CZ303251B6 - Zpusob znacení dvouretezcových molekul DNA - Google Patents
Zpusob znacení dvouretezcových molekul DNA Download PDFInfo
- Publication number
- CZ303251B6 CZ303251B6 CZ20110309A CZ2011309A CZ303251B6 CZ 303251 B6 CZ303251 B6 CZ 303251B6 CZ 20110309 A CZ20110309 A CZ 20110309A CZ 2011309 A CZ2011309 A CZ 2011309A CZ 303251 B6 CZ303251 B6 CZ 303251B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- dna
- double
- exonuclease
- stranded dna
- samples
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 108
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 49
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 49
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 48
- JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N Cu2+ Chemical compound [Cu+2] JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 41
- 229910001431 copper ion Inorganic materials 0.000 claims abstract description 41
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 claims abstract description 39
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 39
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 33
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims abstract description 32
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 24
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 22
- 239000010949 copper Substances 0.000 claims abstract description 18
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims abstract description 18
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 18
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 claims abstract description 14
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 102100033215 DNA nucleotidylexotransferase Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 claims abstract description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 39
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- -1 oxygen ions Chemical class 0.000 claims description 16
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 16
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 13
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 claims description 11
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 claims description 11
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 11
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 10
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims description 9
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 claims description 6
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000010378 sodium ascorbate Nutrition 0.000 claims description 6
- PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M sodium ascorbate Substances [Na+].OC[C@@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M 0.000 claims description 6
- 229960005055 sodium ascorbate Drugs 0.000 claims description 6
- PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M sodium-L-ascorbate Chemical compound [Na+].OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M 0.000 claims description 6
- QZTKDVCDBIDYMD-UHFFFAOYSA-N 2,2'-[(2-amino-2-oxoethyl)imino]diacetic acid Chemical compound NC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O QZTKDVCDBIDYMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 5
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 claims description 5
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 claims description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 4
- OWXMKDGYPWMGEB-UHFFFAOYSA-N HEPPS Chemical compound OCCN1CCN(CCCS(O)(=O)=O)CC1 OWXMKDGYPWMGEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N diisopropylamine Chemical compound CC(C)NC(C)C UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108010008488 Glycylglycine Proteins 0.000 claims description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N L-citrulline Chemical compound NC(=O)NCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 3
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- YNLCVAQJIKOXER-UHFFFAOYSA-N N-[tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCCS(O)(=O)=O YNLCVAQJIKOXER-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N Ndelta-carbamoyl-DL-ornithine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=O RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 3
- AUVWJHIXZKLKSM-RRKCRQDMSA-N [[(2r,3s,5r)-5-(5-chloro-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Cl)=C1 AUVWJHIXZKLKSM-RRKCRQDMSA-N 0.000 claims description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 3
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 claims description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 3
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960002173 citrulline Drugs 0.000 claims description 3
- 235000013477 citrulline Nutrition 0.000 claims description 3
- HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N diethylamine Chemical compound CCNCC HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 claims description 3
- BEBCJVAWIBVWNZ-UHFFFAOYSA-N glycinamide Chemical compound NCC(N)=O BEBCJVAWIBVWNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229940043257 glycylglycine Drugs 0.000 claims description 3
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 claims description 3
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 claims description 3
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 claims description 3
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 claims description 3
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 claims description 3
- PGAVKCOVUIYSFO-UHFFFAOYSA-N uridine-triphosphate Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 PGAVKCOVUIYSFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- HSXUNHYXJWDLDK-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1-sulfonic acid Chemical compound CC(O)CS(O)(=O)=O HSXUNHYXJWDLDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108050009160 DNA polymerase 1 Proteins 0.000 claims description 2
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N Piperazine Chemical compound C1CNCCN1 GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ZWDWDTXYXXJLJB-RRKCRQDMSA-N [hydroxy-[[(2r,3s,5r)-3-hydroxy-5-(5-iodo-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy]phosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 ZWDWDTXYXXJLJB-RRKCRQDMSA-N 0.000 claims description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N coumarin Chemical compound C1=CC=C2OC(=O)C=CC2=C1 ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims 1
- 125000000954 2-hydroxyethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 claims 1
- GAWIXWVDTYZWAW-UHFFFAOYSA-N C[CH]O Chemical group C[CH]O GAWIXWVDTYZWAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 claims 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims 1
- 229960000956 coumarin Drugs 0.000 claims 1
- 235000001671 coumarin Nutrition 0.000 claims 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 claims 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 claims 1
- 229940043279 diisopropylamine Drugs 0.000 claims 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims 1
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 claims 1
- 229960003080 taurine Drugs 0.000 claims 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 25
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 abstract description 7
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 abstract description 4
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 abstract 4
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 101
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 59
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 58
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 43
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 42
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 42
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 42
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 34
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 32
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 23
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 10
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 9
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Inorganic materials [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 8
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 8
- HJKYXKSLRZKNSI-UHFFFAOYSA-I pentapotassium;hydrogen sulfate;oxido sulfate;sulfuric acid Chemical compound [K+].[K+].[K+].[K+].[K+].OS([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.OS(=O)(=O)O[O-].OS(=O)(=O)O[O-] HJKYXKSLRZKNSI-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 8
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 7
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 7
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 7
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012425 OXONE® Substances 0.000 description 5
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 5
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L copper(II) chloride Chemical compound Cl[Cu]Cl ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- XTVVROIMIGLXTD-UHFFFAOYSA-N copper(II) nitrate Chemical compound [Cu+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O XTVVROIMIGLXTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- OPQARKPSCNTWTJ-UHFFFAOYSA-L copper(ii) acetate Chemical compound [Cu+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O OPQARKPSCNTWTJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 4
- 108010036364 Deoxyribonuclease IV (Phage T4-Induced) Proteins 0.000 description 4
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 4
- BLQCQNFLEGAHPA-RRKCRQDMSA-N [[(2r,3s,5r)-5-(5-bromo-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 BLQCQNFLEGAHPA-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 4
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 4
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 4
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 4
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 4
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 4
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 229960001922 sodium perborate Drugs 0.000 description 4
- YKLJGMBLPUQQOI-UHFFFAOYSA-M sodium;oxidooxy(oxo)borane Chemical compound [Na+].[O-]OB=O YKLJGMBLPUQQOI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NUFBIAUZAMHTSP-UHFFFAOYSA-N 3-(n-morpholino)-2-hydroxypropanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CC(O)CN1CCOCC1 NUFBIAUZAMHTSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCS(O)(=O)=O JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- ODWXUNBKCRECNW-UHFFFAOYSA-M bromocopper(1+) Chemical compound Br[Cu+] ODWXUNBKCRECNW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 description 3
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- 239000008098 formaldehyde solution Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 3
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 3
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- GXVUZYLYWKWJIM-UHFFFAOYSA-N 2-(2-aminoethoxy)ethanamine Chemical compound NCCOCCN GXVUZYLYWKWJIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JABNPSKWVNCGMX-UHFFFAOYSA-N 2-(4-ethoxyphenyl)-6-[6-(4-methylpiperazin-1-yl)-1h-benzimidazol-2-yl]-1h-benzimidazole;trihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.Cl.C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 JABNPSKWVNCGMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LVQFQZZGTZFUNF-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-3-[4-(2-hydroxy-3-sulfonatopropyl)piperazine-1,4-diium-1-yl]propane-1-sulfonate Chemical compound OS(=O)(=O)CC(O)CN1CCN(CC(O)CS(O)(=O)=O)CC1 LVQFQZZGTZFUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N BROMODEOXYURIDINE Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 241001104043 Syringa Species 0.000 description 2
- 235000004338 Syringa vulgaris Nutrition 0.000 description 2
- 101000954509 Trichosurus vulpecula Very early lactation protein Proteins 0.000 description 2
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000034953 Twin anemia-polycythemia sequence Diseases 0.000 description 2
- UDMHUFFLTBRLKE-DJLDLDEBSA-N [[(2r,3s,5r)-5-(5-ethynyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C#C)=C1 UDMHUFFLTBRLKE-DJLDLDEBSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L cobalt dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Co+2] GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 150000001879 copper Chemical class 0.000 description 2
- QTMDXZNDVAMKGV-UHFFFAOYSA-L copper(ii) bromide Chemical compound [Cu+2].[Br-].[Br-] QTMDXZNDVAMKGV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N dTMP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 2
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 108010055863 gene b exonuclease Proteins 0.000 description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 2
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 2
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 2
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- HJRIWDYVYNNCFY-UHFFFAOYSA-M potassium;dimethylarsinate Chemical compound [K+].C[As](C)([O-])=O HJRIWDYVYNNCFY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002718 pyrimidine nucleoside Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 229960004418 trolamine Drugs 0.000 description 2
- LEVVMZZBTOYKSC-UHFFFAOYSA-N 1-amino-4-hydroxybutane-2-sulfonic acid Chemical compound NCC(S(O)(=O)=O)CCO LEVVMZZBTOYKSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRGUSFBJBOKSML-UHFFFAOYSA-N 3',5'-di-O-methyltricetin Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC(C=2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C=2)=C1 HRGUSFBJBOKSML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BLFRQYKZFKYQLO-UHFFFAOYSA-N 4-aminobutan-1-ol Chemical class NCCCCO BLFRQYKZFKYQLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004203 4-hydroxyphenyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000143060 Americamysis bahia Species 0.000 description 1
- 102100025926 Calmodulin-3 Human genes 0.000 description 1
- 239000005749 Copper compound Substances 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-QWWZWVQMSA-N D-threitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 231100001074 DNA strand break Toxicity 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N Ethane Chemical compound CC OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 101000933777 Homo sapiens Calmodulin-3 Proteins 0.000 description 1
- 101000731000 Homo sapiens Membrane-associated progesterone receptor component 1 Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102100032399 Membrane-associated progesterone receptor component 1 Human genes 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- IDDMFNIRSJVBHE-UHFFFAOYSA-N Piscigenin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C=2C(C3=C(O)C=C(O)C=C3OC=2)=O)=C1 IDDMFNIRSJVBHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- MZZINWWGSYUHGU-UHFFFAOYSA-J ToTo-1 Chemical compound [I-].[I-].[I-].[I-].C12=CC=CC=C2C(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=CC=[N+]1CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C1=CC=CC=C11)=CC=C1C=C1N(C)C2=CC=CC=C2S1 MZZINWWGSYUHGU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 1
- PGAVKCOVUIYSFO-XVFCMESISA-N UTP Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 PGAVKCOVUIYSFO-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- GRRMZXFOOGQMFA-UHFFFAOYSA-J YoYo-1 Chemical compound [I-].[I-].[I-].[I-].C12=CC=CC=C2C(C=C2N(C3=CC=CC=C3O2)C)=CC=[N+]1CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C1=CC=CC=C11)=CC=C1C=C1N(C)C2=CC=CC=C2O1 GRRMZXFOOGQMFA-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- MJOQJPYNENPSSS-XQHKEYJVSA-N [(3r,4s,5r,6s)-4,5,6-triacetyloxyoxan-3-yl] acetate Chemical compound CC(=O)O[C@@H]1CO[C@@H](OC(C)=O)[C@H](OC(C)=O)[C@H]1OC(C)=O MJOQJPYNENPSSS-XQHKEYJVSA-N 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 230000001745 anti-biotin effect Effects 0.000 description 1
- VJLOFJZWUDZJBX-UHFFFAOYSA-N bis(2-hydroxyethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].OCC[NH2+]CCO VJLOFJZWUDZJBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 229950004398 broxuridine Drugs 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 1
- 150000001880 copper compounds Chemical group 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M ethanesulfonate Chemical compound CCS([O-])(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- JKXCZYCVHPKTPK-UHFFFAOYSA-N hydrate;trihydrochloride Chemical compound O.Cl.Cl.Cl JKXCZYCVHPKTPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000011034 membrane dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000012120 mounting media Substances 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N pibenzimol Chemical compound C1CN(C)CCN1C1=CC=C(N=C(N2)C=3C=C4NC(=NC4=CC=3)C=3C=CC(O)=CC=3)C2=C1 INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- USHAGKDGDHPEEY-UHFFFAOYSA-L potassium persulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O USHAGKDGDHPEEY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- JZLLRGCJEXHGNF-UHFFFAOYSA-M potassium;2-aminoacetic acid;hydroxide Chemical compound [OH-].[K+].NCC(O)=O JZLLRGCJEXHGNF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- BMCJATLPEJCACU-UHFFFAOYSA-N tricin Natural products COc1cc(OC)c(O)c(c1)C2=CC(=O)c3c(O)cc(O)cc3O2 BMCJATLPEJCACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- OIWCYIUQAVBPGV-DAQGAKHBSA-N {1-O-hexadecanoyl-2-O-[(Z)-octadec-9-enoyl]-sn-glycero-3-phospho}serine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC OIWCYIUQAVBPGV-DAQGAKHBSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Popsaný zpusob dovoluje efektivne znacit dvouretezcovou DNA. Zpusob spocívá v inkubaci dvouretezcové DNA v prítomnosti jednomocných iontu medi a kyslíku a/nebo aktivních okyslicovadel. Zdrojem techto iontu mohou být vodné roztoky obsahující ionty medi, nebo se muže jednat o jednomocnou med, která byla na DNA navázána. Pusobením kyslíku a jednomocných iontu medi vznikají v retezcích DNA prerušení, která slouží v následujícím kroku inkubace se znacenými nukleotidy a enzymy s DNA polymerázovou aktivitou jako pocátecní místa pro syntézu retezcu DNA pomocí techto enzymu. Použity mohou být bud terminální deoxynukleotidylfransferáza, nebo DNA polymerázy, syntetizující nový retezec podle predlohového retezce. Pokud tyto DNA polymerázy nemají exonukleázovou aktivitu a/nebo vytesnovací aktivitu, je z hlediska zabezpecení dostatecne silného signálu nutné, ješte pred inkubací s DNA polymerázou, vzorky obsahující dvouretezcovou DNA inkubovat s enzymy, které exonukleázovou a/nebo fosfatázovou aktivitu mají. Inkubacní krok s temito enzymy je možné využít i za úcelem zvýšení signálu v prípade, že se použijí následne DNA polymerázy s exonukleázovou a/nebo vytesnovací aktivitou. V prípade terminální deoxynukleotidyltransferázy je výhodné provést pred inkubací s tímto enzymem inkubaci v prítomnosti enzymu s 3´-5´ exonukleázovou a/nebo fosfatázovou aktivitou. Pro odstranení nežádoucích produktu medi je možné volitelne použít vymývací látky.
Description
Způsob značení dvou řetězcových molekul DNA
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu značení dvouřetězcové DNA. V přihlášce je popsán způsob, který dovoluje rychle a efektivně inkorporovat značené nukleotidy do dvouřetězeových moiekui DNA.
io Dosavadní stav techniky
Pro značení dvouřetězcové DNA se nej častěji používají látky, které se váží na DNA a současně slouží jako fluorescenční značky. Jedná se např. o DAP1 (4\6'-dianiidino-2-fenyÍindoí dihydrochlorid), Hoechst 33258 (hydrát trihydrochloridu 2'-(4-hydroxyfěnyl) 5 (4 methvl-l piperazít5 nvl)-2r,5'-bi-l H-benzimidazolu) nebo Hoechst 33342 (trihydrochlorid 2'-(4-ethoxyfenyl)~5(4-methyl-l-piperazinyl)-2,5'-bi-l H-benzimidazolu). Vazba těchto látek na DNA se pravděpodobně uskutečňuje v oblasti malého žlábku dvouřetězcové DNA. Další skupina látek se interkaluje do struktury DNA. Jedná se např. o YOYO-1 (3-[dimethyl-[3-[4-[(E)-(3-methyl-],3henzoxazo 1-2-y lidenjmethy ljquinolin-l -ium-1 —yl] propy l]-azaniumyl]propyl-dimethy l-[3-[420 [(Z)-(3-methyi-l ,3-benzoxazol-2-yliden)methyl]quinolin-l-ium-l-yl]propyl]-azaniumtetrajodid), nebo TOTO-1 (1-1 '-[l,3-propandiylbis[(dmethylimino)-3,l-propandiyl]bis[4-[(3methyl-2(3H)-benzothiazolyliden)methyin-tetrajodid). Většina z těchto látek vykazuje afinitu i k RNA. To ovšem představuje zásadní problém při detekci dvouřetězcové DNA v buňkách, které pravidelně obsahují vysoká množství různých molekul RNA. Navíc řada těchto sond vykazuje sekvenční specifitu. Příkladem je DAPI, která se selektivně váže na sekvence obsahující páry AT. To vede k dalším obtížím při určení skutečného obsahu DNA v určité oblasti.
Podstata vynálezu
Předkládaná přihláška vynálezu popisuje postup dovolující efektivní a vysoce selektivní značení dvouřetězcové DNA pomocí inkorporace modifikovaných nukleotidů. V řetězci DNA jsou nejprve vytvořena přerušení pomocí jednomocné mědi za přítomnosti kyslíku. Následně jsou tato místa detekována pomocí enzymatické reakce. Typicky jsou vzorky obsahující DNA inkubovány s jednomocnými ionty mědi. Měďné ionty je možné v roztoku generovat in šitu redukcí měďnatých iontů, např. pomocí askorbátu sodného, hydrazinu nebo tris(2-karboxyethyl)fosfinu (TCEP) (Pharm Res, 25, 2216 až 2230). Jinou možností je přímá aplikace měďných solí, např. měďných halogenidů (Pharm Res, 25, 2216 až 2230). Další možnosti je použití komplexů obsahujících jednomocnou měď, jako je hexafluor fosforečnan (tetraacetonitrilo)měďný ([Cu(CH3CN)4]PFó), nebo tetrafluorboritan (tetraacetonitrilo)měďný ([Cu(CHsCN)4]BF6). Vzorky obsahující DNA jsou pak inkubovány v těchto roztocích. Alternativní možností je inkubace vzorků nejprve v roztoku obsahujícím měďnaté ionty, kdy se využije schopnosti měďnatých iontů vázat se na DNA a následně se vzorky buď okamžitě, nebo až po promytí inkubují v roztoku, kteiý redukuje měďnaté ionty na měďnaté ionty.
Podle tohoto vynálezu je výhodné vzorky v průběhu inkubace s měďným i ionty, nebo okamžitě po redukci měďnatých iontů vázaných na DNA na měďné ionty, a to ještě v redukčním roztoku, provzdusnovat, např. klasickou laboratorní třepačkou nebo probubláváním směsi vzduchem, případně kyslíkem a tím zabezpečit přístup kyslíku. Provzdušňování je možné provést také násled50 ně, v promývacích roztocích, tedy až po inkubaci s měďnými ionty nebo po přeměně měďnatých iontů vázaných na DNA na ionty měďné. Namísto provzdušňování lze použít i aktivní okysličovadla. Příkladem je použití monopersíranu draselného [2KHSO5.KHSO4.K2SO4], peroxidu vodíku [H2O2], dihydrogenperoxofosforečnanu draselného [KH2PO5j, nebo peroxoboritanu sodného [Na2(B2Ó4(OH)4).6H2O].
- 1 CZ 303251 B6
Podle tohoto vynálezu je množství přerušení v DNA přímo úměrné koncentraci měďných iontů a času inkubace DNA s měďnýmí ionty, ať již v přítomnosti nebo nepřítomnosti, respektive za velice omezené přítomnosti kyslíku při probubtávání směsi např. dusíkem nebo při přípravě roztoků jednomocné mědi v převařené vodě a následné inkubaci v uzavřených nádobách, V případě inkubace v nepřítomnosti kyslíku dochází se zvyšujícími se koncentracemi a s narůstajícím časem inkubace k vyššímu navázání měďných iontů na DNA. Pro štěpení je však nutná následující inkubace v roztocích obsahující kyslík a/nebo v roztocích obsahující aktivní okysličovadla. Tyto dva kroky: 1) navázání měďných iontů v nepřítomnosti nebo za omezené přítomnosti kyslíku a 2) štěpení v roztocích obsahující kyslík, je možné mnohonásobně opakovat ke zvýšení poctu io přerušení. Pokud jsou vzorky inkubovány v přítomnosti kyslíku, dochází k postupné přeměně měďných iontů zpět na měďnaté ionty. Proto je nutné po určité době, po níž dojde k úplné přeměně měďných iontů na měďnaté ionty, zpravidla též doprovázené změnou zabarvení roztoku, tyto roztoky pro další zvýšení množství přerušení nahradit novými roztoky měďných iontů. Takto lze postupovat až do dosažení dostatečného počtu přerušení, Z praktického hlediska je vhodné používat koncentrace měďných iontů v řádech mmol.l 1 a časů v řádech desítek minut. Nicméně podle získaných výsledků k vytvoření přerušení dochází již za použití daleko nižších koncentrací v řádech pmol.l 1 a časů v řádech několika sekund.
Provedené experimenty navíc ukázaly, že v průběhu inkubace s s jednomocnými ionty vznikají
2o nežádoucí máto rozpustné produkty mědi, které brání správné funkci enzymů. Nebylo testováno, zda se jedná o sloučeniny mědi nebo o kovovou měď, avšak v závislosti na jejich množství je nutné jejich odstranění. Takové odstranění je zpravidla nezbytné v případech delších inkubací DNA v prostředí s ionty jednomocné mědi. Především se jedná o případy, kdy se vzorky v průběhu inkubace zabarví. K odstranění těchto produktů slouží inkubace vzorků v roztocích následujících látek (dále jen vymývací látky): kyseliny ethylenglykol-bis(2-aminoethyléter)Ν.Ν,Ν',Ν'-tetraoctové (EGTA), kyseliny ethylendiaminotetraoctové (EDTA), kyseliny 4-(2hydroxyethyl)-l-piperazinethansulfonové (Hepes), kyseliny 3--[4-(2-hydroxyethyl)-l-piperazinyljpropansulfonové (Hepps), kyseliny N-[tris(hydroxymethyl)methyl]-3~aminopropansulfonové (TAPS), M/V-bis(2-hydroxyethyl)glycinu (Bicin), /V-[tris(hydroxymethyl)methyl]glycinu (Tricin), kyseliny 2-[(2-hydroxy-l,l-bis(hydroxymethyl)ethyl)amino]ethansulfonové (TES), kyseliny A-(karbamoylmethyl)iminodioctové (ADA), kyseliny /V-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonové (BES), 2,2-bÍs(hydroxymethyl)-2,2',2”-nitrilotriethanolu (BIS-TRIS), tris(hydroxymethyl)aminomethanu (Tris), glycyl-glycinu, kyseliny β-hydroxy-^l-morfolinpropansulfonové (MOPSO), kyseliny piperazin-N,N'-bis(2-hydroxypropansulfonové) (POPSO), glycinamidu, D- a L-a-aminokyselin (např. glycinu, alaninu, šeřinu, prolinu, lysinu, argininu, asparaginu, glutaminu, kyseliny asparagové, kyseliny glutamové, citrulinu, threoninu), amoniaku, ethanolaminu, diethanolaminu, triethanolaminu, diethylamínu, triethylaminu, diisopropylethylaminu, diisopropylaminu, v principu je možné využít jakýkoli primární nebo sekundární amin. K odstranění těchto produktů dochází i v roztocích obsahujících aktivní kysličovadla jako mono40 persíran draselný, peroxid vodíku, dihydrogen-peroxofosforečnan draselný, nebo peroxoboritan sodný. Je možné rovněž použít kombinace těchto látek.
Jelikož nežádoucí produkty jsou relativně silně zabarvené, jejich odstranění doprovází odbarvení vzorku. Pro úspěšnou interakci sledovaného nukleosidu s protilátkou je nutné preparáty odbarvit úplně. Také při tomto krokuje výhodné preparáty obsahující DNA provzdušňovat. Se zvyšující se efektivitou provzdušňování dochází k rychlejšímu odstranění nežádoucích produktů. Rovněž zvyšující se koncentrace vymývacích látek vede k rychlejšímu vymytí.
Kromě přítomnosti vymývacích látek nebyly zjištěny další specifické požadavky na složení pou50 žívaných roztoků, a to ať již obsahujících jednomocné ionty mědi a/nebo vymývací látky. Podle získaných výsledků je tudíž možné v případě potřeby použít např. přídavky solí typu chloridu sodného nebo draselného. Získané výsledky rovněž ukázaly, že s výjimkou EDTA a EGTA je možné vymývací látky nebo jejich kombinace přidat přímo do reakční směsi. Tím se docílí zásadního snížení tvorby nežádoucích nerozpustných produktů a výrazného zkrácení doby pro-2 CZ 303251 B6 mývání v roztocích výše uvedených vymývacích látek, nebo úplného odstranění nutnosti promýván í.
Po první fázi, která byla popsána v předchozí části, následuje inkubace vzorku se značenými nukleotidy a enzymy, které využívají přerušení v řetězcích DNA pro syntézu nového řetězce DNA. Navrženy a experimentálně prověřeny byly dva základní případy. V prvním z nich jsou tato přerušení využita pro syntézu nového řetězce pomocí terminální deoxy nukleotidy Itransferázy. Tento enzym nepotřebuje předlohový řetězec a syntetizuje jed nořetězcovou DNA, Ve druhem případě jsou k syntéze použity DNA polymerázy, které vyžadují pro svoji funkci přítomnost io předlohového řetězce, příkladem je DNA polymeráza 1 zE. coli. Pro vysokou míru značení je vyžadována 3'-5' exonukleázová aktivita a současně buď1 5exonukleázová aktivita, nebo aktivita vytěsňující řetězec vázaný k předlohovému řetězci, která dovoluje uvolnění předlohového řetězce. Důvodem zvýšení míry značení v přítomnosti enzymů s 3'-5' exonukleázovou aktivitou je pravděpodobně fakt, že značná část řetězců DNA neobsahovala v místě přerušení na svém 3' konci hydroxylovou skupinu. Z provedených experimentů vyplynulo, že DNA po působení jednomocných iontů mědi v přítomnosti kyslíku obsahuje dostatečné množství přerušení a zároveň uchovává strukturu předlohového řetězce pro efektivní značení DNA. Současně bylo prokázáno, že není nutné používat DNA polymerázy s 5'-3' exonukleázovou aktivitou nebo silnou vytčsňovací aktivitou v případě, že inkubaci s těmito enzymy předchází inkubace s enzymy, které vykazují 5 -3’ nebo 3—5' exonukleázovou aktivitu. Tyto enzymy je možné použít i pro zvýšení signálu, tedy v případech, kdy DNA polymerázy exonukleázovou nebo vytěsňovací aktivitu vykazují.
Rovněž není nutné používat polymerázy’ s 3' 5 exonukleázovou aktivitou v případě, že inkubaci s těmito enzymy předchází inkubace s těmi enzymy, které vykazují 3 -5' exonukleázovou a/nebo fosfatázovou aktivitu. Toto pozorování ukázalo na vysokou četnost přítomnosti fosfátové skupiny na 3' konci DNA v přerušeních. Vzhledem k absenci 3'-5' exonukleázové aktivity u terminální deoxynukleotidyltransferázy jsme rovněž v tomto případě pozorovali významné zvýšení míry signálu po použiti enzymů s 3 -5' exonukleázovou aktivitu a/nebo s fosfatázovou aktivitou.
Popsaný přístup je možné použít např. při detekcích dvouřetězcové DNA a doplňuje přístupy založené na použití značení DNA pomocí látek, které se váží na její strukturu. Významnou výhodu zde předloženého přístupu představuje, v případě inkubace v roztocích s jednomocnými ionty mědi a použití terminální doexy nukleotidy Itransferázy, nezávislost na sekvenci DNA. V případě použití DNA polymeráz lze sekvenční závislost řídit díky možnosti použití různých značených nukleotidů. Dále pak, nezávisle na provedení, výhody popsaného přístupu spočívají v naprosté selektivitě pro dvouřetězcovou DNA, v necitlivosti vůči přítomnosti RNA, v možnosti dalšího zvýšení signálu pomocí několikanásobného značení nebo pomocí detekčního kroku zahrnujícího enzymatické postupy, např. postupy založené na peroxidáze nebo alkalické fosfatáze, v možnosti vizualizace DNA bez potřeby fluorescenčního mikroskopu, v možnosti využít nepřeberné množství jinak značených nukleotidů a protilátek konjugovaných s různými fluorochromy a za použití enzymů, které syntetizují DNA podle předlohy, rovněž ve faktu, že jsou vytvořeny předpoklady pro studium vazby fluorescenčně značených proteinů k této DNA,
Novost přístupu spočívá v použití iontů mědi pro vytvoření zlomů ve dvouřetězcové DNA a následného enzymatického značení DNA. Doposud není známo, že by tento přístup byl někdy použit pro značení dvouřetězcové DNA.
Využití uvedeného přístupu je možné zejména v komerční výrobě sad dodávaných pro základní výzkum.
Současně s touto přihláškou je podávána i druhá přihláška, která popisuje způsob zpřístupnění pyrimidinových nukleosidů v dvouřetězcové DNA. Ačkoli i druhá přihláška vychází z působení jednomocné mědi na DNA, výsledkem je zpřístupnění pyrimidinových nukleosidů, které je
-3CZ 303251 B6 možné následně detekovat. To je zásadní rozdíl oproti této přihlášce, kde je popsán způsob detekce celkové dvou řetězcové DNA.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. I. Detekce DNA v HeLa buňkách pomocí popsaného přístupu.
A: značení dvouřetězcové DNA pomocí Klenowova fragmentu a exonukleázy IH. B; značení dvouřetězcové DNA pomocí DNA polymerázy I
Příklady provedení vynálezu
| Seznam použitých zkratek | |
| HeLa | buněčná linie lidských epiteliálních buněk |
| DMEM | Dulbeccova modifikace Eaglova média |
| PBS | fosfátem pufrovaný fyziologický roztok |
| S-MEM | modifikace Eaglova minimálního média pro suspenzní buňky |
| BrdUTP | 5-bromo-2 '-deoxyuridin 5 '-trifosfát |
| CldUTP | 5-chloro-2 '-deoxyuridin 5 '-trifosfát |
| IdUTP | 5-jodo-2'-deoxyuridin 5'-trifosfát |
| Biotin-dUTP | biotin-16-2'-deoxyuridin 5'-trifosfát |
| Digoxigenin-dUTP | digoxigenin-11-2'-deoxy uridin 5-trifosfát |
| TCEP | tris(2-karboxyethyl)fosfin |
| EGTA | kyselina ethylenglykol-bis(2-aminoethyléter)-N,N,N ',N '-tetraoctová |
| EDTA | kyselina ethylendiaminotetraoctová |
| BrdU | 5-bromo-2 '-deoxyuridin |
| Biotin | biotin-16-2 '-deoxy uridin |
| Digoxigenin | digoxigenin-1 l-2'-deoxyuridin |
| BSA | hovězí sérový albumin |
Příklad 1
Značení dvouřetězcové DNA pomocí měďných iontů v buňkách přisedlých na podložních sklíčkách.
Následující postup popisuje znační dvouřetězcové DNA v HeLa buňkách přisedlých na podložních sklíčkách. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, při40 čemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.
A) Lidské HeLa buňky (dále jen vzorky) byly pěstovány v Petriho miskách na kruhových sklech o průměru 13 mm v růstovém médiu DMEM s L-glutaminem (Dulbeccova modifikace Eaglova média, Gibco) s 10% (obj./obj.) fetálním telecím sérem (PAA Laboratories), 1% (obj./obj.) gentamicinem a 0,85 g/1 NaHCO3 v atmosféře s 5% (obj./obj.) CO2 při 37 °C.
B) Druhý den po pasáži bylo růstové médium odstraněno a nahrazeno pufřem (lx PBS, složení viz část Použité roztoky a chemikálie, přidány byly přibližně 1 až 2 ml pufru na 4 cm2 plochy).
C) Pufr byl odstraněn a vzorky byly 10 minut fixovány 2% (hmotnost/obj.) roztokem formaldehydu v lx PBS (pH 7,4; 1 až 2 ml fixačního roztoku na 4 cm2 plochy). Alternativně byly vzorky
-4CZ 303251 B6 fixovány methanolem a následně acetonem. V tomto případě byla skla se vzorky nejdříve inkubována 10 minut v methanolu při teplotě -20 °C (přibližně 1 až 2 ml methanolu na 4 em“ plochy) a následně ponořena na 30 sekund do kádinky s 50 ml acetonu o teplotě místnosti. Skla se vzorky pak byla usušena a po usušení položena do Petriho misky s Ix PBS. V případě použití methanolu a acetonu následoval krok F).
D) Roztok formaldehydu byl odstraněn a vzorky byly převrstveny Ix PBS (přibližně 1 až 2 ml Ix PBS na 4 cm2 plochy). Po 5 minutách byl pufr odstraněn a nahrazen novým o stejném složení. Tento krok byl opakován ještě jednou.
io
E) Následně by! pufr odstraněn. Vzorky byly 10 minut permeabilizovány 0.2% (obj./obj.) roztokem Tritonu X-iOO v Ix PBS (přibližně 1 až 2 ml permeabilizačního roztoku na 4 cm2 plochy). Po odstranění permeabilizačního roztoku byly vzorky převrstveny lx PBS (přibližně 1 až 2 ml 1 x PBS na 4 cm plochy).
F) Po 5 minutách byl roztok lx PBS odstraněn a nahrazen stejným množstvím téhož roztoku. Tento krok byl opakován ještě jednou.
G) Z misek byl odstraněn roztok lx PBS, vzorky byly převrstveny stejným množstvím 0,5x
PBS, po 1 minutě byl roztok 0,5x PBS odstraněn a nahrazen stejným množstvím 0,25x PBS.
Nakonec byl uvedený roztok ze vzorků odstraněn a vzorky byly převrstveny destilovanou vodou (přibližně 1 až 2 ml vody na 4 cm2 plochy). Po 5 minutách byla voda odstraněna a nahrazena stejným množstvím destilované vody. Pak byla skla se vzorky vyjmuta pomocí pinzety z Petriho misky a přebytek vody byl odsát pomoci filtračního papíru tak, že skla se vzorky byla položena stranou bez vzorků na filtrační papír. Poté byla skla se vzorky položena na kapky destilované vody na parafilmu (50 μΙ/kapka). Skla směrovala se vzorky směrem dolů do kapky vody.
H) Následně byla skla uchopena do pinzety' a přebytek vody ze vzorků odsát pomocí filtračního papíru tak, že filtrační papír byl jemně přiložen k hraně skla a skla se vzorky byla přemístěny do inkubačního roztoku (IR) v Petriho misce (1,5 ml roztoku na 9 cm2 plochy, složení inkubačního roztoku je uvedeno v částí Použité roztoky a chemikálie). Alternativně byla Petriho miska zcela zaplněná IR. Tím došlo k minimalizaci provzdušnování směsi. V dalším případě byla plná Petriho miska po uzavření omotána po obvodu parafilmem, nebo byla směs po celou dobu inkubace probublávána dusíkem. Skla byla umístěna do Petriho misek tak, že směřovala vzorky nahoru do roztoku.
I) Petriho misky se vzorky na sklech byly přemístěny na třepačku (PS-M3D, Grant-Bio) a zde byly alternativně inkubovány po dobu 20 sekund, 10, 30 minut a 3 hodiny při rychlosti 30 otáček/minutu. Některé vzorky, které byly inkubovány v 1,5 ml IR, byly alternativně namísto míchání na třepačce probublávány vzduchem nebo kyslíkem.
J) a) Inkubační roztok byl odstraněn a vzorky byly převrstveny destilovanou vodou (přibližně 1 až 2 ml vody na 4 cm2 plochy). Po jedné minutě byla voda odstraněna a nahrazena stejným množstvím vody. Tento krok byl opakován ještě jednou. Pak následoval bod K.
b) Alternativně byl inkubační roztok odstraněn a ke vzorkům byla přidána destilovaná voda (přibližně l až 2 ml vody na 4 cm2 plochy). Po jedné minutě byla voda odstraněna a nahrazena stejným množstvím vody. Tento krok byl opakován ještě jednou. Následně byla voda odstraněna a k buňkám byl na 1, 5, 30 nebo 120 minut přidán množství alternativně 0,001, 4 nebo lOOmmol.f1 roztok stabilizovaného monopersíranu draselného (2KHSO5.KHSO4.K2SO4). V některých případech byl namísto stabilizovaného roztoku monopersíranu draselného použitý vodný roztok peroxidu vodíku (H2O2), nebo dihydrogenperoxofosforečnanu draselného (KH2PO5), nebo peroxoboritanu sodného [Na2(B2O4(OH)4).6H2O] (ve všech případech přibližně 1 až 2 ml roztoku na 4 cm2 kultivační plochy). Jejich koncentrace byly stejné jako koncentrace u monopersíranu draselného, Uve-5 CZ 303251 B6 děné roztoky byly připraveny těsně před přidáním k buňkám. Po inkubaci byly tyto roztoky odstraněny a bylo pokračováno podle bodu J a).
K) Voda byla odstraněna a nahrazena vymývacím roztokem (1,5 ml roztoku na 9 cm2 plochy). Složení vymývacího roztoku je uvedeno v částí Použité roztoky a chemikálie. Petriho misky se vzorky na sklech byly přemístěny na třepačku a zde byly inkubovány buď do odbarvení, minimálně ale 10 minut, nebo v případě nezabarvených skel alternativně 1 minutu, 30 nebo 60 minut.
V průběhu vymývání byla skla vždy po 5 minutách nadzvednuta pinzetou tak, aby došlo k vymytí prostoru pod skly a rovněž spodní strany skla. V případě skel inkubovaných 1 minutu ve vymývacím roztoku, byla skla nadzvednuta po 30 sekundách. Skla byla v průběhu nadzvedávání zcela ponořena v roztoku. Alternativně byl vymývací roztok probubláván vzduchem nebo kyslíkem.
V některých případech byl vymývací krok zcela vynechán a bylo pokračováno bodem M.
L) Vymývací roztok byl odstraněn a vzorky byly převrstveny destilovanou vodou (přibližně 1 až 2 ml vody na 4 cm plochy). Po 2 minutách byla voda odstraněna a nahrazena stejným množstvím vody. Tento krok byl opakován ještě jednou.
M) Skla se vzorky byla vyjmuta pomocí pinzety z Petriho misky a přebytek vody byl odsát pomocí filtračního papíru tak, že skla byla položena stranou bez vzorků na filtrační papír. Skla se vzorky pak byla položena na kapky destilované vody na parafilmu (50 μΙ/kapka). Skla směřovala vrstvou se vzorky směrem dolů do kapky vody. Následně byla provedena reakce s enzymem s exonukleázovou a/nebo fosfatázovou aktivitou podle bodu a) a b). Alternativně byly vzorky hned inkubovány s enzymy, které byly použity pro značení dvouřetězcové DNA. V tomto případě následoval bod N.
a) Vzorky byly inkubovány 30 minut s enzymem s exonukleázovou a/nebo fosfatázovou aktivitou (použité enzymy a složení roztoku je uvedeno v části Použité roztoky a chemikálie) na kapkách o velikosti 20 μΙ. V některých případech byly vzorky inkubovány nejprve s enzymem s 3 -5' exonukleázovou a/nebo fosfatázovou aktivitou a následně s enzymem s 5-3' exonukleázovou aktivitou nebo naopak. V tomto případě byla skla se vzorky mezi inkubacemi promyta 2 minuty na kapce destilované vody (50 μΙ). Tento krok byl ještě třikrát opakován.
b) Skla se vzorky byla přenesena na kapku destilované vody (50 μΙ). Po 2 minutách byla skla se vzorky přenesena na novou kapku destilované vody. Tento krok byl ještě třikrát opakován. Pak následoval krok N.
N) Vzorky byly inkubovány alternativně 1, 10, 20 nebo 60 minut s terminální deoxynukleotidyltransferázou nebo DNA polymerázami (použité enzymy a složení roztoků je uvedeno v části Použité roztoky a chemikálie) na kapkách o velikosti 20 μί.
O) Skla se vzorky byla přenesena na kapku destilované vody (50 μί). Po 2 minutách byla skla se vzorky přenesena na novou kapku destilované vody. Tento krok byl ještě třikrát opakován.
V případě, že DNA vzorků byla značena nukleotidy konjugovanými s fluorochromem, následoval bod R. V ostatních případech bylo postupováno podle bodu P.
P) a) Skla se vzorky byla přenesena na kapku 0,25x PBS (50 μί), po jedné minutě na stejně velkou kapku 0,5x PBS a následně po jedné minutě na kapku lx PBS.
b) Vzorky značené enzymem ve směsi s BrdUTP byly inkubovány s myší anti bromodeoxyuridinovou protilátkou (Roche Diagnostics, klon BMC 9318, ředění 1:20 v lx PBS), vzorky značené enzymem ve směsi s biotin-dUTP byly inkubovány s králičí anti-biotinovou protilátkou (Enzo Lifesciences, ředění 1:100 v lx PBS) a vzorky značené enzymem ve směsi s digoxigenin-dUTP s myší anti-digoxigeninovou protilátkou (Roche Diagnostics, ředění 1:100 v lxPBS). Inkubace probíhala na kapkách o velikosti 20 μί. Délka inkubace byla 30 minut.
-6CZ 303251 B6
c) Skla se vzorky byla přenesena na kapku lx PBS. Po 5 minutách byla skla se vzorky přenesena na novou kapku 1 x PBS stejného složení. Tento krok byl ještě třikrát opakován.
d) Skla se vzorky byla inkubována 30 minut s kozí anti-myší (vzorky značené BrdU nebo dígoxigeninem) nebo kozí anti—králičí (vzorky značené biotinem) protilátkou konjugovanou s tiuorochromem Cy3 (Jackson Immunoresearch Laboratories, ředění u obou protilátek bylo 1:100 v lx PBS) na kapkách o velikosti 20 μΙ.
Q) Skla se vzorky byla přenesena na kapku lx PBS (50 μΙ). Po 5 minutách byla skla s buňkami přenesena na novou kapku lx PBS stejného složení. Tento krok byl ještě třikrát opakován. Následně byla skla se vzorky přenesena na kapku destilované vody (50 μί). Po 5 minutách byla skla se vzorky přenesena na novou kapku destilované vody. Tento krok byl ještě třikrát opakován.
R) Nakonec byla voda ze skel odsáta pomocí filtračního papíru, skla byla položena na nový filtrační papír vzorky nahoru a usušena.
S) Po usušení byla skla položena na kapičky (2 μί) připraveného montovacího média na podložním skle (roztok Mowiol - Polyvinylalkohol 20 až 98, Fluka). Vzorky směřovaly do kapičky roztoku. Jemným tlakem pomocí pinzety na horní stranu skel se vzorky došlo k roztažení roztoku Mowíolu po celé ploše skel. Tento krok sloužil k zalití vzorků a získání trvalého preparátu. Signál byl detekován pomocí fluorescenčního mikroskopu.
Příklad 2
Značení dvouřetězcové DNA pomocí měďných iontů v tkáních.
Následující postup popisuje příklad značení dvouřetězcové DNA vjaterní tkání třítýdenních potkanů. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.
A) Třítýdenní potkaní samci byli usmrceni dekapitací a následně jim byla odebrána játra. Játra byla nakrájena na malé kousky (3 mm - nejdelší rozměr) a položena do Petriho misek s PBS (lx PBS, složení viz část Použití roztoky a chemikálie, přibližně 1 až 2 ml pufru na 4 cm plochy). Po 1 minutě byl pufr odstraněn a nahrazen stejným množstvím lx PBS stejného složení. Tento krok byl ještě jednou opakován.
B) Kousek jater byl dán mezí dvě kruhová skla o průměru 13 mm potažené 1% (hmotnost/objem) želatinou a tkáň byla roztažena po povrchu skel pomocí jemného tlaku pinzetou na sklo. Skla byla oddělena a obě byla dána do Petriho misky s lx PBS a to tak, že skla směřovala vzorky tkání nahoru do roztoku.
C) V dalších krocích bylo postupováno dle kroků uvedených v Příkladu 1 (C-S).
Příklad 3
Značení dvouřetězcové DNA pomocí měďných iontů v suspenzních buňkách.
Následující postup popisuje příklad značení dvouřetězcové DNA v suspenzních HeLa S3 buňkách. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.
A) Lidské HeLa S3 buňky (dále jen vzorky) byly pěstovány v kultivačních lahvích (objem lahví byl 50 ml), které byly třepány, v růstovém médiu S-MEM (modifikace Eaglova minimálního
-7CZ 303251 B6 média pro suspenzní buňky, Sigma) s 2 mmol.l 1 L-glutaminem a s 10% (obj./obj.) fetálním telecím sérem (PAA Laboratories), 1% (obj./obj.) gentamicinem a 0,22% (hmotnost/obj.) NaHCO3 v atmosféře s 5% (obj./obj.) CO2 při 37 °C. Buněčná suspenze obsahovala přibližně 5 až 8 x IO5 buněk na 1 mililitr.
B) Druhý den po pasáží byla suspenze buněk přenesena do 1 Smililitrové centrifugaČní zkumavky a vzorky byly odstřeďovány 1 minutu při 180 g. Supematant byl odstraněn (ve zkumavce bylo ponecháno 200 μΙ média) a ke vzorkům bylo přidáno nové médium (10 ml). Vzorky byly resuspendovány a následně opět odstřeďovány 1 minutu při 180 g. Supematant byl odstraněn (ve zkulo mavce bylo ponecháno 200 μΙ média) a k peletu vzorků byl přidán 1 ml nového média. Pelet vzorků byl resuspendován.
C) 50μ1 kapka suspenze buněk byla přenesena na kruhová skla o průměru 13 mm potažené vrstvou poly-L-lysinu (způsob přípravy těchto skel je popsán v části Použité roztoky a chemiká15 lie). Po 2 minutách byl přebytek média odsát pomocí filtračního papíru tak, že byl filtrační papír jemně přiložen k hraně skla. Skla byla položena do 2% (hmotnost/obj.) roztoku formaldehydu v Petriho misce a vzorky byly fixovány 10 minut. Skla byla umístěna do Petriho misek tak, že směřovala vzorky nahoru do roztoku.
zo D) V dalších krocích se postupovalo podle bodů D-S příkladu 1.
Námi navržený postup značení dvouřetězcové DNA lze použít i pro práci se suspenzí buněk po celou dobu jejich zpracování například pro FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting). V tomto případě se postupovalo dle bodů A a B příkladu 3 a následně podle bodů C-Q příkladu 1 s tím, že při odstraňování veškerých roztoků, přidávání nových roztoků a pri promývání byly buňky odstřeďovány l minutu při 180 g, následně byl odstraněn supematant (ve zkumavce bylo ponecháno 200 μΐ roztoku), k buňkám byl přidán nový roztok (2 ml), respektive pufr, buňky v něm byly res uspěn dovány a inkubovány po doby uvedené v jednotlivých bodech příkladu 1. V průběhu těchto kroků byly buňky třepány na třepačce (Vortex Wizard, VELP Scientifica, 300 w otáček za minutu, rpm). V případě inkubace v IR byly alternativně zkumavky zcela naplněny IR a uzavřeny nebo probublávány dusíkem po celou dobu inkubace v IR. V bodě Q podle příkladu 1 nebyly vzorky inkubovány ve vodě, ale ponechány v lx PBS.
Příklad 4
Značení dvouřetězcové DNA pomocí měďných iontů, které byly vytvořeny redukcí z měďnatých iontů navázaných na DNA v buňkách přisedlých na podložních sklíčkách, v tkáních a suspenzních buňkách.
Následující postup popisuje příklad značení dvouřetězcové DNA v buňkách přisedlých na podložních sklíčkách, vtkaních a suspenzních buňkách. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.
Postup byl shodný s protokoly z příkladu 1, 2 a 3 s následujícími změnami:
Namísto inkubace v IR byly vzorky inkubovány alternativně v 0,001, 4 nebo 40 mmol.r1 vodném roztoku síranu měďnatého (5 minut; 1,5 ml roztoku na 9 cm2 plochy). Namísto roztoku síranu měďnatého byly alternativně použity roztoky chloridu měďnatého nebo dusičnanu měďnatého nebo octanu měďnatého nebo bromidu měďnatého ve stejných koncentracích jako u síranu měď50 natého. Uvedené roztoky byly poté odstraněny a vzorky byly inkubovány 5 minut v destilované vodě (přibližně 1 až 2 ml vody na 4 cm2 plochy). Následně byla voda odstraněna a nahrazena stejným množstvím vody. Tento krok byl opakován ještě jednou. Potom byla voda odstraněna a ke vzorkům byl přidán alternativně 0,001, 10 nebo 100 mmol.r1 roztok askorbátu sodného v destilované vodě (1,5 ml roztoku na 9 cm2 plochy). Namísto roztoku askorbátu sodného byl attema-8CZ 303251 B6 tivně použit i 0,001, 20 nebo 200 mmol.l 1 roztok hydrazinu nebo 0,001, 8 nebo 80 mmol.l 1 roztok TCEP. Vzorky byly v roztoku inkubovány 5 minut.
Alternativně nebyly vzorky promývány destilovanou vodou, ale byly okamžitě po odstranění síranu měďnatého nebo chloridu měďnatého nebo dusičnanu měďnatého nebo octanu měďnatého nebo bromidu měďnatého inkubovány v uvedených roztocích askorbátu sodného nebo hydrazinu nebo TCEP
Při inkubaci vzorků ve vymývacím roztoku činila doba inkubace na třepačce 10 minut, přičemž po 5 minutách byla skla nadzvednuta pinzetou tak, aby došlo k vymytí prostoru pod skly. Skla byla v průběhu nadzvedávání zcela ponořena v roztoku.
Pro práci se suspenzí buněk zpracovávaných např. pro FACS postupovalo stejně, jako je popsáno v posledním odstavci příkladu 3 se změnami popsanými v tomto příkladu.
Příklad 5
Značení dvouřetězcové DNA pomocí měďných iontů v purifikované DNA.
Následující postup popisuje příklad značení plazmidu pEXP5-NT/CALM3 (Invitrogen, 3195 párů bází, bp, dále jen plazmid). Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.
A) 4 μΐ (600 mg) plazmidu bylo přidáno k 36 μΙ IR v mikrozkumavce, vzorek byt umístěn na třepačku a tam byl inkubován po dobu 5 minut (Vortex Wizard, VELP Scientifica, 300 rpm). Složení IR je uvedeno v části Použité roztoky a chemikálie.
B) Následně byly ke vzorku přidány 2 μΐ 0,5 mokl 1 EGTA a vzorek byl promícháván asi 3 sekundy na laboratorní třepačce (GVLab, Gilson).
C) Vzorek byl okamžitě přenesen do dialyzační komůrky s 10 kDa MWCO celulózovou membránou (Fast Dialyser PY8 74-0415 a PY8 7421-RC1K, Harvard Apparatus). Vzorky byly míchány na magnetické míchačce a dialyzovány proti 4 litrům vymývacího roztoku po dobu 6 hodin a následně přes noc proti 4 litrům lx koncentrovanému pufru pro DNA polymerázu I při 4 °C (složení vymývacího roztoku a lOx koncentrovaného pufru pro DNA polymerázu je uvedeno v části Použité roztoky a chemikálie). Alternativně byly vzorky dialyzovány pouze proti lx koncentrovanému pufru pro DNA polymerázu I.
D) 18,45 μΐ vzorku bylo umístěno do mikrozkumavky. Následně k němu bylo přidáno 0,4 μΐ (4U, definice jednotky viz bod 11 část Použité roztoky a chemikálie) roztoku DNA polymerázy I (složení roztoku viz Použité roztoky a chemikálie), 1 μΐ směsi dATP, dGTP, dCTP (zásobní roztok byl 1 mmoLT1) a 0,25 μΐ 1 mmol.l1 roztoku modifikovaného nukleotidu. Použité nukleotidy jsou uvedeny v části Použité roztoky a chemikálie, část Roztok DNA polymerázy I z E. coli, bod 7).
E) Vzorek byl promícháván asi 3 sekundy na laboratorní třepačce (GVLab, Gilson) a inkubován pri 15 °C po dobu 90 minut.
F) Ke vzorku byl přidán 1 μΙ 0,5 mol.l-1 EGTA a vzorek byl promícháván asi 3 sekundy na laboratorní třepačce (GVLab, Gilson).
Použité roztoky a chemikálie:
-9CZ 303251 B6
Z. Fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (PBS) lOx PBS (desetinásobné koncentrovaný roztok PBS):
1,4 mol.l 'NaCl
26 mmokl 1 KC1 mrnol.l 1 Na2HPO4 14 mmokl 1 KH2PO4
Uvedené složky byly rozpuštěny v destilované vodě a pH upraveno do rozmezí 7,3 až 7,4 in 1 x PBS (fosfátem pufrovaný fyziologický roztok v obvyklé koncentraci)
0,5x PBS (fosfátem pufrovaný fyziologický roztok v poloviční koncentraci)
0,25x PBS (fosfátem pufrovaný fyziologický roztok ve čtvrtinové koncentraci)
2. IR (inkubační roztoky):
A)
a. Destilovaná voda
b.
| Látka | Askorbát sodný (mmokl1) | Síran mčďnatý Alternativně byly použity následující sloučeniny: chlorid mčďnatý (CuCl2); dusičnan měďnatý (CuNOi); octan měďnatý; bromid měďnatý (CuBr2). (mmokl1) |
| Použitá koncentrace | 10 | 4 |
| Použitá koncentrace | 0,001 | 0,004 |
| Použitá koncentrace | 100 | 40 |
B)
a. Destilovaná voda
b.
| Látka | Hydrazin (mmokl'1) | Síran měďnatý Alternativně byly použity následující sloučeniny: chlorid měďnatý (CuCl2); dusičnan měďnatý (CuNCh); octan měďnatý; bromid měďnatý (CuBr2). (mmokl'1) |
| Použitá koncentrace | 20 | 4 |
| Použitá koncentrace | 0,001 | 0,004 |
| Použitá koncentrace | 200 | 40 |
- 10CZ 303251 B6
C)
a. Destilovaná voda
b.
| Látka | TCEP (mmol.l1) | Síran měďnatý Alternativně byly použity následující sloučeniny: chlorid měďnatý' (CuCh); dusičnan měďnatý (CUNO3); octan měďnatý; bromid měďnatý (CuBty). (mmoi.l·1) |
| Použitá koncentrace | 8 | 4 |
| Použitá koncentrace | 0,001 | 0,004 |
| Použitá koncentrace | 80 | 40 |
D)
a. 10 mmol.l·1 hexafluorfosforečnan (tetraacetonitrilo)měďný ([Cu(CH3CN)4]PF6, navážen těsně před použitím)
b. Převařená destilovaná voda
Alternativně byl použit hexafluorfosforečnan (tetraacetonitrilo) měďný v koncentraci 0.001 mmol.r1 nebo 100 mmol.l·1.
E)
a. 10 mmol.l1 tetrafluoroboritan (tetraacetonitrilo)měďný ([Cu(CH3CN)4]BFó, navážen těsně před použitím)
b. Převařená destilovaná voda
Alternativně byl použit tetrafluoroboritan (tetraacetonitrilo)měďný v koncentraci 0,001 mmol.l·1 nebo 100 mmol.l·1.
Uvedené složky IR byly přidávány v uvedeném pořadí.
Dále byly jako IR použity roztoky uvedené v bodu A), B), C), D) a E) s přídavkem vymývacích látek. Vymývací látka byla v případě A), B) a C) přidána jako druhá v pořadí (přidán a do vody).
V případě D) a E) byla vymývací látka přidána do vody, následně byl tento roztok přidán k výše uvedeným komplexům mědi a tyto v něm byly rozpuštěny. Seznam a koncentrace přidaných vymývacích látek je uvedena v odstavci 4: „Vymývací látky“. Použitá koncentrace je uvedena před závorkou. Pokud není číslo uvedeno, nebyly tyto látky použity jako přídavek do IR.
3. Vymývací roztoky:
a) 100 mmol.l·1 Tris (C4Hi jNO3), pH 7,4 100 mmol.l·1 NaCl
Alternativně byly použity tyto koncentrace: 0,001 mmol.l·1 Tris a 0,001 mmol.l·1 NaCl nebo 1 mol.l·1 Tris a 1 mol.l·1 NaCl.
b) 20 mmol.l·1 EGTA (C14H24N20io), pH 8
Alternativně byly použity tylo koncentrace: 0,001 mmol.l·1 EGTA nebo 0,5 mol.l·1 FGTA.
Tris, popřípadě EGTA byly alternativně nahrazeny dalšími vymývacími látkami. Kompletní seznam látek a jejich koncentrací přidaných do vymývacích roztoků je uveden níže v odstavci 4:
- 11 CZ 303251 B6 „Vymývací látky. Z výsledků je nicméně jasné, že lze použít jakýkoli primární nebo sekundární amin. Koncentrace použitá ve vymývacích roztocích je uvedena v závorce. Hodnota pH promývacích roztoků byla upravena do rozmezí mezi 6,5 a 8 pomocí HCI nebo NaOH. Je možné použít i kombinace vymývacích látek.
4. Vytnývací látky:
Koncentrace, které byly alternativně použity v IR, jsou uvedeny před závorkou, koncentrace, které byly alternativně použity ve vymývacích roztocích, jsou uvedeny v závorce. Pokud údaj před závorkou chybí, nebyla látka v IR použita.
0,001; 4; 100 (0,001; 10; 100) mmol.l 0,001; 4; 100(0,001; 10; 100) mmol.l* 0,001; 4; 100(0,001; 10; 100) mmol.l' 0,001; 4; 100(0,001; 10; 100) mmol.l' 0,001; 4; 100(0,001; 10; 100) mmol.l 0,001; 4; 100(0,001; 10; 100) mmol.l (0,001; 20, 500) mmol.l EGTA kyselina ethylenglykol-bis(2-aminoethyléter)-N,N,Ν',Ν'tetraoctová) (0,001; 20, 500) mmol.l 1 EDTA (kyselina ethylendiaminotetraoctová)
0,001; 200; 1000 (0,001; 200; 1000) mmol.l 1 Hepes (kyselina 4-(2-hydroxyethyl)-l-piperazinethansulfonová)
0,001; 200; 1000 (0,001; 200; 1000) mmol.l 1 Hepes (kyselina 3-[4~(2-hydroxyethyl)-1 -piperazinyl ]propansulfonová)
0,001; 400; 450 (0,001; 200; 1000) mmol.l 1 TAPS (kyselina N-[tris(hydroxymethyl)methyl]-3am i nopropansu Ifonová)
0,001; 1; 1000(0,001; 100; 1000) mmol.!“1 Bicin (7VTN-bis(2-hydroxyethyl)glycin)
0,001; 1; 1000(0,001; 100; 1000) mmol.l 1 Tricin (A-[ tri s( hydroxy methy l)methyl]glycin)
0,001; 200; 350 (0,001; 100; 1000) mmol.l 1 TES (kyselina 2-[(2-hydroxy-1,1-bis(hydroxymethyl)ethyl)amino]ethansulfonová)
0,001; 20; 50 (0,001; 10; 50) mmol.l ’ ADA (kyselina ;V-(karbamoyl methyl)iminodioctová)
0,001; 200; (0,001; 200; 1000) mmol.l-1 BES (kyselina /V-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethansu Ifonová)
0,001; 10; 1000 (0,001; 100; 1000) mmol.l-1 BIS-TR1S (2,2-bis(hydroxymethyl)-2,2',2'-nitrilotriethanol)
0,001; 1; 1000(0,001; 100; 1000) mmol.l-1 Tris (tri s( hydroxy methy l)am i nom ethan)
0,001; 10; 1000 (0,001; 100; 1000) mmol.l-1 glycyl-glycin
0,001; 200; 500 (0,001; 200; 500) mmol.1-1 MOPSO (kyselina β-hydroxy-A-morfolinpropansu Ifonová)
0,001; 100 (0,001; 100) mmol.l-1 POPSO (kyselina piperazin-Ν,Ν '-bis(2-hydroxypropansulfonová)
0,001; 20; 1000 (0,001; 200; 1000) mmol.l-1 glycin
0,001; 10; 1000 (0,001; 100; 1000) mmol.l1 glycinamid
0,001; 20; 1000 (0,001; 20; 1000) mmol.l’1 D- a L-a-aminokyseliny (např. alanin, lysin, arginin)
0,001; 20; 400 (0,001; 20; 400) mmol.l-1 D- a L-a-aminokyseliny (např. šeřin, prolin, asparagin, kyselina asparagová; kyselina glutamová, threonin)
0,001; 20; 150 (0,001; 20; 150) mmol.l-1 D-a L-a-aminokyseliny (např. glutamin, citrulin) 1 amoniak 1 ethanolamin _1 diethanolamin ’’ triethanolamin 1 diethylamin ’ triethylamin
- 12CZ 303251 B6
0,001; 4; 100(0,001; 10; 100) mmol.l 1 diisopropylethylamin
0,001; 4; 100(0,001; 10; 100) mmol.l 1 diisopropy lamin
0,001; 4; 100 (0.001; 10; 100) mmol.l ’ stabilizovaný monopersíran draselný (2KHSO5.KHSO4.K2SO4)
0,001; 4; 100 (0,001; 10; 100) mmol.l1 vodný roztok peroxidu vodíku [H2O2]
0,001; 4; 100(0,001; 10; 100) mmol.l 1 dihydrogenperoxofosforečnan draselný (KH2PO5]
0,001; 4; 100 (0.001; 10; 100) mmol.l ! peroxoboritan sodný [Na2(B2O4(OH)4).6H2O]
5. Enzymy s exonukleázovou a/nebo jbsfatázovou aktivitou
/. Roztok exonukleázy lil\
a) destilovaná voda
b) lx pufr pro exonukleázu III (Fermentas, 2 μΐ lOx koncentrovaného pufru do 20 μΙ směsi), tento pufr je dodáván jako lOx koncentrovaný; složení lOx koncentrovaného pufru je náslei5 dující: 660 mmol.l1 Tris-HCl (pH 8,0 pri 30 °C), 6,6 mmol.l1 MgCl2;
c) I U/μΙ Exonukleáza III (Fermentas), definice jednotky viz bod 11.
II. Roztok exonukleázy λ'.
a) destilovaná voda
b) lx pufr pro exonukleázu λ (Fermentas, 2 μΐ lOx koncentrovaného pufru do 20 μΐ směsi), tento pufr je dodáván jako lOx koncentrovaný; složeni lOx koncentrovaného pufru je následující: 670 mmol.l 1 giycin-KOH (pH 9,4), 25 mmokl'1 MgCl2, 0,1% Triton X-100;
d) 0,1 U/μΙ Exonukleáza λ (Fermentas), definice jednotky viz bod 11.
Jíl. Roztok exonukleázy T7:
a) destilovaná voda
b) lx pufr pro exonukleázu T7 (New England BioLabs, 2 μΐ lOx koncentrovaného pufru do 20 μΐ směsi), tento pufr je dodáván jako lOx koncentrovaný; složení lOx koncentrovaného pufru je následující; 200 mmokl'1 Tris-acetát (TAE; pH 7,9 při 25 °C), 500 mmokl1 MgCl2 octan draselný, 100 mmokl'1 octan hořečnatý, 10 mmokl·1 dithiothreitol;
e) 1 U/μΙ Exonukleáza T7 (New England BioLabs), definice jednotky viz bod 11.
1V Roztok endonukleázy IV:
a) destilovaná voda
b) lx pufr pro endonukleázu IV (Fermentas, 2 μΐ lOx koncentrovaného pufru do 20 μΙ směsi), tento pufr je dodáván jako lOx koncentrovaný; složení lOx koncentrovaného pufru je následující; 500 mmokl·1 Tris-acetát (TAE; pH 7,5), 500 mmokl'1 chlorid draselný, 0,5% (obj./obj.) Triton X-100, 10 mmol.l·1 EDTA;
c) 0,1 U/μΙ Endonukleáza IV (Fermentas), definice jednotky viz bod 11.
6. Roztok terminální deoxynukleotidyltransferázy:
a) destilovaná voda
b) lx pufr pro terminální deoxynukleotidyl transferázu (Fermentas, 4 μΐ 5x koncentrovaného pufru do 20 μΐ směsi), tento pufr je dodáván jako 5x koncentrovaný; složení 5x koncentro45 váného pufru je následující: 125 mmol.l·1 Tris (pH 7,2 při 25 °C), l mokl'1 kakodylát draselný, 5 mmol.l“1 chlorid kobaltnatý, 0,05 % (obj./obj.) Triton XI00;
c) 2 U/μΙ DNA terminální deoxynukleotidytransferáza (Fermentas), definice jednotky viz bod li;
- 13CZ 303251 R6
d) 0,05 mmol.l 1 dATP, dGTP, dCTP,
c) alternativně 0,05 nebo 0,01 mmol.l 1 5-bromo—2'-deoxyuridin-5'-trifosfát, 5-ehloro2'deoxyuridín-5'-trifosfát, 5jodo-2'-deoxyuridin--5'-trifoslát. nebo alternativně
0,0125 mmol.l 1 biotín-16-2- deoxyiiridin-5 '-trifosfát, digoxigenín-1 l-2'-deoxyuridin5 5-trifosfát, 2' deoxy-5-ethy nyl uridin-5'-trifosfát, biotin-l 1-2'-deoxycytidin-5'-trifosfát, nebo konjugáty deoxyuridin-5'-trifosfátu (dUTP) s fluorescenčními barvivý fluoresceinového, rhodam i nového nebo ku mari nového typu, které jsou připojeny k atomu C5 urac i lové nukleobáze prostřednictvím alkynového linkeru (dále jen fluorescein-dUTP, rhodamin-dUTP, kumarin-dUTP). Je možné použít rovněž kombinace uvedených nukleotiii) dů, případně jakékoli další značené nukleotidy, které jsou substráty terminální deoxynukleotidyltransferázy.
7. Roztok DNA polymerázy I z E. coli
a) destilovaná voda
b) lx pufr pro DNA polymerázu I (Fermentas, 2 μί lOx koncentrovaného pufru do 20 μΙ směsí), tento pufr je dodáván jako lOx koncentrovaný; složení lOx koncentrovaného pufru je následující: 500 mmol.l·1 Tris-HCl (pH 7,5 pri 25 °C), 100 mmol.l 1 MgCh, 10 mmol.l 1 dithiothreitol;
c) 0,2 U/μΙ DNA polymeráza (Fermentas), definice jednotky viz bod 11; zo d) 0,05 mmol.l ‘ dATP, dGTP, dCTP,
e) alternativně 0,0125 mmol.l 1 biotin-16-2'-deoxyuridin-5'-trifosfát, digoxigenin-1 1-2'deoxyuridin-5'-trifosfát, 2'-deoxy-5-ethynyluridin-5'-trifosfát, biotin-l l-2'-deoxycytidin-5-trifosfát, fluorescein-dUTP, rhodamin-dUTP, kumarin-dUTP. Je možné rovněž použít kombinace uvedených nukleotidů, případně jakékoli další značené nukleotidy, které jsou substráty DNA polymerázy I.
8. Roztok Klenowova enzymu
a) destilovaná voda
b) lx pufr pro KJenowův fragment (Fermentas, 2 μΙ lOx koncentrovaného pufru do 20 μΙ směsi), tento pufr je dodáván jako lOx koncentrovaný; složení lOx koncentrovaného pufru je následující: 500 mmol.l 1 Tris-HCl (pH 8 pri 25 °C), 50 mmol.l·1 MgCI2, 10 mmol. I'1 dithiothreitol;
c) 0,2 U/μΙ Klenowův enzym (Fermentas), definice jednotky viz bod 11;
d) 0,05 mmol.l·1 dATP, dGTP, dCTP,
e) alternativně 0,0125 mmol.!“1 biotin-16-2'-deoxyuridin-5'-trifosfát, digoxigenin-11-2'deoxyuridin-5'-trifosfát, 2'-deoxy-5-ethynyluridin-5 -trifosfát, biotin-l l-2'-deoxycytidin-5-trifosfát, fluorescein-dUTP, rhodamin-dUTP, kumarin-dUTP. Je možné rovněž použít kombinace uvedených nukleotidů, případně jakékoli další značené nukleotidy, které jsou substráty Klenowova enzymu.
9. Roztok T7 DNA polymerázy
a) destilovaná voda
b) lx pufr pro T7 DNA polymerázu (Fermentas, 2 μί lOx koncentrovaného pufru do 20 μί směsi), tento pufr je dodáván jako lOx koncentrovaný; složení lOx koncentrovaného pufru je následující: 400 mmol.l“1 Tris-HCl (pH 7,5 pri 25 °C), 100 mmol.l'1 MgCF, 10 mmol.!'1 dithiothreitol;
c) 0,2 U/μΙ T7 DNA polymeráza (Fermentas), definice jednotky viz bod 11;
d) 0,05 mmol.l'1 dATP, dGTP, dCTP,
- 14CZ 303251 B6
e) 0,0125 mmol.l 1 biotin-16 2' <jeoxyuridin--5' trifosfát. digoxigenin-11-2'-deoxyuridín5 '-trifosfát, 2 '-deoxy-5-ethyny I urid i n-5'-tri fosfát, biotin-11-2'-deoxycytidin-5'—trifosfát, fluorescein-dUTP, rhodamin-dUTP, kumarin-dUTP. Je možné rovněž použít kombinace uvedených nukleotidů, případně jakékoli další značené nukleotidy, které jsou substráty
T7 DNA polymerázy.
10, Roztok T4 DNA polymerázy
a) destilovaná voda
b) lx pufr pro T4 DNA polymerázu (Fermentas, 4 μΐ 5x koncentrovaného pufru do 20 μΙ in směsi), tento pufr je dodáván jako 5x koncentrovaný; složení 5x koncentrovaného pufru je následující: 335 mmol.l 1 Tris HCI (pH 8,8 při 25 °C), 33 mmol.!“1 MgCU, 84 mmol.l“1 (NH4)2SO4, 5 mmol.r1 dithiothreitol;
c) 0,2 U/μΙ T4 DNA polymeráza (Fermentas), definice jednotky viz bod 11;
d) 0,05 mmol.f1 dATP, dGTP, dCTP,
c) alternativně 0,0125 mmol.r1 biotin-16-2'-deoxyuridin-5'-trifosfát. digoxigenin-11-2'deoxyuridin-5'-trifosfát, biotin-1 l-2'-deoxycytidin-5'-trifosfát, 2'-deoxy-5-ethynyluridin-5'-trifosfát, fluorescein-dUTP, rhodamin-dUTP, kumarin-dUTP. Je možné rovněž použít kombinace uvedených nukleotidů, případně jakékoli další značené nukleotidy, které jsou substráty T7 DNA polymerázy.
11. Definice jednotky použitých enzymu.
a) Exonukleáza III (Fermentas)
Jedna jednotka (U) enzymu uvolní za 30 minut 1 nmol produktu z DNA E. coli při 37 °C. Enzymatická aktivita byla měřena v následující směsi: 50 mmol.l“1 Tris-HCl (pH 8,0),
5 mmol.l 1 MgCI2, l mmol.l 1 dithiothreitol a 0,05 mmol.l“1 DNA z E. coli dezintegrované ultrazvukem (sonikované).
b) Exonukleáza λ (Fermentas)
Jedna jednotka (U) enzymu uvolni za 30 minut 10 nmol produktu z DNA E. coli při 37 °C. Enzymatická aktivita byla měřena v následující směsi: 67 mmol.r1 glycin-KOH (pH 9,4),
2,5 mmol.r1 MgCl2, 0,1 % (obj./obj.) Tritonu X-100 a20 pg/ml sonikované DNA z E. coli.
c) Exonukleáza T7 (New England BioLabs)
Jedna jednotka (U) enzymu uvolní za 30 minut 1 nmol produktu z DNA E. coli při 25 °C. Enzymatická aktivita byla měřena v následující směsi: 20 mmol.l“1 Tris-acetát (TAE; pH 7,9 při 25 °C), 50 mmol.I“’ octan draselný, 10 mmol.l1 octan hořečnatý, 1 mmol.r1 díthio35 threitol, 0,15 mmol.l“1 sonikované DNA z E. coli.
d) Endonukleáza IV (Fermentas)
Jedna jednotka (U) enzymu uvolní za 30 minut 1 pg produktu z částečně depurinováného plazmidu pri 37 °C, Enzymatická aktivita byla měřena v následující směsi: 50 mmol.l“1 Tris-acetát (TAE; pH 7,5), SOmmolJ”1 chlorid draselný, 1 mmol.r1 EDTA, 0,05% (obj./obj.) Triton X-l 00, 2 pg částečně depuri nované DNA plazmidu pUC19.
e) Alkalická fosfatáza z krevety (SAP, Fermentas)
Jedna jednotka (U) enzymu hydrolyzuje 1 pmol 4-nitrofenyl fosfátu za 1 minutu pri 37 °C. Enzymatická aktivita byla měřena v následující směsi: 1 mol.l 1 diethanolamin-HCl (pH 9,8), 0,5 mmol.r1 MgCl2, 10 mmol.r1 4-nitrofenyl fosfát.
f) Terminální deoxynukleotidyltransferáza (Fermentas):
Jedna jednotka enzymu katalyzuje za 60 minut inkorporací 1 nmol monofosfátu deoxythymidinu (dTMP) při 37 °C. Enzymatická aktivita byla měřena v následující směsi: 200 mmol.l“1 kakodylát draselný (pH 7,2), 1 mmol.r1 chlorid kobaltnatý, 0,01% (obj./obj.) Tri- 15CZ 303251 B6 ton X-100, 10 μιτιοΙ.Ι 1 oligo(dT)10, 1 mmol.l 1 trifosfátů deoxythymidinu (dTTP) a 0,4 MBq/ml [3HHTTP.
g) DNA polymeráza I z E. coli (Fermentas)
Jedna jednotka enzymu katalyzuje za 30 minut inkorporaci 10 nmol deoxyribonukleotidů při
37 °C. Enzymatická aktivita byla měřena v následující směsi: 67 mmol.l ’ fosfát draselný (pH 7,4), 6,7 mmol.l 1 chlorid horečnatý, 1 mmol.l 1 2 merkaptoethanol. 0,033 mmol.l·1 dATP, 0,0033 mmol.l 1 dTTP, 0,4 MBq/ml [3HjdlIP a 62,5 gg/ml poly(dA-dT)»poly(dA-dT).
h) Klenowův enzym (Fermentas) in Jedna jednotka enzymu katalyzuje za 30 minut inkorporaci 10 nmol deoxyribonukleotidů při °C. Enzymatická aktivita byla měřena v následující směsi: 67 mmol.!“1 fosfát draselný (pH 7,4), 6,7 mmol.l 1 chlorid hořečnatý, 1 mmol.l 1 2 merkaptoethanol, 0,033 mmol.l 1 dATP, 0,0033 mmol.l 1 dTTP, 0,4 MBq/ml [3Hj-dTTP a 62,5 gg/ml poly(dA-dT>poly(dA-dT).
i) T7 DNA polymeráza (Fermentas)
Jedna jednotka enzymu katalyzuje za 30 minut inkorporaci 10 nmol deoxyribonukleotidů při 37 °C. Enzymatická aktivita byla měřena v následující směsi: 40 mmol.l“1 Tris-HCl (pH 7,5), 10 mmol.l1 chlorid hořečnatý, 1 mmol.l1 dithiothreitol, 0,01 mg/ml BSA, 0,33 mmol.l 1 dATP, 0,33 mmol.l 1 dGTP, 0,33 mmol.l 1 dCTP, 0,33 mmol.l 1 dTTP, 0,4
2o MBq/ml [3H]-dTTP a 0,5 mmol.l·1 denaturované DNA z telecího brzlíku.
j) T4 DNA polymeráza (Fermentas)
Jedna jednotka enzymu katalyzuje za 30 minut inkorporaci 10 nmol deoxyribonukleotidů při 37 °C. Enzymatická aktivita byla měřena v následující směsi: 67 mmol.l·1 Tris-HCl (pH 8,8), 6,7 mmol.l 1 chlorid hořečnatý, 1 mmol.l“1 dithiothreitol, 16,7 mg/ml síran amonný,
0,2 mg/ml BSA, 0,033 mmol.l“1 dTTP, 0,4 MBq/ml [31 IJ—dTTP a 0,2 mmol.l-1 denaturované
DNA z telecího brzlíku.
12. Příprava polylysinových skel pro ukotveni suspenzních buněk
Kruhová skla s průměrem 13 mm byla vložena do 50ml kádinky s 20 ml 96% (obj./obj.) ethano30 lu. Po 10 minutách byla pomocí pinzety přenesena do Petriho misky, na jejímž dně byl položený filtrační papír a usušena. Skla byla na dobu 1 minuty ponořena do 0,01% roztoku poly-L-lysinu v DMEM, následně na 30 sekund do Ix PBS a ještě jednou na 30 sekund do PBS. Tento krok byl ještě 3x opakován. Nakonec byla skla položena na filtrační papír a usušena.
13. Dialyzační pufr mmol.l1 Tris-HCl, pH 8 10 mmol.l“1 EDTA, pH 8 uchováván při 4 °C.
Alternativně byly použity v dialyzačním pufru vymývací látky uvedené v bodu 3 a 4 této části. Použitá literatura:
Hein, C. D., Liu, X. M, and Wang, D. (2008) Click chemistiy, a powerful tool for pharmaceutical Sciences. Pharm Res, 25, 2216 až 2230.
Průmyslová využitelnost:
Způsob značení dvouřetězcové DNA podle předkládaného vynálezu lze využít v případech, kdy je důležité selektivní a citlivé značení DNA. V této souvislosti je možné mimo jiné předpokládat včlenění této procedury a jednotlivých použitých látek do sad na detekci DNA. Současně je možné použití pro přípravu hybridizačních DNA prób.
Claims (15)
- PATENTOVÉ NÁROKY5 1. Způsob značení dvouřetězcové DNA, vyznačující se tím, že vzorky s DNA se inkubují v přítomnosti jednomocných iontů mědi a kyslíku, přičemž zdrojem těchto iontů mohou být vodné roztoky obsahující ionty mědi, nebo jednomocná měď, která byla na DNA navázána; působením jednomocných iontů mědi a kyslíku na DNA se v jejích řetězcích vytvoří početná přerušení, následně se vzorky inkubují se značenými nukleotidy a enzymy s DNA polymerázoio vou aktivitou, jako jsou terminální deoxynukleotidyltransferáza nebo DNA polymerázy, které použijí vzniklá přerušení jako počáteční místa pro syntézu nového řetězce DNA podle řetězce předlohového a inkorporují do těchto míst značené nukleotidy, které potom slouží jako značky pro detekcí DNA, přičemž volitelně se pro odstranění nežádoucích produktům, které vznikají při inkubaci vzorků DNA v přítomnosti iontů mědi, použijí vymývací látky, jejichž použití předchází is enzymatickým krokům.
- 2. Způsob značení dvouřetězcové DNA podle nároku 1, vyznačující se tím, že v případě absence 5-3' exonukleázové a/nebo vytěsňovací aktivity u použité DNA polymerázy, zpřístupňující předlohový řetězec, se vzorky před tímto krokem inkubují s enzymem, který vyka20 zuje vlastni exonukleázovou aktivitu ve směru 5'-3'; následně se vzorky inkubují s DNA polymerázou.
- 3. Způsob značení dvouřetězcové DNA podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že v případě absence 3'-5' exonukleázové aktivity' u použité DNA polymerázy, zpřístupňující25 předlohový řetězec, se vzorky před tímto krokem inkubují s enzymem, který vykazuje vlastní 3 5' exonukleázovou a/nebo fosfatázovou aktivitu a až následně se vzorky inkubují s DNA polymerázou.
- 4. Způsob značení dvouřetězcové DNA podle nároku l, vyznačující se tím, že30 vzorky s DNA se před inkubací s DNA polymerázou, která vykazuje vlastní 5'-3' exonukleázovou a/nebo vytěsňovací aktivitu, nejprve inkubují s enzymem, majícím rovněž exonukleázovou aktivitu, čímž se dosáhne dalšího zvýšení měřitelného signálu.
- 5. Způsob značení dvouřetězcové DNA podle nároku 1, vyznačující se tím, že před35 použitím terminální deoxynukleotidyltransferázy se vzorky inkubují s enzymem, který vykazuje vlastní 3'-5' exonukleázovou a/nebo fosfatázovou aktivitu a až následně se inkubují s terminální deoxynukleotidyltransferázou.
- 6. Způsob značení dvouřetězcové DNA podle kteréhokoliv z nároků laž5, vyznačující40 se tím, že jednomoené ionty mědi vázané na dvouřetězcovou DNA se získají inkubací vzorků s touto DNA ve vodných roztocích obsahujících jednomoené ionty mědi, přičemž inkubace se výhodně provádí bez přístupu kyslíku, ať už v uzavřené nádobě se vzorky či za probublávání dusíkem a v přítomnosti vymývacích látek.45
- 7. Způsob značení dvouřetězcové DNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že jednomoené ionty mědi vázané na dvouřetězcovou DNA se získají redukcí dvojmocných iontů mědi navázaných na dvouřetězcovou DNA, se kterou byly předem inkubovány, účinkem redukujících látek jako jsou askorbát sodný, hydrazin čí tris(2-karboxyethyl)fosfin, popřípadě v přítomnosti vymývacích látek.
- 8. Způsob značení dvouřetězcové DNA podle kteréhokoliv z nároků laž5, vyznačující se tím, že přítomnost kyslíku se během inkubace vc vodných roztocích za přítomnosti iontů jednomoené mědi, a to jak volných, tak navázaných na DNA, zajistí aktivním prokysliČováním.- 17C7. 303251 B6
- 9- Způsob značení dvouřetězcové DNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že vymývací látky se použijí ve vodných roztocích pro inkubaci sjednomocnými ionty mědi, jak volnými, tak navázanými na DNA.s
- 10. Způsob značení dvouřetězcové DNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že vymývací látky se aplikují po inkubaci sjednomocnými ionty mědi, jak volnými, tak navázanými na DNA.
- 11. Způsob značení dvouřetězcové DNA podle nároku 9 nebo 10, vyznačující se tím, to že vymývací látky se zvolí ze skupiny, zahrnující kyselinu 4_( 2-hydroxy ethy l)-l-p i perazinethansulfonovou, kyselinu 3-[4-(2-hydroxyethyl)-l-pÍperazinyl]propansulfonovou, kyselinu N[tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropansulfonovou, /VjV-bis(2-hydroxyethyl)glycin, N[tris(hydroxymethyl)methyl]glycin, kyselinu 2-[(2-hydroxy-l, l-bis(hydroxymethyl)ethyl)aminojethansulfonovou, kyselinu jV-(karbamoyImethyl)iminodioctovou, kyselinu N-bis(215 hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonovou, 2,2-bis(hydroxymethyl)-2,2',2' -nitrilotriethanol, tris(hydroxymethyl)aminomethan, glycyl-glycin, kyselinu p-hydroxy-4-morfolinpropansulionovou, kyselinu piperazin-Ν,Ν-bis(2~hydroxypropansulfonovou), glycin, glycinamíd, D-a Iv etám i noky sel iny jako alanin, serin, prolin, lysin, arginin, asparagin, glutamin, kyselinu asparagovou, kyselinu glutamovou, citrulin, threonin a dále amoniak, ethanolamín, diethanolamin, tri20 ethanolamín, diethylamin, triethylamin, diispropylethylamin a diisopropylamin nebo jiný primární nebo sekundární amin, popřípadě se použije kombinace výše uvedených látek.
- 12. Způsob značení dvouřetězcové DNA podle nároku 10, vyznačující se tím, že vymývací látky se zvolí ze skupiny, zahrnující kyselinu ethylenglykol-bis(2 aminoethylc(her)25 Ν,Ν,Ν',Ν'-tetraoctovou či kyselinu ethylendiamintetraoctovou, popřípadě v kombinaci s vymývacími látkami uvedenými v nároku 11.
- 13. Způsob značení dvouřetězcové DNA podle kteréhokoli z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že značené nukleotidy se s výhodou zvolí ze skupiny, zahrnující: 5-bromo-230 deoxyuridin-5'-trifosfát, 5-chloro-2'-deoxyuridin-5'-trifosfát, 5-jodo-2'-deoxy uridin-5'-trifosfát, biotin-16-2 -deoxyuridin-5 -trifosfát, digoxigenin-l I-2'-deoxyuridin-5 '-trifosfát, 2'deoxy-5-ethy nyl uridin-5'-trifosfát, biotin-11-2'-deoxycytidin-5'-trifosfát, nebo konjugáty deoxyuridin-5'-trifosfátu (dUTP) s fluorescenčními barvivý fluoresceinového, rhodaminového nebo kumarinového typu, které jsou připojeny k atomu C5 uracilové nukleobáze prostřednictvím35 alky no vého linkeru.
- 14. Způsob značení dvouřetězcové DNA podle kteréhokoliv z nároků 2až5, vyznačující se tím, že enzymy, vyznačující se exonukleázovou a/nebo fosfatázovou aktivitou, se s výhodou zvolí ze skupiny, která zahrnuje: exonukleázu 111, exonukleázu λ, exonukleázu T7, endo40 nukleázu IV a alkalickou fosfatázu.
- 15. Způsob značení dvouřetězcové DNA podle kteréhokoliv z nároků laž4, vyznačující se t í m , že DNA polymerázy se s výhodou zvolí ze skupiny, která zahrnuje: DNA polymerázu 1, Klenowův fragment, T7 DNA polymerázu a T4 DNA polymerázu.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20110309A CZ303251B6 (cs) | 2011-05-24 | 2011-05-24 | Zpusob znacení dvouretezcových molekul DNA |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20110309A CZ303251B6 (cs) | 2011-05-24 | 2011-05-24 | Zpusob znacení dvouretezcových molekul DNA |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2011309A3 CZ2011309A3 (cs) | 2012-06-20 |
| CZ303251B6 true CZ303251B6 (cs) | 2012-06-20 |
Family
ID=46232374
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20110309A CZ303251B6 (cs) | 2011-05-24 | 2011-05-24 | Zpusob znacení dvouretezcových molekul DNA |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ303251B6 (cs) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ307016B6 (cs) * | 2015-03-13 | 2017-11-15 | Univerzita PalackĂ©ho v Olomouci | Způsob stabilizace protilátek rozeznávajících 5-bromo-2´-deoxyuridin a/nebo 5-chloro-2´-deoxyuridin a/nebo 5-jodo-2´-deoxyuridin v místech inkorporace těchto nukleosidů do DNA po působení jednomocnou mědí a/nebo exonukleázou III |
-
2011
- 2011-05-24 CZ CZ20110309A patent/CZ303251B6/cs not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| Bromidge T. J. a kol. Adaptation of the TdT assay for semi-quantitative flow cytometric detection of DNA strand breaks. Cytometry, 1995, vol. 20, str. 257-260. * |
| Chiou S.-H. a kol. Specific cleavages of DNA by ascorbate in the presence of copper ion or copper chelates. J. Biochem., 1985, vol. 98, str. 1723-1726. * |
| Gorczyca W. a kol. Detection of DNA strand breaks in individual apoptotic cells by the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays. Cancer Res., 1993, vol. 53, str. 1945-1951. * |
| Gratzner H.G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science, 1982, vol. 218, no. 4571, str. 474-475. * |
| McKenna S. L. a kol. Flow cytometric apoptosis assays indicate different types of endonuclease activity in haematopoietic cells and suggest a cautionary approach to their quantitative use. Cytometry, 1998, vol. 31, str. 130û136. * |
| Wang Y. a Van Ness B. Site-specific cleavage of supercoiled DNA by ascorbate/Cu(II). Nucleic Acids Res., 1989, vol. 17, str. 6915-6926. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ307016B6 (cs) * | 2015-03-13 | 2017-11-15 | Univerzita PalackĂ©ho v Olomouci | Způsob stabilizace protilátek rozeznávajících 5-bromo-2´-deoxyuridin a/nebo 5-chloro-2´-deoxyuridin a/nebo 5-jodo-2´-deoxyuridin v místech inkorporace těchto nukleosidů do DNA po působení jednomocnou mědí a/nebo exonukleázou III |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ2011309A3 (cs) | 2012-06-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Baltimore et al. | Ribonucleic acid synthesis of vesicular stomatitis virus, II. An RNA polymerase in the virion | |
| CN116615560A (zh) | 用于大规模平行核酸测序的试剂 | |
| Winz et al. | Capture and sequencing of NAD-capped RNA sequences with NAD captureSeq | |
| SCHUERCH et al. | β‐Lapachone, an Inhibitor of Oncornavirus Reverse Transcriptase and Eukaryotic DNA Polymerase‐α: Inhibitory Effect, Thiol Dependency and Specificity | |
| JPH03501211A (ja) | 核酸塩基配列を検出するための方法及び試薬 | |
| NZ525190A (en) | A kit that detects directly the pathogenicity of the pathogenic influenza A subtype H5 virus | |
| WO2013035875A1 (ja) | プライマーセット及びそれを用いた標的核酸配列の増幅方法並びに変異核酸の検出方法 | |
| HUE033651T2 (en) | A method for producing two-function complexes | |
| AU2019445584B2 (en) | Single-channel sequencing method based on self-luminescence | |
| EP3380841B1 (en) | Autonomous sensing molecules (asm) | |
| CN104975079A (zh) | 基于DNA纳米结构的17β-雌二醇可视化检测方法及检测试剂盒 | |
| AU593806B2 (en) | Prolonged chemiluminescence | |
| EP3878968A1 (en) | Method for sequencing polynucleotides | |
| JP2006136322A (ja) | 核酸標識方法 | |
| JPH09502616A (ja) | 指数関数的富化によるリガンドの系統的進化：核酸リガンドの光選択と溶液ｓｅｌｅｘ | |
| JP2003525631A (ja) | 核酸センサー分子 | |
| Zhao et al. | An electrochemical aptasensor for thrombin detection based on the recycling of exonuclease III and double-stranded DNA-templated copper nanoparticles assisted signal amplification | |
| EP4047098A1 (en) | Method for sequencing polynucleotides on basis of optical signal dynamics of luminescent label and secondary luminescent signal | |
| CZ303251B6 (cs) | Zpusob znacení dvouretezcových molekul DNA | |
| WO2013097760A1 (zh) | 一种用于改进逆转录酶性能的试剂 | |
| Pritchard et al. | Replication of parvoviral DNA. I. Characterization of a nuclear lysate system | |
| US7323319B2 (en) | RNA containing coenzymes, biotin, or fluorophores, and methods for their preparation and use | |
| JP7696843B2 (ja) | ニッキング酵素の改善又はニッキング酵素に関する改善 | |
| CZ303230B6 (cs) | Zpusob zprístupnení specifických pyrimidinových nukleosidu ve strukture dvouretezcové DNA pro reakci s protilátkami, které s temito nukleosidy reagují | |
| ES2586678T3 (es) | Procedimientos, composiciones y kits para la determinación del virus de la Hepatitis A |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20190524 |