ES2586678T3 - Procedimientos, composiciones y kits para la determinación del virus de la Hepatitis A - Google Patents

Procedimientos, composiciones y kits para la determinación del virus de la Hepatitis A Download PDF

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ES2586678T3 ES12829723.1T ES12829723T ES2586678T3 ES 2586678 T3 ES2586678 T3 ES 2586678T3 ES 12829723 T ES12829723 T ES 12829723T ES 2586678 T3 ES2586678 T3 ES 2586678T3
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
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Abstract

Molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos, o un complemento de la misma, tal como se indica en: 5'-GCG CCC GGC GGG GTC AAC TCC AT-3' (SEC ID NO: 1); 5'-AGC CAA GTT AAC ACT GCA AGG-3' (SEC ID NO: 2), o 5'- TTA GCA TGG AGC TGT AGG AGT CTA AAT TGG GG-3' (SEC ID NO: 3).

Description

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DESCRIPCION
Procedimientos, composiciones y kits para la determinacion del virus de la Hepatitis A SECTOR DE LA INVENCION
La presente invencion se refiere al virus de la Hepatitis A (VHA) y comprende procedimientos, composiciones y kits para la deteccion del mismo.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
El VHA es un virus ARN que causa una infeccion no cronica del higado y puede ser transmitido a traves de productos de la sangre. Las donaciones de plasma recogidas para la fabricacion de productos terapeuticos biologicos se someten a ensayos para la deteccion de ARN de vHa y las donaciones que resultan positivas son rechazadas.
La solicitud de patente internacional con numero WO03/106641A2 da a conocer un procedimiento para la deteccion del virus de la Hepatitis A (VHA) en una muestra biologica, por ejemplo, sangre, plasma, suero y celulas de la sangre, basado en tecnicas de amplificacion de acidos nucleicos, las cuales incluyen PCR, amplificacion mediada por transcripcion o ensayos de nucleasa 5’, tal como la tecnica TaqMan. Dicho procedimiento de diagnostico esta basado en la utilizacion de un par de cebadores con secuencias: 5’-GGATTGATTGTCAGGGCTGTC-3’ y 5’- CCCTCTCACAGGATCCCATTT-3’. Este procedimiento contempla diversas estrategias de amplificacion y deteccion.
Ademas, la patente alemana con numero DE102006034844B3 da a conocer un procedimiento para la deteccion del VHA y/o el Parbovirus B19 en sangre completa, plasma, suero o componentes celulares de la sangre a partir de individuos o conjuntos de hasta 96 individuos basado en el desarrollo de la tecnica TaqMan. Para la deteccion del VHA, da a conocer la utilizacion de dos cebadores especificos con las secuencias: 5’- GGTAGGCTACGGGTGAAACCTCTT-3’ y 5’-GTCAGTCCTCCGGCGTTGAATGG-3’; y dos sondas especificas con las secuencias: 5’-TATGAAGAGATGCCTTGGATAGGGT-3’ y 5’-TATGAAGAGATGCTTTGGATAGGGT-3’. Dichas sondas tienen el mismo colorante en 5’ y en 3’ el mismo colorante o colorante de extincion. Ademas, dicho documento da a conocer la utilizacion de un control interno para verificar que la PCR se ha llevado a cabo de forma correcta. Dicho control interno se anade, preferentemente, al tampon de lisis.
Por lo tanto, aun existe la necesidad de disponer de composiciones y procedimientos alternativos para la deteccion del VHA.
CARACTERISTICAS DE LA INVENCION
A continuacion, se da a conocer, en un aspecto, una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos, o un complemento de la misma, tal como se indica en:
5'-GCG CCC GGC GGG GTC AAC TCC AT- 3' (SEQ ID NO: 1);
5'-AGC CAA GTT AAC ACT GCA AGG-3' (SEQ ID NO: 2); o
5'-TTA GCA TGG AGC TGT AGG AGT CTA AAT TGG GG-3' (SEQ ID NO: 3).
En otro aspecto, la presente invencion da a conocer una composicion que comprende un par de cebadores de oligonucleotidos, que comprende un cebador directo que tiene una secuencia, tal como se indica en la SEQ ID NO: 1 y un cebador inverso que tiene una secuencia, tal como se indica en la SEQ ID NO: 2, en la que el par de cebadores es capaz de hibridarse a una secuencia diana en condiciones de PCR para amplificar la secuencia diana.
En otro aspecto, la presente invencion da a conocer un procedimiento para la amplificacion de una secuencia diana, comprendiendo el procedimiento:
llevar a cabo una PCR con la secuencia diana como plantilla, en la que la realizacion comprende proporcionar a la PCR un cebador directo que comprende la secuencia, tal como se indica en la SEQ ID NO: 1 y un cebador inverso que comprende la secuencia, tal como se indica en la SEQ ID NO: 2.
En un aspecto, la presente invencion da a conocer un procedimiento para la determinacion del VHA en una muestra, comprendiendo el procedimiento:
llevar a cabo una PCR con un plantilla de acido nucleico en la muestra utilizando un cebador directo que comprende la secuencia, tal como se indica en la SEQ ID NO: 1 y un cebador inverso que comprende la secuencia, tal como se indica en la SEQ ID NO: 2; y
detectar un amplicon generado por el cebador directo y el inverso, en el que la presencia del amplicon determina el VHA en la muestra.
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Aun en otros aspectos adicionales, la presente invencion da a conocer un kit que comprende las composiciones y/o una o mas de las moleculas de acido nucleico de la presente invencion.
DESCRIPCION DETALLADA
A continuacion, se presenta, en un aspecto, una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos, tal como se indica en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3, o un complemento de las mismas.
Tambien se describe una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos, tal como se indica en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3, o un fragmento de las mismas que tiene, como minimo, 10 nucleotidos, de manera ilustrativa, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, o 32 nucleotidos.
En otras realizaciones, las moleculas de acido nucleico aisladas de la presente invencion tienen una longitud de no mas de aproximadamente 100 pares de bases, de manera ilustrativa, no mas de aproximadamente: 100, 90, 80, 70, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 34, 33, 32, 31,30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21,20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, y 10 pares de bases.
En otra realizacion, la presente invencion da a conocer una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos seleccionada del grupo que comprende: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3, o un complemento de las mismas.
La expresion "molecula de acido nucleico" en el presente documento se refiere a polimeros compuestos de bases de nucleotidos de origen natural, azucares y enlaces (cadena principal) internucleosidicos covalentes, asi como moleculas de acido nucleico que tienen partes de origen no natural que tienen una funcion similar. Ademas, la expresion "molecula de acido nucleico" tambien se refiere a polimeros de doble cadena, de cadena unica, que comprenden ARN, ADN, ARN o ADN modificado, mimeticos de ArN o ADN, o cualquier combinacion de los mismos.
En algunas realizaciones, los cebadores y sondas de oligonucleotidos se pueden derivar de las secuencias de acido nucleico descritas en el presente documento. En varias realizaciones, los cebadores y sondas se utilizan en combinacion entre si. La presente invencion se utiliza en una variedad de aplicaciones diferentes, que incluyen, sin constituir limitacion, aplicaciones de investigacion, medicas y de diagnostico del VHA. Por ejemplo, los cebadores y sondas se pueden proporcionar como reactivos para su utilizacion, por ejemplo, en un ensayo y/o kit de deteccion del VHA.
Generalmente, un par de cebadores que comprende un cebador directo y un cebador inverso pueden proporcionar la amplificacion especifica (por ejemplo, mediante PCR) de un acido nucleico diana flanqueado por los cebadores para producir un producto de amplificacion (tambien referido como "amplicon"). En este sentido, cada cebador se une a su secuencia diana complementaria o sustancialmente complementaria proporcionando de este modo un sitio para que una polimerasa se una y extienda el extremo 3' de cada cebador mediante la adicion de nucleotidos, proporcionando de este modo una copia complementaria de la secuencia diana.
En una realizacion, un par cebadores comprende un cebador directo que tiene la secuencia, tal como se indica en la SEQ ID NO: 1 y un cebador inverso que tiene la secuencia, tal como se indica en la SEQ ID NO: 2.
En una realizacion, el acido nucleico diana, como minimo, es un segmento de un ADNc preparado a partir del ARN transcrito en el sentido inverso de un VHA. Un experto en la materia reconocera que el ARN puede ser transcrito de forma inversa utilizando procedimientos (por ejemplo, transcripcion inversa (RT)) conocidos en la tecnica para proporcionar una plantilla para la amplificacion por los cebadores.
Por ejemplo, en algunas realizaciones, se lleva a cabo una PCR con transcripcion inversa (RT-PCR) utilizando una transcriptasa inversa, una polimerasa, y un par de cebadores especificos del VHA de la presente invencion para amplificar ARN viral del VHA en una muestra. La muestra puede ser un sobrenadante de cultivo o una muestra de plasma preparada a partir de un individuo infectado por VHA. El par de cebadores especificos del VHA de la presente invencion es capaz de amplificar ARN viral del VHA.
Generalmente, una sonda es un oligonucleotido que es complementario o sustancialmente complementario a una secuencia de nucleotidos del acido nucleico diana. Las sondas son utiles para una variedad de aplicaciones, incluyendo, sin constituir limitacion, la deteccion o captura del acido nucleico diana o un amplicon correspondiente a la diana. Por ejemplo, se pueden disenar sondas adecuadas para su utilizacion en procedimientos de deteccion basados en la amplificacion a partir de cualquier secuencia situada dentro de la secuencia de un producto de amplificacion y/o que comprende dicha secuencia, que seria producido utilizando dos cebadores seleccionados.
En una realizacion, la sonda comprende una secuencia de nucleotidos complementaria o sustancialmente
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complementaria, como minimo, a una parte de una secuencia de un amplicon generado por un par de cebadores que comprende un cebador directo que tiene la secuencia, tal como se indica en la SeQ ID NO: 1 y un cebador inverso que tiene la secuencia, tal como se indica en la SEQ ID NO: 2.
En otras realizaciones, la sonda comprende la secuencia de nucleotidos, tal como se indica en la SEQ ID NO: 3, o un complemento de la misma.
Un experto en la materia reconocera que las moleculas de acido nucleico aisladas de la presente invencion, incluyendo cebadores y/o sondas, se pueden obtener mediante tecnicas estandar de biologia molecular descritas en Current Protocols in Molecular Biology (1999. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K, editores. John Wiley & Sons, Inc.) o por sintesis quimica o por analogos de acidos nucleicos. Los procedimientos que implican sintesis quimica pueden ser automatizados y disponibles comercialmente y pueden incluir, por ejemplo, procedimientos de fosfodiester, fosfotriester o fosforamidita. Las patentes de EE.uU. Nos. 4.458.066; 4.415.732; y Meth. Enzymol. 1979 68:90 y 109, dan a conocer ejemplos de procedimientos de sintesis quimica. La sintesis quimica de acidos nucleicos permite la incorporacion de bases no naturales o modificadas, asi como una variedad de restos de marcaje, en una molecula de acido nucleico. Ademas, productos quimicos con la cadena principal modificada, tales como, por ejemplo, enlaces peptidicos, fosforotioatos, fosforamidatos, fosfotriesteres, 2'-O-metil ARN, 2'-O-Mt ARN, P-etoxi ADN, y P-etoxi-2'-O-Mt ARN tambien estan facilmente disponibles y son conocidos en la tecnica anterior. Ademas, la utilizacion de sondas reticulables en los ensayos de hibridacion de acidos nucleicos para reticular secuencias diana es conocida en la tecnica anterior. Por ejemplo, se describen compuestos basados en furocumarina o psoraleno unidos a moleculas de acidos nucleicos a traves de la formacion de aductos en la patente de EE.UU. No. 4.826.967 y la patente de EE.UU. No. 5.082.934, describen un analogo de nucleosido fotoactivable que comprende un resto de cumarina unido a traves de su anillo de fenilo a la posicion 1 de un resto de un azucar ribosa o desoxirribosa en ausencia de un resto de base intermedio.
Los analogos y mimeticos de acidos nucleicos tienen estructuras quimicas similares a las moleculas de acido nucleico nativas pero con modificaciones unicas. Los analogos de acidos nucleicos, tales como los acidos nucleicos bloqueados (LnA), acidos nucleicos peptidicos (PNA), y morfolinos, mejoran las capacidades de las moleculas de acido nucleico tradicionales mas alla de las limitaciones asociadas con la quimica estandar de los acidos nucleicos (Karkare S y Bhatnagar D. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006 71:575-586.) Dichos analogos de acidos nucleicos expanden y mejoran en gran medida las capacidades para detectar e identificar secuencias de acidos nucleicos relacionadas.
En algunos aspectos, una molecula de acido nucleico aislada de la presente invencion comprende ademas uno o mas nucleotidos heterologos. La expresion "nucleotidos heterologos" en el presente documento se refiere a un nucleotido o nucleotidos que no son una parte natural de la molecula de acido nucleico aislada, pero que estan unidos de forma natural o artificial a la molecula de acido nucleico aislada. Se incluyen entre los ejemplos de secuencia de acido nucleico heterologa, sin constituir limitacion, una secuencia vector, una secuencia que es complementaria a una secuencia de bases de una sonda de purificacion, y una secuencia que comprende uno o mas sitios de enzimas de restriccion.
En una realizacion, el nucleotido o nucleotidos heterologos comprenden una secuencia que es complementaria a una secuencia de bases de una sonda de purificacion. La sonda de purificacion puede estar unida a soportes solidos, tales como, por ejemplo, una matriz o particulas libres en solucion. Se incluyen entre los ejemplos no limitantes de un soporte solido nitrocelulosa, nailon, vidrio, poliacrilato, polimeros mezclados, poliestireno, polipropileno silano y particulas con atraccion magnetica. Por ejemplo, la sonda de purificacion, que puede comprender una secuencia de ADN o ARN, se puede marcar con etiquetas de amina o biotina a traves de un agente de reticulacion. Estas sondas de purificacion marcadas con amina o biotina, a continuacion, son susceptibles a estrategias de inmovilizacion y deteccion que permiten interacciones in vitro acido nucleico:acido nucleico o proteina:acido nucleico. Por lo tanto, la hibridacion del segmento heterologo de la molecula de acido nucleico aislada con su secuencia complementaria de bases de la sonda de purificacion puede facilitar la purificacion de muestras de moleculas que hibridan con un segmento de secuencia especifico del virus de la molecula de acido nucleico aislada. La patente de EE.UU. No. 6.534.273, describe un procedimiento para la captura de una molecula de acido nucleico diana en una muestra sobre un soporte solido.
En una realizacion, las moleculas de acido nucleico aisladas de la presente invencion se unen a un soporte solido, tal como los descritos anteriormente.
En algunas realizaciones, el nucleotido o nucleotidos heterologos comprenden una o mas secuencias de bases de repeticion, por ejemplo, una o mas secuencias de bases de repeticion que son complementarias a una o mas secuencias de bases de repeticion de la sonda de purificacion. Una secuencia de bases de repeticion puede ser una secuencia de bases de repeticion regular, tales como las formadas, por ejemplo, por homopolimeros de acidos nucleicos de poli-adenina (An), poli-timina (Tn), poli-citosina (Cn), poli-(guanina Gn), y poli-uridina (Un). Las secuencias de repeticion tambien pueden incluir polimeros mezclados, tales como repeticiones de AT ([AT]n), y similares.
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El numero de bases de la secuencia de bases de repeticion del nucleotido o nucleotidos heterologos de la molecula de acido nucleico aislada puede ser igual, mayor, o menor que el numero de bases de la secuencia de bases de repeticion de la sonda de purificacion. Las longitudes de las secuencias de repeticion complementarias pueden determinar la temperatura de fusion (Tf) del segmento heterologo:complejo de sonda de purificacion. En una realizacion, la secuencia de bases de repeticion del segmento heterologo es mas larga que la secuencia de bases de repeticion complementaria de la sonda de purificacion. En otra realizacion, la secuencia de bases de repeticion del segmento heterologo o la sonda de purificacion pueden ser, como minimo, de aproximadamente 5 bases de longitud, ilustrativamente, de aproximadamente 5 a aproximadamente 40, de aproximadamente 10 a aproximadamente 30, o de aproximadamente 15 a aproximadamente 20, y similares.
En otras realizaciones, el nucleotido o nucleotidos heterologos comprenden una secuencia de control unida de forma funcional. En una realizacion, la secuencia de control es una secuencia potenciadora o promotora que es reconocida especificamente por una ARN polimerasa que se une a esa secuencia e inicia la transcripcion para producir transcritos de aRn. Se incluyen entre los ejemplos no limitantes de promotores reconocidos por una ARN polimerasa promotores tales como T3, T7, o SP6. Por lo tanto, una molecula de acido nucleico aislada se puede utilizar en una variedad de ensayos basados en acidos nucleicos, incluyendo ensayos que utilizan una ARN polimerasa para producir multiples transcritos de ARN, tales como, por ejemplo, el ensayo de amplificacion mediada por transcripcion (TMA), tal como se describe en Nature 350: 91-92 (1991) y la patente de EE.UU. No. 5.399.491.
En una realizacion, las secuencias de acido nucleico aisladas de la presente invencion estan marcadas, por ejemplo, marcadas de forma radiactiva, quimioluminiscente, fluorescente, fosforescente o con colorantes infrarrojos o con una etiqueta Raman de superficie aumentada o particula de resonancia de plasmon (PRP). Por ejemplo, las modificaciones de nucleotidos incluyen la adicion de acridina o derivados de la misma, Acrydite®, amina, biotina, BHQ-1®, BHQ-2®, BHQ-3®, dNTP de borano, espaciadores de carbono (por ejemplo, C3, C6, C7, C9, C12 o C18), azul cascada, colesterol, cumarina o derivados de la misma, Cy3®, Cy3.5®), Cy5®, Cy5.5®, Cy7® DABCYL, dansilcloruro, digoxigenina, dinitrofenilo, biotina dual, EDANS, 6-FAM, fluoresceina, 3'-glicerilo, HEX, IAEDANS, dA invertido, dG invertido, dC invertido, dG invertido, IRD-700, IRD- 800, JOE, Azul La Jolla, agrupaciones de metales, tales como nanoparticulas de oro, acido fenilboronico, fosfato psoraleno, 3'-fosforilacion o 5'-fosforilacion, pireno, 3' ribo- adenosina, 3' ribo-guanosina 3' ribo-citidina, (LC)Red640, (LC)Red705, rodamina, ROX, tiol (SH), espaciadores,
Pacific Blue®, QSY7®, Rhodamine Green®
TAMRA, TET, AMCA-S®, SE, BODIPY®, Marina Blue®, Oregon Green®
® ® ®
Rhodamine Red , Rhodol Green , tetrametilrodamina, Texas Red , modificador de NH2 Uni-Link, marcadores
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radiactivos (por ejemplo, I, I, S, C, P, P, H) y nanoparticulas. Un experto en la materia conoce diversas tecnicas de marcaje.
Las etiquetas pueden estar unidas directamente o indirectamente a la molecula de acido nucleico aislada. El marcaje de un acido nucleico se puede llevar a cabo mediante la union covalente de un grupo detectable (etiqueta), por ejemplo, a una posicion interna o bien a una terminal. Un experto en la materia conoce que existen diversas formas para derivatizar oligonucleotidos con funcionalidades reactivas que permiten la adicion de una etiqueta. Estan disponibles varias estrategias para unir etiquetas directamente a moleculas de acido nucleico y para biotinilar sondas de manera que se pueden unir etiquetas radiactivas, fluorescentes, quimioluminiscentes, enzimaticas, o electrodensas a traves de la avidina. Se incluyen entre los ejemplos no limitativos de referencias que describen etiquetas y procedimientos de marcaje de acidos nucleicos la patente de EE.UU. No. 4.605.735, la patente de EE.UU. No. 4.757.141; la patente de EE.UU. No. 6.965.020; Nucl. Acids Res. 5:363 (1978); Nucl. Acids Res. 13: 1529 (1985); Nucl. Acids Res. 15:3131 (1987); Nucl. Acids Res. 15:6455 (1987); Nucl. Acids Res. 13:4485 (1985); Nucl. Acids Res. 15:4837 (1987), y Anal. Biochem. 169:1-25 (1988).
En algunas realizaciones, las moleculas de acido nucleico aisladas estan marcadas para procedimientos de deteccion que utilizan transferencia de energia por resonancia de fluorescencia (FRET). La FRET utiliza dos colorantes, un colorante donador y un aceptor. La FRET puede ser detectada tanto por la fluorescencia del colorante aceptor ("fluorescencia sensibilizada") si dicho aceptor es fluorescente de por si, o por extincion de la fluorescencia del colorante donador si dicho aceptor es un colorante no fluorescente de extincion. La FRET se puede retrasar si el colorante donador libera su fluorescencia con el tiempo. Este proceso se denomina "TR-FRET" o "FRET resuelta en el tiempo". Los colorantes donador y aceptor tambien pueden ser los mismos, en cuyo caso la FRET se detecta por la despolarizacion de la fluorescencia resultante. Los colorantes tambien se pueden acoplar covalentemente para formar un colorante fluorescente en tandem o colorante en tandem o conjugado en tandem. Por ejemplo, un unico colorante donador es entonces capaz de excitar dos colorantes aceptores simultaneamente, dando lugar a la emision de luz de multiples longitudes de onda. Preferentemente, el perfil de longitudes de onda de la emision del donador debe superponerse, como minimo, parcialmente con el perfil de longitudes de onda de absorcion del aceptor.
Se incluyen entre los colorantes fluorescentes que se pueden utilizar, sin constituir limitacion, BODIPY FL, Cy3®, Cy3.5®, Cy5.RTM., Cy5.5®, EDANS, FAM, fluoresceina, HEX, IAEDANS, JOE, Oregon Green®, (LC)Red640, (LC)Red705, ROX, TaMrA, TET, tetrametilrodamina y Texas Red®.
Entre los colorantes de extincion se incluyen, sin constituir limitacion, BHQ-1®, BHQ-2®, BHQ-3®, DABCYL, agrupaciones de metales, tales como nanoparticulas de oro y QSY7®.
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Entre los pares donador/aceptor que se pueden utilizar se incluyen, sin constituir limitacion, FAM/BHQ-1, TET/BHQ- 1, JOE/BHQ-1, HEX/BHQ-1, Oregon Green/BHQ-1, TAMRA/BHQ -2, ROX/BHQ-2, Cy3/BHQ-2, Cy3.5/BHQ-2, Texas Red/BHQ-2, Texas Red/BHQ-2, Cy5/BHQ-3, Cy5.5/BHQ-3, fluoresceina/tetrametilrodamina, fluoresceina/fluoresceina, fluoresceina/QSY7, fluoresceina/LC Red640, fluoresceina/LC Red705, IAEDANS/fluoresceina, EDANS/DABCYL, y BODIPY FLI/BODIPY FL.
Tambien se describe una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos, tal como se indica en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3, o un complemento de las mismas, en la que la molecula de acido nucleico comprende ademas una etiqueta detectable.
En algunas realizaciones, la etiqueta detectable se corresponde con un par donador/aceptor adecuado para la deteccion utilizando FRET.
En otras realizaciones, el par donador/aceptor es FAM/BHQ-1.
En aun otras realizaciones, la presente invencion da a conocer una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos, tal como se indica en la SEQ ID NO: 3, en la que la molecula de acido nucleico comprende FAM en el extremo 5' y BHQ-1 en el extremo 3'.
En otras realizaciones, las moleculas de acido nucleico de la presente invencion pueden proporcionar la utilizacion simultanea de dos o mas sondas que utilizan la transferencia de energia donador-aceptor mediante la cual, por ejemplo, se preparan balizas moleculares que poseen fluoroforos de diferentes colores, lo que permite que se lleven a cabo ensayos de forma simultanea para detectar diferentes dianas en la misma reaccion. Por ejemplo, los ensayos multiples pueden contener varios conjuntos de cebadores diferentes, permitiendo cada conjunto la amplificacion de una secuencia de gen unica a partir de un VHA diferente, y puede estar presente un numero correspondiente de balizas moleculares, conteniendo cada una una secuencia de sonda especifica para uno de los amplicones, y cada una marcada con un fluoroforo de un color diferente. El color de la fluorescencia resultante, si existe, identifica el VHA en la muestra, y el numero de ciclos de amplificacion requerido para generar fluorescencia detectable proporciona una medida cuantitativa del numero de organismos diana presentes. Si esta presente mas de un tipo de VHA en la muestra, los colores fluorescentes que se producen identifican cuales son los que estan presentes.
En otros aspectos, la presente invencion da a conocer una composicion que comprende una o mas de las moleculas de acido nucleico aisladas de la presente invencion. En algunas realizaciones, la composicion es una solucion tamponada. En otras realizaciones, la composicion esta liofilizada.
En una realizacion, la composicion comprende un par de cebadores que tienen la secuencia, tal como se indica en (SEQ ID NO: 1 / SEC ID NO: 2).
En una realizacion, la composicion comprende, ademas, una sonda que tiene la secuencia, tal como se indica en la SEC ID NO: 3, o un complemento de la misma.
En otra realizacion, se da a conocer una composicion que comprende un primer, un segundo, y/o un tercer par de cebadores, en la que el primer par de cebadores tiene la secuencia, tal como se indica en (SEQ ID NO: 1 / SEC ID NO: 2). En una realizacion, la composicion comprende, ademas, una primera, una segunda, y/o una tercera sonda, en la que la primera, la segunda y/o la tercera sonda comprenden cada una una etiqueta detectable adecuada para su utilizacion en una PCR multiple en tiempo real.
En otras realizaciones, la composicion comprende un par de cebadores que tienen la secuencia, tal como se indica en (SEQ ID NO: 1 / SEC ID NO: 2) y una sonda que tiene la secuencia, tal como se indica en la SEQ ID NO: 3, o un complemento de la misma.
En una realizacion, la composicion comprende, ademas de la molecula o moleculas de acido nucleico de la presente invencion, reactivos adicionales, tales como ADN polimerasa, cofactores, y desoxirribonucleosido-5'-trifosfatos en concentraciones adecuadas para obtener una amplificacion del acido nucleico diana. A modo de ejemplo, en algunas realizaciones, en las que la composicion es una solucion de PCR, la cantidad minima de ADN polimerasa puede ser, como minimo, de aproximadamente 0,5 unidades/100 pl de solucion, de manera ilustrativa, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 25 unidades/100 pl de solucion y de aproximadamente 7 a aproximadamente 20 unidades/100 pl de solucion. Otras cantidades pueden ser utiles para una reaccion o sistema de amplificacion dados. La "unidad" se puede definir como la cantidad de actividad enzimatica requerida para incorporar 10 nmoles de nucleotidos totales (dNTP) en una cadena de acido nucleico que se extiende en 30 minutos a 74°C. A modo de otro ejemplo, en otras realizaciones, la cantidad de cada cebador utilizado en la amplificacion puede ser, como minimo, de aproximadamente 0,075 pmolar, ilustrativamente, de aproximadamente 0,075 a aproximadamente 2 pmolar, pero pueden ser utiles otras cantidades para una reaccion o sistema de amplificacion dados. A modo de otro ejemplo adicional, en algunas realizaciones, la cantidad de cada dNTP en la solucion puede ser de aproximadamente 0,25 a aproximadamente 3,5 mmolar, pero otras cantidades pueden ser utiles para una
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reaccion o sistema de amplificacion dados.
En otros aspectos, la presente invencion da a conocer un procedimiento de amplificacion de una secuencia diana correspondiente a un VHA, tal como se define en la reivindicacion 4.
Por ejemplo, llevar a cabo una PCR con la secuencia diana y, como minimo, un cebador directo y un cebador inverso, cada uno capaz de hibridar con la secuencia diana en una condicion adecuada de PCR, puede proporcionar la amplificacion de la secuencia diana.
En una realizacion, la presente invencion da a conocer un procedimiento de amplificacion de una secuencia diana, comprendiendo el procedimiento: llevar a cabo una PCR con la secuencia diana como plantilla, en la que la realizacion comprende proporcionar a la PCR un cebador directo que comprende la secuencia, tal como se indica en la SEQ ID NO: 1 y un cebador inverso que comprende la secuencia, tal como se indica en la SEQ ID NO: 2. En una realizacion, la secuencia diana corresponde a ADNc preparado a partir de ARN de una muestra que comprende un VHA.
En otros aspectos, la presente invencion da a conocer un procedimiento para la determinacion del VHA en una muestra. Por ejemplo, la muestra puede comprender ARN de VHA o la muestra puede ser una muestra en la que se tiene que determinar la presencia o ausencia de VHA.
En una realizacion, la presente invencion da a conocer un procedimiento para la determinacion de VHA en una muestra, comprendiendo el procedimiento:
a. llevar a cabo una PCR con una plantilla de acido nucleico en la muestra utilizando un cebador directo que comprende la secuencia, tal como se indica en la SEQ ID NO: 1 y un cebador inverso que comprende la secuencia, tal como se indica en la SEQ ID NO: 2; y
b. detectar un amplicon generado por el cebador directo y el cebador inverso, en el que la presencia del amplicon determina el VHA en la muestra.
En una realizacion, la plantilla es un ADNc preparado a partir de ARN de una muestra que comprende un VHA.
La etapa de deteccion se puede llevar a cabo mediante diversas tecnicas conocidas para un experto en la materia. En una realizacion, el amplicon se puede detectar utilizando una sonda que esta marcada para su deteccion y se puede hibridar directa o indirectamente con el amplicon. La sonda puede ser soluble o puede estar unida a un soporte solido.
En una realizacion, la sonda comprende una etiqueta detectable que corresponde a un par donador/aceptor adecuado para la deteccion mediante la utilizacion de FRET, en la que la sonda comprende una secuencia, tal como se indica en la SEC ID NO: 3, o un complemento de la misma. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el par donador/aceptor es FAM/BHQ-1.
En otra realizacion, uno o mas de los cebadores utilizados para amplificar el acido nucleico diana puede estar marcado, por ejemplo, con una fraccion de union especifica. El producto de extension del cebador resultante, en el que se ha incorporado el cebador marcado puede ser capturado con una sonda. La deteccion de la diana amplificada hibridada con la sonda puede conseguirse mediante la deteccion de la presencia de la sonda marcada o de la diana amplificada marcada utilizando equipos y procedimientos de deteccion adecuados que son muy conocidos en la tecnica.
En otras realizaciones, uno o mas de los cebadores utilizados para amplificar el acido nucleico diana esta marcado con biotina y los acidos nucleicos diana amplificados biotinilados se hibridan a sondas unidas a un soporte solido. Las dianas unidas son detectadas, a continuacion, poniendolas en contacto con un conjugado de estreptavidina- peroxidasa en presencia de un oxidante, tal como peroxido de hidrogeno, y una composicion formadora de colorante adecuada.
Son conocidas otras tecnicas por un experto en la materia para la deteccion que incluyen, sin constituir limitacion, procedimientos que implican transferencia Southern, tecnicas de transferencia de puntos, o deteccion por captura no isotopica con una sonda marcada.
En otras realizaciones, la presente invencion da a conocer un procedimiento para la determinacion de VHA en una muestra, comprendiendo el procedimiento:
a. llevar a cabo una unica PCR con la muestra, comprendiendo la PCR un cebador directo que comprende la secuencia, tal como se indica en la SEQ ID NO: 1 y un cebador inverso que comprende la secuencia, tal como se indica en la SEQ ID NO: 2; y
b. detectar un amplicon generado por los cebadores directo e inverso, en el que la presencia del amplicon determina la presencia de VHA en la muestra.
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En una realizacion, la etapa de deteccion comprende incluir en la PCR una sonda de oligonucleotidos que comprende una etiqueta detectable que corresponde a un par donador/aceptor adecuado para la deteccion utilizando FRET, en el que la sonda comprende una secuencia, tal como se indica en la SEC ID NO: 3, o un complemento de la misma. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el par donador/aceptor es FAM/BHQ-1.
Por lo tanto, las moleculas de acido nucleico de la presente invencion pueden utilizarse solas o en combinacion en diversos procedimientos de amplificacion y/o determinacion de VHA. Por consiguiente, en algunas realizaciones, las composiciones, procedimientos y kits de la presente invencion dan a conocer un ensayo de PCR, un ensayo de PCR en tiempo real, y/o un ensayo de PCR multiple en tiempo real, en el que en funcion del tipo de ensayo, el ensayo puede comprender uno, dos, tres o mas conjuntos de cebadores y sondas de la misma mezcla maestra de PCR. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un ensayo de PCR multiple en tiempo real puede detectar genotipos de VHA diferentes utilizando un solo ensayo. En este sentido, los cebadores y sondas son capaces de interactuar solamente con sus dianas especificas y no con otros cebadores y sondas presentes en la mezcla maestra (por ejemplo, no forman cebadores dimeros) proporcionando de este modo una amplificacion de la diana y deteccion por PCR eficientes, por ejemplo, PCR multiple.
En otros aspectos, los cebadores/sondas de la presente invencion se pueden utilizar en procedimientos cuantitativos. La cuantificacion del VHA puede ser, por ejemplo, mediante procedimientos semicuantitativos o cuantitativos, tales como los conocidos por un experto en la materia.
En una realizacion, se pueden generar resultados semicuantitativos de RT-PCR mediante el muestreo de la mezcla de reaccion de RT-PCR seguido, por ejemplo, de analisis de transferencia de puntos.
En otra realizacion, los procedimientos cuantitativos pueden utilizar tecnicas de RT-PCR no competitivas o competitivas.
La RT-PCR no competitiva puede incluir, por ejemplo, la coamplificacion del ARN de VHA diana con una segunda molecula de ARN bajo concentraciones de reactivos y condiciones de manera que no haya competencia entre la diana y el estandar, y con la que no comparte ni los sitios de reconocimiento del cebador, ni ninguna secuencia interna.
En la RT-PCR competitiva, el estandar interno comparte el mismo sitio de reconocimiento del cebador y las secuencias internas con la diana primaria, lo que conduce a la competencia por los reactivos. Ambos se pueden amplificar con la misma o sustancialmente la misma eficacia y sus amplicones se pueden distinguir mediante la adicion de una enzima de restriccion para el estandar, mediante la variacion de su tamano, etc. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una serie de tubos de PCR que contienen el ARN de VHA diana se tratan con diluciones seriadas de numeros de copia del estandar interno conocidos. Cuanto mayor es la concentracion del estandar interno, es mas probable que los cebadores se unan y lo amplifiquen, en lugar de la diana. Una comparacion de las intensidades de amplicones estandar tenidos con bromuro de etidio y dianas, por ejemplo, seguido de una electroforesis en gel, permite la cuantificacion de la diana.
En una realizacion, el procedimiento puede implicar la adicion de cantidades conocidas de competidores amplificables por RT-PCR a las muestras de ARN de VHA antes de la RT, que, preferentemente, son moleculas sinteticas de ARN de VHA.
En otra realizacion, la presente invencion da a conocer un ensayo de PCR en tiempo real cuantitativo, por ejemplo, un ensayo de PCR de punto final seguido por la deteccion con la secuencia de la sonda que se describe en el presente documento mediante la utilizacion de deteccion por transferencia Southern, transferencia de puntos, fluorescente, o colorimetrica o de otros procedimientos cualitativos o cuantitativos conocidos para la deteccion del acido nucleico.
En otros aspectos, la presente invencion da a conocer un kit que comprende las moleculas de acido nucleico aisladas, que incluye los cebadores y sondas de la presente invencion. El kit se puede desarrollar utilizando las secuencias de acidos nucleicos descritas en el presente documento. Estas secuencias se pueden utilizar como cebadores en reacciones de amplificacion de acidos nucleicos, y/o como sondas en un procedimiento de hibridacion de acidos nucleicos. Los kits son utiles para la determinacion de la presencia de un acido nucleico de VHA en una muestra. Los componentes en el kit se pueden obtener comercialmente o bien se pueden preparar segun procedimientos muy conocidos en la tecnica. Ademas, los componentes del kit pueden estar en solucion o liofilizados, segun sea apropiado. En una realizacion, los componentes estan en el mismo compartimento, y en otra realizacion, los componentes estan en compartimentos separados. En algunas realizaciones, el kit comprende ademas instrucciones para su utilizacion.
En una realizacion, el kit comprende un cebador directo, un cebador inverso, y una sonda, en el que el cebador directo comprende una secuencia de acido nucleico de cebador directo, tal como se indica en (SEC iD NO: 1), en el que el cebador inverso comprende una secuencia de acido nucleico de cebador inverso, tal como se indica en (SEQ ID NO: 2), en el que la sonda comprende una secuencia de acido nucleico de sonda, tal como se indica en (SEQ ID
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NO: 3), o un complemento de las mismas.
Los siguientes ejemplos se presentan solo a modo de ilustracion.
EJEMPLOS Ejemplo 1
Determinacion de VHA mediante RT-PCR
Para determinar la presencia de ARN de VHA en una muestra de plasma, se llevo a cabo un ensayo de RT-PCR.
Se utilizaron los cebadores y la sonda de deteccion que tenian las siguientes secuencias:

Cebador directo: 5'-GCG CCC GGC GGG GTC AAC TCC AT-3' (SEC ID NO: 1);

Cebador inverso: 5'-AGC CAA GTT AAC ACT GCA AGG-3' (SEC ID NO: 2);

Sonda: 5'-TTA GCA TGG AGC TGT AGG AGT CTA AAT TGG GG -3' (SEC ID NO: 3).
La sonda se marco con FAM en el extremo 5' y con BHQ-1 en el extremo 3'.
Se preparo una mezcla madre maestra de RT-PCR (MMX) que comprendia lo siguiente: 2x mezcla de reaccion de PCR de Invitrogen; 400 pM de dNTP, 4,0 mM de MgCb; 1x colorante de referencia ROX (0,5 pM); 400 nM de cebador directo; 400 nM de cebador inverso; 50 nM de sonda; 100 nM de la sonda de Control Interno; 1 pl / 50 pl de reaccion de PCR de Transcriptasa Inversa de Una Etapa SSIII de Invitrogen (RT) y mezcla de Taq ADN polimerasa (Invitrogen, Carlsbad, CA).
La MMX se combino con ARN viral aislado a partir de muestras de plasma que contienen el virus utilizando un procedimiento de extraccion de virus conocido en la tecnica. El ARN de HAV / MMX combinado se sometio a una PCR de una etapa, en la que la transcripcion inversa, la amplificacion de ADNc, y la deteccion ocurrieron en el mismo tubo, utilizando un instrumento de PCR en tiempo real comercial (Applied Biosystems 7300). Las condiciones de ciclaje termico se muestran en la tabla 1:
Tabla 1: PCR condiciones de ciclaje.
Temperatura
Tiempo Ciclos
55°C
30 min 1
95°C
3 min 1
95°C
15 s 45
56°C
1min
Despues de la amplificacion por PCR, se analizaron las senales generadas utilizando el programa del instrumento. Los resultados mostraron curvas de amplificacion fuertes.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Grifols Therapeutics Inc. Burde, Stefan Buno,
Brett Wronska, Danuta
<120> PROCEDIMIENTOS, COMPOSICIONES Y KITS PARA LA DETERMINACION DEL VIRUS DE LA HEPATITIS A
<130> T126 2200WO
<150> US 61/531,818 <151 >
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211> 23 <212> DNA
<213> Secuencia artificial
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<223> Virus de la Hepatitis A <400> 1
gcgcccggcg gggtcaactc cat 23
<210> 2 <211> 21 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Virus de la Hepatitis A <400> 2
agccaagtta acactgcaag g 21
<210> 3 <211> 32 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Virus de la Hepatitis A <400> 3
ttagcatgga gctgtaggag tctaaattgg gg 32

Claims (9)

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    REIVINDICACIONES
    1. Molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos, o un complemento de la misma, tal como se indica en:
    5'-GCG CCC GGC GGG GTC AAC TCC AT-3' (SEC ID NO: 1);
    5'-AGC CAA GTT AAC ACT GCA AGG-3' (SEC ID NO: 2), o
    5'- TTA GCA TGG AGC TGT AGG AGT CTA AAT TGG GG-3' (SEC ID NO: 3).
  2. 2. Composicion que comprende un par de cebadores de oligonucleotidos que comprende un cebador directo que tiene una secuencia, tal como se indica en la SEC ID NO: 1 y un cebador inverso que tiene una secuencia, tal como se indica en la SEC ID NO: 2, en la que el par de cebadores es capaz de hibridarse con una secuencia diana en condiciones de PCR para amplificar la secuencia diana.
  3. 3. Composicion, segun la reivindicacion 2, que ademas comprende una sonda de oligonucleotidos que tiene la secuencia, tal como se indica en la SEC ID NO: 3, en la que la sonda es capaz de hibridarse con la secuencia diana.
  4. 4. Procedimiento de amplificacion de una secuencia diana, comprendiendo el procedimiento:
    llevar a cabo una PCR con la secuencia diana como plantilla, en el que la realizacion comprende proporcionar a la PCR un cebador directo que comprende la secuencia, tal como se indica en la SEC ID NO: 1 y un cebador inverso que comprende la secuencia, tal como se indica en la SEC ID NO: 2.
  5. 5. Procedimiento, segun la reivindicacion 4, en el que la secuencia diana corresponde a un ADNc preparado a partir de ARN de una muestra que comprende un VHA.
  6. 6. Procedimiento para la determinacion de VHA en una muestra, comprendiendo el procedimiento:
    a. llevar a cabo una PCR con una plantilla de acido nucleico en la muestra utilizando un cebador directo que comprende la secuencia, tal como se indica en la SEC ID NO: 1 y un cebador inverso que comprende la secuencia, tal como se indica en la SEC ID NO: 2, y
    b. detectar un amplicon generado por el cebador directo e inverso, en el que la presencia del amplicon determina si el VHA esta presente en la muestra.
  7. 7. Procedimiento, segun la reivindicacion 6, en el que la deteccion comprende proporcionar una sonda de polinucleotidos a la PCR mediante la cual el amplicon, si esta presente, se pone en contacto con la sonda, en el que la sonda comprende la secuencia, tal como se indica en la SEC ID NO: 3 o un complemento de la misma.
  8. 8. Procedimiento, segun la reivindicacion 7, en el que la sonda esta marcada con FAM/BHQ-1.
  9. 9. Kit que comprende una o mas de las moleculas de acido nucleico aisladas, segun la reivindicacion 1.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4415732A (en) 1981-03-27 1983-11-15 University Patents, Inc. Phosphoramidite compounds and processes
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4757141A (en) 1985-08-26 1988-07-12 Applied Biosystems, Incorporated Amino-derivatized phosphite and phosphate linking agents, phosphoramidite precursors, and useful conjugates thereof
US4826967A (en) 1987-06-16 1989-05-02 Naxcor Psoralen-nucleoside adducts and method for their preparation
US5082934A (en) 1989-04-05 1992-01-21 Naxcor Coumarin derivatives for use as nucleotide crosslinking reagents
CA2020958C (en) 1989-07-11 2005-01-11 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification methods
EP0672175A4 (en) * 1991-12-23 1997-08-06 Chiron Corp HAV PROBES USED IN SOLUTION PHASE SANDWICH HYBRIDIZATION METHODS.
US6965020B2 (en) 1996-01-23 2005-11-15 Affymetrix, Inc. Nucleic acid labeling compounds
US6534273B2 (en) 1997-05-02 2003-03-18 Gen-Probe Incorporated Two-step hybridization and capture of a polynucleotide
WO2003030624A2 (en) * 2001-10-12 2003-04-17 Chiron Corporation Hepatitis a virus nucleotide sequences, recombinant proteins and uses thereof
ES2402925T3 (es) 2002-06-12 2013-05-10 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Identificación de oligonucleótidos para la captura, detección y cuantificación de ácidos nucleicos del virus de la hepatitis A
EP2412830B1 (en) * 2004-07-13 2014-11-19 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detection of Hepatitis A virus nucleic acid
DE102006034844B3 (de) * 2006-07-27 2007-12-06 DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg-Hessen gGmbH Zusammensetzungen und Verfahren zur Amplifikation von Hepatitis A-Viren (HAV) und/oder Parvoviren B19 (PB19) mittels Multiplex-PCR
RU2011132045A (ru) * 2008-12-31 2013-02-10 Эбботт Лэборетриз Праймеры и зонды для детектирования вируса гепатита с

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