324A CZ303252B6 (cs) | 2011-06-01 | 2011-06-01 | Zpusob eliminace antigenních vlastností 5-ethynyl-2´-deoxyuridinu a 5-ethynyluridinu pri detekci nukleových kyselin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2011324A3 CZ2011324A3 (cs) | 2012-06-20 |
| CZ303252B6 true CZ303252B6 (cs) | 2012-06-20 |
Family
ID=46232375
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20110324A CZ303252B6 (cs) | 2011-06-01 | 2011-06-01 | Zpusob eliminace antigenních vlastností 5-ethynyl-2´-deoxyuridinu a 5-ethynyluridinu pri detekci nukleových kyselin |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ303252B6 (cs) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ307016B6 (cs) * | 2015-03-13 | 2017-11-15 | Univerzita PalackĂ©ho v Olomouci | Způsob stabilizace protilátek rozeznávajících 5-bromo-2´-deoxyuridin a/nebo 5-chloro-2´-deoxyuridin a/nebo 5-jodo-2´-deoxyuridin v místech inkorporace těchto nukleosidů do DNA po působení jednomocnou mědí a/nebo exonukleázou III |
| EP3186387B1 (en) * | 2014-08-26 | 2018-10-17 | Univerzita Palackého v Olomouci | Method of determining the activity of enzymes converting cytosine derivatives to uracil derivatives in cells, tissues and organisms |
| CZ309218B6 (cs) * | 2014-08-26 | 2022-06-01 | Univerzita Palackého v Olomouci | Způsob stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v buňkách a tkáních |
-
2011
- 2011-06-01 CZ CZ20110324A patent/CZ303252B6/cs not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| Bradford J.A., Clarke S.T. Dual-pulse labeling using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) and 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry, 2011, 55, Chapter 7, Unit 7.38. * |
| Buck S.B. et al. Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies. BioTechniques 2008, 44, 927-929. * |
| Cappella P. et al. A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining. Cytometry 2008, 73, 626-636. * |
| Chehrehasa F. et al. EdU, a new thymidine analogue for labelling proliferating cells in the nervous system. Journal of Neuroscience Methods 2009, 177, 122û130. * |
| Jao C.Y, Salic A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proc Natl Acad Sci USA 2008, 105, 15779-15784. * |
| Li K. et al. Fluorogenic "clickö reaction for labeling and detection of DNA in proliferating cells. BioTechniques 2010, 49, 525-527. * |
| Salic A., Mitchison T.J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 2008, 105, 2415-2420. * |
| Zeng C. et al. Evaluation of 5-ethynyl-2'-deoxyuridine staining as a sensitive and reliable method for studying cell proliferation in the adult nervous system. Brain Research 2010, 1319, 21-32. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3186387B1 (en) * | 2014-08-26 | 2018-10-17 | Univerzita Palackého v Olomouci | Method of determining the activity of enzymes converting cytosine derivatives to uracil derivatives in cells, tissues and organisms |
| CZ309218B6 (cs) * | 2014-08-26 | 2022-06-01 | Univerzita Palackého v Olomouci | Způsob stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v buňkách a tkáních |
| CZ307016B6 (cs) * | 2015-03-13 | 2017-11-15 | Univerzita PalackĂ©ho v Olomouci | Způsob stabilizace protilátek rozeznávajících 5-bromo-2´-deoxyuridin a/nebo 5-chloro-2´-deoxyuridin a/nebo 5-jodo-2´-deoxyuridin v místech inkorporace těchto nukleosidů do DNA po působení jednomocnou mědí a/nebo exonukleázou III |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ2011324A3 (cs) | 2012-06-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9464315B2 (en) | Modified surfaces as solid supports for nucleic acid purification | |
| EP2479268B1 (en) | Dissociation method and dissociation agent for avidin and biotinderivatives | |
| Pugh et al. | Effects of S-adenosylhomocysteine analogs on vaccinia viral mRNA synthesis and methylation | |
| JP5763545B2 (ja) | ホルマリン固定組織からの種々の生体分子の並行抽出 | |
| US4898951A (en) | Compounds used as intermediates in the preparations of non-radioactive biological probes | |
| JP2011236237A (ja) | 回収可能な形式での安定なタンパク質保管および安定な核酸保管 | |
| JP2015520385A (ja) | アプタマーに基づく多重化アッセイ | |
| CZ303252B6 (cs) | Zpusob eliminace antigenních vlastností 5-ethynyl-2´-deoxyuridinu a 5-ethynyluridinu pri detekci nukleových kyselin | |
| CN109023535A (zh) | 一种用抗体针对无识别标记蛋白或细胞裂解物的dna编码化合物筛选方法 | |
| Bendayan | A review of the potential and versatility of colloidal gold cytochemical labeling for molecular morphology | |
| WO2016026453A2 (zh) | 一种检测样品中靶核酸的试剂盒及检测方法 | |
| JP5670737B2 (ja) | 膜タンパク質の抽出方法 | |
| EP0155854B1 (en) | Non-radioactive biological probes | |
| Schäfer | Mercurated nucleotides: essessment of a new tool to study RNA synthesis and processing in isolated nuclei | |
| CZ309218B6 (cs) | Způsob stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v buňkách a tkáních | |
| Nosov et al. | Extra perspectives of 5-ethynyl-2′-deoxyuridine click reaction with fluorochrome azides to study cell cycle and deoxyribonucleoside metabolism | |
| CZ38478U1 (cs) | Sada pro identifikaci buněk postrádajících funkční cytidinovou deaminázu | |
| CN102640000B (zh) | 采用次级离子质谱法(sims)高灵敏度检测和定量生物分子的改进方法 | |
| US20250034547A1 (en) | Compositions and methods for the purification and concentration of nucleic acids from large-volume samples | |
| CZ28964U1 (cs) | Sada pro zpřístupnění specifických pyrimidinových nukleosidů ve struktuře dvouřetězcové DNA pro reakci s protilátkami, které s těmito nukleosidy reagují | |
| CZ2015183A3 (cs) | Způsob stabilizace protilátek rozeznávajících 5-bromo-2´-deoxyuridin a/nebo 5-chloro-2´-deoxyuridin a/nebo 5-jodo-2´-deoxyuridin v místech inkorporace těchto nukleosidů do DNA po působení jednomocnou mědí a/nebo exonukleázou III | |
| EP1813938A1 (en) | Composition for an electrophoresis matrix | |
| Lee et al. | Intracellular localization of viral RNA in Eimeria necatrix of the domestic fowl | |
| CZ2011309A3 (cs) | Zpusob znacení dvouretezcových molekul DNA | |
| JP2025005848A (ja) | 検出対象物の検出方法、排水の監視方法、検出対象物検出キット、及び排水監視キット |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20190601 |