CZ309218B6 - Způsob stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v buňkách a tkáních - Google Patents
Způsob stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v buňkách a tkáních Download PDFInfo
- Publication number
- CZ309218B6 CZ309218B6 CZ2014579A CZ2014579A CZ309218B6 CZ 309218 B6 CZ309218 B6 CZ 309218B6 CZ 2014579 A CZ2014579 A CZ 2014579A CZ 2014579 A CZ2014579 A CZ 2014579A CZ 309218 B6 CZ309218 B6 CZ 309218B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- cells
- derivatives
- samples
- activity
- solution
- Prior art date
Links
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 34
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical class NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 32
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical class O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 26
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 26
- HMJSYXIPNSASJY-DJLDLDEBSA-N 4-amino-5-ethynyl-1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidin-2-one Chemical compound C1=C(C#C)C(N)=NC(=O)N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 HMJSYXIPNSASJY-DJLDLDEBSA-N 0.000 claims abstract description 30
- 102100026846 Cytidine deaminase Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 108010031325 Cytidine deaminase Proteins 0.000 claims abstract description 14
- CDEURGJCGCHYFH-DJLDLDEBSA-N 5-ethynyl-2'-deoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C#C)=C1 CDEURGJCGCHYFH-DJLDLDEBSA-N 0.000 claims abstract description 7
- NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxycytosine 5'-monophosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract 2
- 238000012650 click reaction Methods 0.000 claims description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 59
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 49
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 30
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 27
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 17
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 16
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 16
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 13
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 9
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 9
- NJCXGFKPQSFZIB-RRKCRQDMSA-N 5-chloro-1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Cl)=C1 NJCXGFKPQSFZIB-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 8
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 230000009615 deamination Effects 0.000 description 7
- 238000006481 deamination reaction Methods 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 102100037101 Deoxycytidylate deaminase Human genes 0.000 description 6
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 108010015012 dCMP deaminase Proteins 0.000 description 6
- DHZYXWMZLAKTQV-UHFFFAOYSA-N diazepin-3-one Chemical compound O=C1C=CC=CN=N1 DHZYXWMZLAKTQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 6
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 4
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 4
- 125000000852 azido group Chemical group *N=[N+]=[N-] 0.000 description 4
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 4
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- UCKYOOZPSJFJIZ-XVKVHKPRSA-N 1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-4-hydroxy-1,3-diazinan-2-one Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(O)CC1 UCKYOOZPSJFJIZ-XVKVHKPRSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 3
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- 239000008098 formaldehyde solution Substances 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- IMNIMPAHZVJRPE-UHFFFAOYSA-N triethylenediamine Chemical compound C1CN2CCN1CC2 IMNIMPAHZVJRPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- RPQZTTQVRYEKCR-WCTZXXKLSA-N zebularine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)N=CC=C1 RPQZTTQVRYEKCR-WCTZXXKLSA-N 0.000 description 3
- CKTSBUTUHBMZGZ-CHKWXVPMSA-N 4-amino-1-[(2s,4r,5s)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-CHKWXVPMSA-N 0.000 description 2
- XAUDJQYHKZQPEU-KVQBGUIXSA-N 5-aza-2'-deoxycytidine Chemical compound O=C1N=C(N)N=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 XAUDJQYHKZQPEU-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 2
- 108010080611 Cytosine Deaminase Proteins 0.000 description 2
- 102000000311 Cytosine Deaminase Human genes 0.000 description 2
- CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N Deoxycytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1OC(CO)C(O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 2'‐deoxycytidine Chemical class O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NYPIRLYMDJMKGW-VPCXQMTMSA-N 4-amino-1-[(2r,3r,4r,5r)-3-fluoro-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)-3-methyloxolan-2-yl]pyrimidin-2-one Chemical compound C[C@@]1(F)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)N=C(N)C=C1 NYPIRLYMDJMKGW-VPCXQMTMSA-N 0.000 description 1
- 101710128039 5'-deoxynucleotidase Proteins 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical class O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 229950004398 broxuridine Drugs 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N gemcitabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1C(F)(F)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 150000004712 monophosphates Chemical class 0.000 description 1
- 239000012120 mounting media Substances 0.000 description 1
- 229940127073 nucleoside analogue Drugs 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 235000010378 sodium ascorbate Nutrition 0.000 description 1
- PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M sodium ascorbate Substances [Na+].OC[C@@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M 0.000 description 1
- 229960005055 sodium ascorbate Drugs 0.000 description 1
- PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M sodium-L-ascorbate Chemical compound [Na+].OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 239000002966 varnish Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/978—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Způsob stanovení deaminázové aktivity enzymů cytidin deaminázy a deoxycytidin 5'-monofosfát deaminázy, přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v tkáních nebo buňkách in vitro, vyznačující se tím, že se vzorek buněk nebo tkání inkubuje s 5-etynyl-2'-deoxycytidinem, přičemž 5-etynyl-2'-deoxycytidin se v přítomnosti enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty následně ve vzorku přemění na deaminovaný produkt 5-etynyl-2'-deoxyuridin, a tento 5-etynyl-2'-deoxyuridin se následně detekuje v DNA a stanoví se množství inkorporovaného 5-etynyl-2'-deoxyuridinu v DNA pomocí klik reakce.
Description
Způsob stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v buňkách a tkáních
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v buňkách a tkáních.
Dosavadní stav techniky
Díky působení deamináz dochází k přeměně celé řady cytosinových derivátů na uracilové. Cytosin specifické enzymy se rovněž podílejí na deaminaci některých analogů deoxycytidinu a jejich monofosfátů. Příkladem takových analogů jsou některá léčiva, např. ara-C (1-βarabinofůranosylcytosin), dFdC (2',2'-difluor-2-deoxyuridin), PSI-6130 (P-D-2'-deoxy-2'-Cmethylcytidin), L-dC (β-L-2'-deoxycytidin) nebo 5-aza-dC (5-aza-2'-deoxycytidin). Předpokládá se, že jejich deaminace může ovlivnit výsledek léčby (např. Fundam Clin Pharm, 25, 172-185). V současnosti však rychlé a spolehlivé procedury pro určení aktivity cytosinových deamináz chybějí. Nej častějším přístupem pro stanovení aktivity cytosinových deamináz v buňkách je analýza produktů deaminace po desintegraci buněk, případně tkání. Při použití současných technik se však jedná o poměrně zdlouhavý proces, často za použití radioaktivních značek, který dovoluje získat údaje o průměrné aktivitě v relativně velké populaci buněk, nikoli však stavu v malých buněčných populacích, případně v jednotlivých buňkách (pro souhrn viz např. Fundam Clin Pharm, 25, 172185; Cancer Res, 47, 3130-3135).
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález poskytuje postup umožňující rychlé stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty ve vzorku s využitím analogu cytosinových nukleosidů (dále jen značené cytosinové nukleosidy), 5-etynyl-2'-deoxycytidinu (EdC). Tato látka se deaminaci přemění na uracilový derivát, který se následně detekuje v DNA. EdC je přeměněn na 5-etynyl-2'-deoxyuridin (EdU, příklad deamináz, které se mohou podílet na deaminaci EdU je na obr. 1). Množství uracilového nukleosidového analogu se následně stanoví pomocí tzv. klik reakce (Proc Natl Acad Sci USA, 105, 2415-2420), která je ve srovnání s protilátkovou detekcí velice rychlá a vysoce efektivní. Pro analýzu signálu produkovaného protilátkami nebo klik reakcí je možné použít např. klasické mikroskopické techniky případně techniky založené na použití zařízení typu průtokových cytometrů nebo čteček destiček. Schéma stanovení nukleosidů je znázorněno na obr. 2.
Vzorkem může být například vzorek tkáně či buňky.
Enzymy přeměňujícími cytosinové deriváty na uracilové deriváty mohou být, např. cytidin deamináza (CDA) a deoxycytidin 5'-monofosfát deamináza (dCMP deamináza).
Použití způsobu stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty je například při stanovení deaminázové aktivity v buňkách ošetřených látkami, které ovlivňují deaminázovou aktivitu enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty. Takovými látkami mohou být malé molekuly, např. diazepinon ribonukleosid, 3,4,5,6tetrahydrouridin nebo zebularin, látky potenciálně vhodné jako nové inhibitory deamináz, nebo oligonukleotidové sekvence DNA nebo RNA (např. siRNA) cílené na inhibici exprese uvedených deamináz.
- 1 CZ 309218 B6
Sada pro stanovení deaminázové aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty obsahuje substrát enzymu přeměňujícího cytosinové deriváty na uracilové deriváty (5etynyl-2'-deoxycytidin), a prostředky pro detekci deaminovaných uridinových produktů vzniklých deaminaci substrátu v DNA.
Objasnění výkresů
Obrázek 1 Metabolismus EdC a EdCMP z hlediska deaminační aktivity některých známých deamináz v lidských buňkách.
CDA - 2'-deoxycytidin/cytidin deamináza; dCK - 2'-deoxycytidinkináza; dCMPDA - 2'deoxycytidin-5'-fosfátdeamináza; cdN a mdN - cytosolická a mitochondriální pyrimidin specifická 5 '-deoxynukleotidáza
Obrázek 2: Schematické znázornění stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty.
Obrázek 3: Stanovení Κε*ι/2 a KEdui/2 v HeLa buňkách pomocí specifických protilátek nebo pomocí klik reakce (příklad 1).
Obrázek znázorňuje závislost průměrné intenzity signálů na použité koncentraci EdU nebo EdC po dvou hodinách inkubace s různými koncentracemi EdU nebo EdC. Pro detekci obou modifikovaných nukleosidů byly použity dva způsoby: A) detekce pomocí klik reakce s azidobarvičkou (Alexa Fluor 488-azid); B) detekce pomocí primární anti-bromodeoxyuridinové protilátky a sekundární protilátky konjugované s Alexa Fluor 488. Naměřené intenzity signálů byly zpracovány v softwaru Sigma Plot, pomocí kterého byla zkonstruována křivka i určena poloviční hodnota efektivní koncentrace. Z průběhu grafů je patrné, že EdC není pravděpodobně inkorporován do DNA. To potvrdily i vzájemné poměry mezi naměřenými hodnotami intenzit získaných pomocí protilátky a klik reakce. Tyto poměry byly 1,099 pro EdU a 1,060 pro EdC. Hodnota poměrů EC50 u EdU a EdC (KEdui/2/KEdci/2) byla 0,23 pro detekci provedenou pomocí protilátek a 0,32 pro detekci provedenou pomocí klik reakce. Podle našich zjištění z analýzy izolované DNA byl obsah EdC v DNA menší než 10%, což by odpovídalo podobným výsledkům, které byly získány dvěma nezávislými metodami.
Obrázek 4 Časová křivka (příklad 1).
Časový průběh inkorporace EdU a EdC do DNA HeLa buněk. V tomto případě byly buňky inkubovány s 10 pmol.l1 EdU nebo EdC po dobu 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 a 240 minut. Inkorporované nukleosidy byly detekovány pomocí klik reakce s azidovaným fluorochromem.
Obrázek 5 Vliv diazepinon ribonukleosidu na deaminaci EdC, BrdC, CldC a IdC (příklad 6). Buňky byly inkubovány 2 hodiny v médiu s 10 pmol.l1 diazepinon ribonukleosidem a alternativně s 10 pmol.l1 EdC nebo EdU nebo BrdC nebo BrdU nebo CldC nebo CldU nebo IdC nebo IdU. EdU byl detekován stejně jako BrdU, CldU a IdU pomocí protilátek. Na výsledném grafů je zobrazen normalizovaný poměr průměrných intenzit signálů buněk ovlivněných a neovlivněných diazepinon ribonukleosidem. Uvedená data jsou v procentech. 100% odpovídá poměru pro kontrolní neovlivněné buňky.
Obrázek 6 Vliv siRNA cílené proti CDA a dCMP deamináze na intenzitu signálu EdU a EdC v HeLa buňkách (příklad 7).
Buňky ovlivněné siRNA cílené proti CDA nebo dCMP byly inkubovány 2 hodiny s 10 pmol.l1 EdU nebo EdC. EdU byl detekován pomocí protilátek. Na výsledném grafů je zobrazen normalizovaný poměr průměrných intenzit signálů EdC/EdU po ovlivnění buněk siRNA cílené
-2CZ 309218 B6 proti CDA, dCMP deamináze a kontrolní siRNA. Uvedená data jsou v procentech. 100% odpovídá poměru pro kontrolní buňky ovlivněné kontrolní neaktivní siRNA.
Příklady uskutečnění vynálezu
Seznam použitých zkratek:
HeLa buněčná linie lidských epiteliálních buněk
DMEM Dulbeccova modifikace Eaglova média
PBS fosfátem pufrovaný fyziologický roztok
S-MEM modifikace Eaglova minimálního média pro suspenzní buňky
Veškeré příklady vycházejí z přeměny jednotlivých cytosinových derivátů na uracilové deriváty a následném stanovení obsahu těchto derivátů v DNA nebo RNA pomocí protilátek nebo klik reakce s azido molekulami (obr. 2).
Příklad 1
Stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v buňkách přisedlých na podložních sklíčkách.
Následující postup popisuje způsob stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v HeLa buňkách přisedlých na podložních sklíčkách. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.
A) Lidské HeLa buňky (dále jen vzorky) byly pěstovány v Petriho miskách na kruhových sklech o průměru 12 mm v růstovém médiu - DMEM s L-glutaminem (Gibco), 10% (obj./obj.) fetálním telecím sérem (PAA Laboratories), 50 pg/ml gentamicinem a 3,7 g/1 NaHCO3 v atmosféře s 5% (obj./obj.) CO2při37°C.
B) Druhý den po pasáži byl do růstového média přidán alternativně 0,00064; 0,0032; 0,016; 0,08; 0,4; 2; 10; 20; 50; 250; 1250 nebo 6250 pmol.l1 EdC nebo EdU nebo BrdC nebo BrdU nebo CldC nebo CldU nebo IdC nebo IdU nebo EC nebo EU nebo BrC nebo BrU nebo C1C nebo C1U nebo IC nebo IU nebo FC nebo FU nádobu 30, 60, 90,120,150,180, nebo 210 minut nebo 4 nebo 6 nebo 24 hodin.
C) Následně bylo růstové médium odstraněno a nahrazeno pufrem (Ix PBS, složení viz část Použité roztoky a chemikálie, přidány byly přibližně 1 až 2 ml pufru na 4 cm2 plochy).
D) Pufr byl odstraněn a vzorky byly 10 minut fixovány 2% (hmotnost/obj.) roztokem formaldehydu v lx PBS (pH 7,4; 1 až 2 ml fixačního roztoku na 4 cm2 plochy).
Alternativně byly vzorky fixovány metanolem a následně acetonem. V tomto případě byla skla se vzorky nejdříve inkubována 10 minut v metanolu při teplotě -20 °C (přibližně 1 až 2 ml metanolu na 4 cm2 plochy) a následně byla ponořena na 30 sekund do kádinky s 50 ml acetonu o teplotě místnosti, skla se vzorky pak byla usušena a po usušení položena do Petriho misky s Ix PBS, přičemž vzorky směrovaly nahoru do roztoku. V případě použití metanolu a acetonu následoval krok G).
E) Roztok formaldehydu byl odstraněn a vzorky byly převrstveny Ix PBS (přibližně 1 až 2 ml Ix PBS na 4 cm2 plochy). Po 5 minutách byl pufr odstraněn a nahrazen novým o stejném složení. Tento krok byl opakován ještě jednou.
-3 CZ 309218 B6
F) Následně byl pufr odstraněn. Vzorky byly 10 minut permeabilizovány 0,2% (obj ./obj.) roztokem Tritonu X-100 v lx PBS (přibližně 1 až 2 ml permeabilizačního roztoku na 4 cm2 plochy). Po odstranění permeabilizačního roztoku byly vzorky převrstveny Ix PBS (přibližně 1 až 2 ml Ix PBS na 4 cm2 plochy).
G) Po 5 minutách byl roztok Ix PBS odstraněn a nahrazen stejným množstvím téhož roztoku. Tento krok byl opakován ještě jednou.
Η) V případě, že byly pro detekci EdU použity protilátky a ve všech případech, kdy bylo použito BrdU nebo BrdC nebo CldU nebo CldC nebo MU nebo MC, bylo Ix PBS odstraněno a nahrazeno vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové (4 mol.l1, přibližně 1 až 2 ml roztoku kyseliny na 4 cm2 plochy). Tento krok slouží k odhalení výše uvedených nukleosidů ve struktuře DNA. Alternativně lze použít jakékoli jiné přístupy odhalující tyto nukleosidy ve struktuře DNA. Jedná se prakticky o veškeré popsané přístupy používané pro odhalení BrdU (viz např. PloS One, 7, e52584 nebo Genes Dev, 14, 2855-2868 nebo J Cell Sci, 115, 4037-4051). Po 20 minutách inkubace na pokojové teplotě byl roztok kyseliny chlorovodíkové odstraněn a nahrazen Ix PBS.
V ostatních případech byl krok H vynechán a bylo pokračováno bodem J.
I) Po 5 minutách byl roztok Ix PBS odstraněn a nahrazen stejným množstvím téhož roztoku. Tento krok byl opakován ještě jednou.
J) Skla se vzorky byla vyjmuta pomocí pinzety z Petriho misky a přebytek pufru byl odsát pomocí filtračního papíru tak, že skla se vzorky byla položena stranou bez vzorků na filtrační papír. Skla se vzorky byla položena na kapky Ix PBS na parafilmu (150 μΐ/kapka, tato velikost byla použita vždy, pokud není uvedeno jinak). Skla směřovala vrstvou se vzorky směrem dolů do kapky. V případě, že EdU nebo EdC nebo EU nebo EC bylo detekováno pomocí azidovaného fluorochromu, bylo postupováno podle bodu N. V ostatní případech bylo postupováno podle bodu K.
K) Vzorky byly inkubovány 30 minut na 20 μΐ kapkách s protilátkou rozeznávající EdU ale ne EdC, nebo protilátkou rozeznávající BrdU, ale ne BrdC, nebo protilátkou rozeznávající CldU, ale ne CMC, nebo protilátkou rozeznávající MU, ale ne MC, nebo protilátkou rozeznávající EU, ale ne EC, nebo protilátkou rozeznávající FU, ale ne FC, nebo protilátkou rozeznávající BrU, ale ne BrC, nebo protilátkou rozeznávající C1U, ale ne C1C, nebo protilátkou rozeznávající IU, ale ne IC, ředěnou v Ix PBS (koncentrace protilátky byla 5 pg/ml, dále jen primární protilátka).
L) Skla se vzorky byla přenesena na kapku Ix PBS. Po 5 minutách byla skla se vzorky přenesena na novou kapku Ix PBS stejného složení. Tento krok byl ještě třikrát opakován.
M) Skla se vzorky byla inkubována 30 minut s protilátkou konjugovanou s fluorochromem Cy3 (sekundární protilátka) a reagující s primární protilátkou na kapkách o velikosti 20 μΐ (sekundární protilátka byla ředěna v poměru 1:100 v Ix PBS). Následně bylo pokračováno podle bodu O.
N) Následně byl přebytek Ix PBS ze vzorků odsát pomocí filtračního papíru tak, že filtrační papír byl jemně přiložen k hraně skla a skla se vzorky byla přemístěna na 50 μΐ kapku roztoku pro konjugaci azidovaného fluorochromu s EdU/EdC/EU/EC v přítomnosti měďných iontů (klik reakce). Pufr obsahoval 100 mmol.l1 Tris-Cl, pH 7,4, 10 mmol.11 askorbát sodný, 4 mmol.11 síran měďnatý a 20 pmol.l1 tetrametylrodaminazid (TAMRA-azid). Vzorky byly inkubovány na této směsi 20 minut.
O) Skla se vzorky pak byla přenesena na kapku Ix PBS. Po 5 minutách byla skla se vzorky přenesena na novou kapku Ix PBS stejného složení. Tento krok byl ještě třikrát opakován. Pak byla skla přenesena na kapku 100 mmol.l1 Tris-Cl a 100 mmol.l1 NaCl, pH 7,5. Tento krok byl ještě dvakrát opakován, následně byla skla přenesena na kapku 10 pmol.l1 DAPI v 100 mmol.l1 Tris-Cl a 100 mmol.l1 NaCl, pH 7,5 a inkubována na kapce po dobu 20 minut. Následně byla skla
-4CZ 309218 B6 se vzorky přenesena na kapku destilované vody. Po 5 minutách byla skla se vzorky přenesena na novou kapku destilované vody.
P) Nakonec byla voda ze skel odsáta pomocí filtračního papíru, skla byla položena na nový filtrační papír vzorky nahoru a usušena.
Q) Po usušení byla skla položena na kapičky (3 μΐ) připraveného montovacího média na podložním skle (roztok: 90% glycerol, 50 mM Tris, pH 8, 2,5% l,4-diazabicyclo[2.2.2]oktan). Vzorky směřovaly do kapičky roztoku. Jemným tlakem pomocí pinzety na horní stranu skel se vzorky došlo k roztažení roztoku média po celé ploše skel. Následně byly okraje skel zalakovány pomocí rychleschnoucího laku. Signál byl detekován pomocí fluorescenčního mikroskopu. Příklad stanovení deaminázové aktivity u HeLa buněk pomocí EdC a EdU je na obr. 3 a 4.
Příklad 2
Stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty ve tkáních.
Následující postup popisuje způsob stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v jatemí tkáni třídenních potkanů. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.
A) Třídenní potkaní samci byli usmrceni dekapitací a následně jim byla vyjmuta játra. Játra byla nakrájena na malé kousky (3 mm - nej delší rozměr) a vložena do Petriho misek s HeLa buňkami inkubovanými jeden den v růstovém médiu DMEM s L-glutaminem (Dulbeccova modifikace Eaglova média, Gibco), 10% (obj./obj.) fetálním telecím sérem (PAA Laboratories), 50 pg/ml gentamicinem a 3,7 g/lNaHCCb. Do média s kousky jater byl přidán 0,00064; 0,0032; 0,016; 0,08; 0,4; 2; 10; 20; 50; 250; 1250 nebo 6250 pmol1 EdC nebo EdU nebo BrdC nebo BrdU nebo CldC nebo CldU nebo IdC nebo IdU nebo EC nebo EU nebo BrC nebo BrU nebo FC nebo FU nebo C1C nebo C1U nebo IC nebo IU na dobu 30, 60, 90, 120, 150, 180, nebo 210 minut nebo 4 nebo 6 nebo 24 hodin.
B) Následně bylo růstové médium odstraněno a kousky jater byly převrstveny pufrem (lx PBS, složení viz část Použité roztoky a chemikálie, přidány byly přibližně 1 až 2 ml pufiru na 4 cm2 plochy). Po 5 minutách byl pufir odstraněn a nahrazen stejným množstvím Ix PBS stejného složení. Tento krok byl ještě jednou opakován.
C) Kousek jater byl dán mezi dvě kruhová skla o průměru 12 mm potažené 1% (hmotnost/obj.) želatinou a tkáň byla roztažena po povrchu skel pomocí jemného tlaku pinzetou na sklo. Skla byla oddělena a obě byla dána do Petriho misky s lx PBS a to tak, že skla směrovala vzorky tkání nahoru do roztoku.
D) V dalších krocích bylo postupováno dle kroků uvedených v příkladu 1 (D-Q).
Příklad 3
Stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v buněčné suspenzi.
Následující postup popisuje způsob stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v suspenzních HeLa S3 buňkách. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.
A) Lidské HeLa S3 buňky (dále jen vzorky) byly pěstovány v kultivačních lahvích (objem lahví byl 50 ml), které byly třepány, v růstovém médiu S-MEM (modifikace Eaglova minimálního média pro suspenzní buňky, Sigma) s 3% (hmotnost/obj.) L-glutaminem, 5% (obj./obj.) fetálním telecím
-5CZ 309218 B6 sérem (PAA Laboratories) a 50 pg/ml gentamicinem v atmosféře s 5% (obj./obj.) CO2 při 37 °C. Buněčná suspenze obsahovala přibližně 5 až 8 x 105 buněk na 1 mililitr.
B) Druhý den po pasáži byl do růstového média přidán 0,00064; 0,0032; 0,016; 0,08; 0,4; 2; 10; 20; 50; 250; 1250 nebo 6250 pmol.l1 EdC nebo EdU nebo BrdC nebo BrdU nebo CldC nebo CldU nebo IdC nebo IdU nebo EC nebo EU nebo BrC nebo BrU nebo FC nebo FU nebo C1C nebo C1U nebo IC nebo IU na dobu 30, 60, 90, 120, 150, 180, nebo 210 minut nebo 4 nebo 6 nebo 24 hodin.
C) Následně byla suspenze buněk přenesena do 15 mililitrové centrifugační zkumavky a vzorky byly odstřeďovány 10 minut při 300g. Supernatant byl odstraněn (ve zkumavce bylo ponecháno 200 μΐ média) a ke vzorkům bylo přidáno nové médium (10 ml). Vzorky byly rozsuspendovány a následně opět odstřeďovány 10 minut při 300g. Supernatant byl odstraněn (ve zkumavce bylo ponecháno 200 μΐ média) a k peletu vzorků byl přidán 1 ml nového média. Pelet vzorků byl rozsuspendován.
D) 50 μΐ kapka suspenze buněk byla přenesena na kruhová skla o průměru 12 mm potažené vrstvou poly-L-lysinu (způsob přípravy těchto skel je popsán v části Použité roztoky a chemikálie). Po 2 minutách byl přebytek média odsát pomocí filtračního papíru tak, že byl filtrační papír jemně přiložen k hraně skla. Skla byla položena do 2% (hmotnost/obj.) roztoku formaldehydu v Petriho misce a vzorky byly fixovány 10 minut. Skla byla umístěna do Petriho misek tak, že směřovala vzorky nahoru do roztoku.
E) V dalších krocích bylo postupováno podle bodů E-Q příkladu 1.
Navržený postup detekce deaminázové aktivity lze použít i při práci se suspenzí buněk po celou dobu jejich zpracování například pro FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting). V tomto případě bylo postupováno dle bodu A-C příkladu 3, následně podle bodu D-0 příkladu 1 s tím, že při odstraňování veškerých roztoků, přidávání nových a při promývání byly buňky odstřeďovány 10 minut při 300g, následně byl odstraněn supernatant (ve zkumavce bylo ponecháno 200 μΐ roztoku), k buňkám byl přidán nový roztok dle rozpisu v příkladu 1 (2 ml), buňky vněm byly rozsuspendovány a inkubovány po doby uvedené v jednotlivých bodech příkladu 1. V bodu O nebyly buňky promyty vodou, namísto toho byly převrstveny 2 ml 1 x PBS. Pro měření intenzity fluorescence byl použit průtokový cytometr.
Příklad 4
Stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v přisedlých buňkách za použití kultivačních destiček.
Postup je stejný jako v případě přisedlých buněk (příklad 1, body A-O) s následujícími rozdíly:
1) Veškeré inkubace byly provedeny v jamkách 96-jamkových destiček.
2) Při inkubacích s protilátkami nebo s azido fluorofory bylo použito 50 μΐ roztoku.
3)V případě promývání bylo použito 100 μΐ roztoku.
4) Nakonci protokolu (bod O příkladu 1) se z jednotlivých vzorků odstraní voda anahradí se 100 μΐ směsi 90% glycerol, 50 mM Tris, pH 8, 2,5% l,4-diazabicyclo[2.2.2]oktan.
5) Pro měření fluorescence bylo kromě mikroskopického měření použito i měření pomocí čtečky destiček.
-6CZ 309218 B6
Příklad 5
Stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v buňkách pěstovaných v suspenzi za použití kultivačních destiček.
Postup je stejný jako v případě suspenzních buněk zpracovaných pro FACS (příklad 3) s následujícími rozdíly:
1) Lidské HeLa S3 buňky (dále jen vzorky) byly pěstovány v jamkách plastových kultivačních destiček (200 μΐ buněčné suspenze v jedné jamce) v růstovém médiu S-MEM (modifikace Eaglova minimálního média pro suspenzní buňky) s 3% (hmotnost/obj.) L-glutaminem, 5% (obj./obj.) fetálním telecím sérem (PAA Laboratories) a 50 pg/ml gentamicinem v atmosféře s 5% (obj./obj.) CO2 při 37 °C. Buněčná suspenze obsahovala přibližně 1 x 105 buněk na 1 mililitr.
2) Vzorky byly odstřeďovány 5 minut při 300g.
3) Veškeré inkubace byly provedeny v jamkách.
4) Při promývání bylo použito 200 ul roztoku.
5) Při inkubacích s protilátkami nebo s azido molekulami bylo použito 50 μΐ roztoku.
6) Měření bylo provedeno v roztoku 90% glycerolu, 50 mM Tris, pH 8, 2,5% 1,4diazabicyclo [2.2.2] oktanu.
7) Pro měření fluorescence bylo použito měření pomocí čtečky destiček.
Příklad 6
Stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v buňkách ovlivněných inhibitory cytidinové deaminázy (CDA, EC 3.5.4.5) diazepinon ribonukleosidem nebo 3,4,5,6-tetrahydrouridinem nebo zebularinem v buňkách a tkáních.
Postup byl stejný jako v příkladech 1 až 5 s následujícími změnami:
Buňky byly inkubovány současně s nukleosidy a 10 pmol.l1 diazepinon ribonukleosidem nebo 3,4,5,6 tetrahydrouridinem nebo zebularinem (Cancer Chemoth and Pharm, 30, 7-11). Příklad stanovení deaminázové aktivity je na obr. 5.
Příklad 7
Stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v buňkách a tkáních ovlivněných siRNA cílené proti CDA nebo dCMP deamináze.
Postup byl stejný jako v příkladech 1, 3, 4 a 5 s následujícími změnami:
1) Buňky byly pěstovány v případě přisedlých buněk buď na 12 mm kruhových sklech v Petriho miskách nebo v 96-jamkových destičkách, v případě suspenzních buněk v kultivačních zkumavkách o objemu 15 ml nebo v 96-jamkových destičkách. Ve všech případech byly pěstovány v kompletním kultivačním médiu bez antibiotik.
2) Buňky byly nasazeny tak, aby buňky druhý den dosáhli 60 až 80% hustoty. 100% hustota znamená u přisedlých buněk, že plocha byla zcela zaplněna buňkami.
-7 CZ 309218 B6
3) Druhý den po pasáži bylo kultivační médium odstraněno. V případě buněčných suspenzí pěstovaných v kultivačních zkumavkách byly vzorky nejdříve odstřeďovány 10 minut při 300g a následně byl supernatant odstraněn. Podobně v dalších krocích byly před výměnou roztoku nejdříve suspenzní kultury odstředěny.
4) Vzorky byly následně promyty transfekčním médiem (zakoupeno společně s roztoky siRNA).
V případě kultivací na sklech v Petriho miskách bylo použito 1 až 2 ml transfekčního média na 4 cm2 plochy. V případě buněčných suspenzí pěstovaných v kultivačních zkumavkách byly po odstranění supematantu přidány ke vzorkům 2 ml transfekčního média a vzorky byly rozsuspendovány. V případě kultivací v 96-jamkových kultivačních destičkách bylo použito 100 μΐ transfekčního média na 1 jamku.
5) Transfekční médium bylo odstraněno.
Ke vzorkům byl následně přidán siRNA roztok (složení viz část Použité roztoky a chemikálie). V případě kultivací na sklech v Petriho miskách byl přidán 1,5 ml siRNA roztoku na 8 cm2 plochy. V případě buněčných suspenzí pěstovaných v kultivačních zkumavkách bylo po odstranění supematantu přidáno ke vzorkům 2,5 ml siRNA roztoku a vzorky byly rozsuspendovány. V případě kultivací v 96-jamkových kultivačních destičkách bylo použito 100 μΐ siRNA roztoku na 1 jamku. Buňky byly inkubovány 7 hodin v CO2 inkubátoru při 37 °C a 5% CO2.
6) Ke vzorkům bylo následně přidáno kultivační médium, které obsahovalo dvojnásobné množství fetálního telecího séra a antibiotik, než se používá v médiu při běžných kultivacích buněk. V případě kultivací na sklech v Petriho miskách bylo přidáno 1,5 ml média na 8 cm2 plochy. V případě buněčných suspenzí pěstovaných v kultivačních zkumavkách bylo přidáno 2,5 ml média. V případě kultivací v 96-jamkových kultivačních destičkách bylo přidáno 100 μΐ média na 1 jamku. siRNA roztok nebyl odstraněn. Buňky byly inkubovány 24 hodin v CO2 inkubátoru při 37 °C a 5% CO2.
7) Následně bylo médium odstraněno.
8) Ke vzorkům bylo přidáno běžné kultivační médium. V případě kultivací na sklech v Petriho miskách bylo přidáno 2 ml média na 8 cm2 plochy. V případě buněčných suspenzí pěstovaných v kultivačních zkumavkách byly po odstranění supematantu přidány ke vzorkům 3 ml média a vzorky byly rozsuspendovány. V případě kultivací v 96-jamkových kultivačních destičkách bylo použito 100 μΐ média na 1 jamku. Buňky byly inkubovány 24 hodin v CO2 inkubátoru při 37 °C a 5% CO2.
9) Následně byl do růstového média přidán alternativně 0,00064; 0,0032; 0,016; 0,08; 0,4; 2; 10; 50; 250; 1250 nebo 6250 pmol1 EdC nebo EdU nebo BrdC nebo BrdU nebo CldC nebo CldU nebo IdC nebo IdU nebo EC nebo EU nebo BrC nebo BrU nebo C1C nebo C1U nebo IC nebo IU nebo FC nebo FU na dobu 20 minut nebo 2 hodiny nebo 6 hodin nebo 24 hodin.
Následně bylo postupováno dle příkladů 1,3,4 nebo 5. Příklad stanovení deaminázové aktivity po ovlivnění siRNA cílené proti CD A nebo dCMP deamináze je na obr. 6.
Použité roztoky a chemikálie:
1. Fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (PBS) lOx PBS (desetinásobně koncentrovaný roztok PBS):
1,4 mol.I1 NaCl mmol.l1 KC1 mmol.l1 Na2HPO4 mmol.l1 KH2PO4
-8CZ 309218 B6
Uvedené složky byly rozpuštěny v destilované vodě a pH bylo upraveno do rozmezí 7,3 až 7,4 Ix PBS (fosfátem pufrovaný fyziologický roztok v obvyklé koncentraci)
2. Příprava polylysinových skel pro ukotvení suspenzních buněk
Kruhová skla s průměrem 12 mm byla vložena do 50 ml kádinky s20 ml 96% (obj./obj.) etanolu. Po 10 minutách byla pomocí pinzety přenesena do Petriho misky vyložené filtračním papírem a usušena. Skla byla následně na dobu 1 minuty ponořena do 0,01% (hmotnost/obj.) roztoku polyL-lysinu v DMEM, následně byla ponořena na 30 vteřin do lx PBS a pak ještě jednou na 30 vteřin do nového Ix PBS. Tento krok byl ještě 3x opakován. Nakonec byla skla položena na filtrační papír a usušena.
3. siRNA roztok - složení
Roztok A: 0,5 mM siRNA namířená proti CDA nebo dCMP deamináze a transfekční médium (Santa Cruz Biotechnologies).
Roztok B: transfekční roztok byl naředěn transfekčním médiem dle instrukcí dodavatele (Santa Cruz Biotechnologies).
Připravené dva roztoky se smíchají tak, že se roztok A přidá k roztoku B, promíchá jemným pipetováním a nechá se inkubovat při pokojové teplotě 15 až 45 minut. Následně se k roztoku přidají 4 díly transfekčního média, celý roztok se zamíchá a přidá ke vzorkům.
Průmyslová využitelnost
Způsob stanovení aktivit enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v buňkách a tkáních lze využít, např. (i) při vyhledávání nových inhibitorů deamináz nebo (ii) testování různých buněčných linií z hlediska deaminázových aktivit nebo (iii) v diagnostice spojené s aplikací léčiv na bázi cytosinových analogů nukleosidů nebo (iv) při testování účinku DNA nebo RNA oligonukleotidů (antisensní oligonukleotidy a siRNA) cílených na inhibici exprese uvedených deamináz.
Claims (1)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob stanovení deaminázové aktivity enzymů cytidin deaminázy a deoxycytidin 5'monofosfát deaminázy, přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v tkáních nebo5 buňkách in vitro, vyznačující se tím, že se vzorek buněk nebo tkání inkubuje s 5-etynyl-2'deoxycytidinem, přičemž 5-etynyl-2'-deoxy cytidin se v přítomnosti enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty následně ve vzorku přemění na deaminovaný produkt 5 etynyl-2'-deoxyuridin, a tento 5-etynyl-2'-deoxyuridin se následně detekuje v DNA a stanoví se množství inkorporovaného 5-etynyl-2'-deoxyuridinu v DNA pomocí klik reakce.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2014579A CZ309218B6 (cs) | 2014-08-26 | 2014-08-26 | Způsob stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v buňkách a tkáních |
| PCT/CZ2015/000097 WO2016029889A1 (en) | 2014-08-26 | 2015-08-25 | Method of determining the activity of enzymes converting cytosine derivatives to uracil derivatives in cells, tissues and organisms |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2014579A CZ309218B6 (cs) | 2014-08-26 | 2014-08-26 | Způsob stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v buňkách a tkáních |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2014579A3 CZ2014579A3 (cs) | 2016-03-09 |
| CZ309218B6 true CZ309218B6 (cs) | 2022-06-01 |
Family
ID=54249266
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2014579A CZ309218B6 (cs) | 2014-08-26 | 2014-08-26 | Způsob stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v buňkách a tkáních |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ309218B6 (cs) |
| WO (1) | WO2016029889A1 (cs) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109207535B (zh) * | 2018-09-20 | 2021-06-25 | 新乡拓新药业股份有限公司 | 利用铜绿假单胞菌合成尿嘧啶的方法 |
| GB2580963B (en) | 2019-02-01 | 2021-03-31 | Hemispherian As | Cancer therapies |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1867714A1 (en) * | 2005-04-08 | 2007-12-19 | Anaeropharma Science Inc. | 5-fluorouracil-resistant bacteria and method for production thereof |
| US20110020799A1 (en) * | 2009-07-23 | 2011-01-27 | Nagasaki University | Screening method for damaged DNA repairing substance |
| CZ303252B6 (cs) * | 2011-06-01 | 2012-06-20 | Ústav organické chemie a biochemie Akademie ved Ceské republiky, v. v. i. | Zpusob eliminace antigenních vlastností 5-ethynyl-2´-deoxyuridinu a 5-ethynyluridinu pri detekci nukleových kyselin |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003072757A2 (en) * | 2002-02-28 | 2003-09-04 | Biota, Inc. | Nucleotide mimics and their prodrugs |
| WO2009021551A1 (en) * | 2007-08-13 | 2009-02-19 | Universite De La Mediterranee | A method for assessing the risk of toxicity in a chemotherapy |
-
2014
- 2014-08-26 CZ CZ2014579A patent/CZ309218B6/cs not_active IP Right Cessation
-
2015
- 2015-08-25 WO PCT/CZ2015/000097 patent/WO2016029889A1/en active Application Filing
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1867714A1 (en) * | 2005-04-08 | 2007-12-19 | Anaeropharma Science Inc. | 5-fluorouracil-resistant bacteria and method for production thereof |
| US20110020799A1 (en) * | 2009-07-23 | 2011-01-27 | Nagasaki University | Screening method for damaged DNA repairing substance |
| CZ303252B6 (cs) * | 2011-06-01 | 2012-06-20 | Ústav organické chemie a biochemie Akademie ved Ceské republiky, v. v. i. | Zpusob eliminace antigenních vlastností 5-ethynyl-2´-deoxyuridinu a 5-ethynyluridinu pri detekci nukleových kyselin |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| Chabner B.A.et al.: Purification and properties of cytidine deaminase from normal and leukemic granulocytes. 1974 J. Clin. Invest. 53, 922-31 * |
| COOPER G M; GREER S: "THE EFFECT OF INHIBITION OF CYTIDINE DEAMINASE BY TETRA HYDRO URIDINE ON THE UTILIZATION OF DEOXY CYTIDINE AND 5 BROMODEOXY CYTIDINE FOR DNA SYNTHESIS", MOLECULAR PHARMACOLOGY, AMERICAN SOCIETY FOR PHARMACOLOGY AND EXPERIMENTAL THERAPEUTICS, US, vol. 9, no. 6, 1 January 1973 (1973-01-01), US , pages 698 - 703, XP009187586, ISSN: 0026-895X * |
| Liboska R. et al.: Most Anti-BrdU Antibodies React with 2′-Deoxy-5-Ethynyluridine - The Method for the Effective Suppression of This Cross-Reactivity 2012 PLOS ONE 7, e51679, http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0051679 * |
| Rodolphe Suspe`ne, et al: Efficient Deamination of 5-Methylcytidine and 5-Substituted Cytidine Residues in DNA by Human APOBEC3A Cytidine Deaminase, 2013, PLOS ONE 8, e63461, http://www.plosone.org/article/fetchObject.action?uri=info:doi/10.1371/journal.pone.0063461&representation=PDF * |
| SANTOS, O. ; PEREZ, L.M. ; BRIGGLE, T.V. ; BOOTHMAN, D.A. ; GREER, S.B.: "Radiation, pool size and incorporation studies in mice with 5-chloro-22-deoxycytidine", INTERNATIONAL JOURNAL OF RADIATION: ONCOLOGY BIOLOGY PHYSICS., PERGAMON PRESS., USA, vol. 19, no. 2, 1 August 1990 (1990-08-01), USA , pages 357 - 365, XP026847456, ISSN: 0360-3016 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ2014579A3 (cs) | 2016-03-09 |
| WO2016029889A1 (en) | 2016-03-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111154837B (zh) | 一种全转录组范围单碱基分辨率检测rna n6-甲基腺嘌呤修饰的方法 | |
| Costa et al. | On the role of subtype selective adenosine receptor agonists during proliferation and osteogenic differentiation of human primary bone marrow stromal cells | |
| US7572585B2 (en) | Enzymatic labeling of RNA | |
| Starr et al. | Methylated ribonucleic acids. | |
| CN111448311A (zh) | 基于多效应子crispr的诊断系统 | |
| Muthmann et al. | Chemo‐enzymatic treatment of RNA to facilitate analyses | |
| US7541144B2 (en) | RNA labeling method | |
| EP4060047A1 (en) | Method for detecting or quantifying oligonucleotide | |
| CZ309218B6 (cs) | Způsob stanovení aktivity enzymů přeměňujících cytosinové deriváty na uracilové deriváty v buňkách a tkáních | |
| US20230054714A1 (en) | Nucleic acid modification and identification method | |
| Smellie | The biosynthesis of ribonucleic acid in animal systems | |
| CZ2017233A3 (cs) | Způsob stanovení množství DNA ve vzorcích a jeho využití pro stanovení množství buněk | |
| CN103740842B (zh) | 高灵敏度小rna定量检测方法及试剂盒 | |
| WO2015197655A1 (en) | Methods and products from the reaction of tetrazines with nucleic acid polymers bearing ethenyl aromatic groups | |
| EP3186387B1 (en) | Method of determining the activity of enzymes converting cytosine derivatives to uracil derivatives in cells, tissues and organisms | |
| Nosov et al. | Extra perspectives of 5-ethynyl-2′-deoxyuridine click reaction with fluorochrome azides to study cell cycle and deoxyribonucleoside metabolism | |
| CZ303252B6 (cs) | Zpusob eliminace antigenních vlastností 5-ethynyl-2´-deoxyuridinu a 5-ethynyluridinu pri detekci nukleových kyselin | |
| Sakai et al. | Simultaneous isolation of cell-nuclei, plastid-nuclei and mitochondrial-nuclei from cultured tobacco cells; comparative analysis of their transcriptional activities in vitro | |
| EP3187584B1 (en) | Method for non-enzymatic combination of nucleic acid chains | |
| CZ28964U1 (cs) | Sada pro zpřístupnění specifických pyrimidinových nukleosidů ve struktuře dvouřetězcové DNA pro reakci s protilátkami, které s těmito nukleosidy reagují | |
| Laloue | Functions of cytokinins | |
| Svetlova et al. | Differential incorporation of halogenated deoxyuridines during UV-induced DNA repair synthesis in human cells | |
| JP2008528047A (ja) | 競合的ｈｉｖのｒｔインヒビターのスクリーニング法 | |
| Jeske et al. | Cell‐free deadenylation assays with Drosophila embryo extracts | |
| He et al. | Cellular Metabolic Labeling of Nucleic Acids and Its Applications |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20230826 |