JP2012512637A - 細胞アッセイを行うための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
製薬産業内には、低温保存に使用することも、そして続いてスクリーニング目的に使用することもどちらも可能な容器中で細胞を凍結保存する必要がある;したがって、容器はゼロ未満の温度で保存され、そして単にフリーザーから取り出して、細胞が融解し、そしてHTSで直接用いられるのを可能にするであろう。現在、細胞は、一般的に、バイアル(例えばクライオバイアル)中で凍結保存され、そしてこれらのバイアル中、低温で、試験のために必要とされるまで保存される;次いで、細胞は次第に再構成され/融解され、緩衝液で洗浄され、そしてHTSでの試験/アッセイの準備が出来た形で、培養ディッシュまたはマイクロウェルプレートに移される。現時点では、細胞は、融解の際の死亡率が高いことおよびアッセイ反応における変動が大きいことの両方のために、培養ディッシュまたはマイクロウェルプレート中で凍結保存されることが不可能である。後者は、こうしたアッセイで得られるZ因子が低いことから明らかである。同じ容器または器の中で、細胞を凍結保存し、そして再構成された細胞に対してアッセイを行うことが可能であれば、製薬産業にとって役に立つ技術が提供されるであろう。
本発明の別の側面において、細胞培養表面上で凍結される細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、両生類細胞、魚類細胞、爬虫類細胞および鳥類細胞からなる群より選択される。好ましくは細胞は哺乳動物細胞である。より好ましくは、細胞は、CHO細胞(供給源:ECACC−85050302)、HEK293細胞(供給源:ATCC−CRL1573)およびAD293細胞(供給源:Invitrogen R705−07)からなる群より選択される。
a)細胞を含有する培地を容器表面に添加して、該細胞が該表面に付着して、そして細胞培養を形成するのを可能にし、
b)凍結保存培地を添加し、そして
c)該細胞培養の温度を−20℃以下に下げる
工程を含み;
工程a)の前に表面をポリリジンでコーティングする、前記方法を提供する。
本発明のさらに別の側面において、細胞培養系の表面上で凍結される細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、両生類細胞、魚類細胞、爬虫類細胞および鳥類細胞からなる群より選択される。好ましくは細胞は哺乳動物細胞である。より好ましくは、細胞は、CHO細胞、HEK293細胞およびAD293細胞からなる群より選択される。
さらなる側面において、ポリリジンは、ポリD−リジン、ポリL−リジンおよびその混合物からなる群より選択される。
本発明のさらに別の側面において、細胞培養容器は、器、バイアル、マイクロタイタープレートおよび細胞培養プレートからなる群より選択される。
以下の用語は、本発明の背景で理解されるものとする:
細胞アッセイ・・・化合物の作用によって誘発される細胞プロセスを調べるための方法または試験、および細胞アウトプットを測定する手段。こうしたアッセイは,特に、薬剤スクリーニングにおいて役立つ。当業者には、細胞死または生存度はこの定義内には含まれないことが理解されるであろう。
凍結保存培地・・・ときに、「細胞凍結培地」と称され、凍結保存または凍結中の細胞損傷または傷害を減少させる試薬または組成物を含有する任意の培地である。こうした凍結保存培地の例には、限定されるわけではないが、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ウシ胎児血清、グリセロール、ダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)、トレハロースおよびその混合物が含まれる。
これは本質的に、+アゴニスト(刺激)アッセイの平均を−アゴニスト(刺激)アッセイの平均で割ったものである。
この式は、シグナルおよびバックグラウンドアッセイ両方で観察された標準偏差を考慮に入れる。これはアッセイ性能の指標である。
これは、一般的に、アッセイ性能を評価するため製薬産業によって用いられる。統計において、Z因子は、ハイスループットスクリーニングアッセイの品質または強度の測定値である。式には、+および−アゴニストアッセイの平均および標準偏差が含まれる。値が1により近づくほど、性能がより優れている。細胞に基づくアッセイにおいて、>0.40が一般的に優れていると見なされ、一方、0.5以上の値は優秀であると見なされる(Zhangら(1999) A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.(J Biomol Screen., 4 (2) 67−73)。
i)特に長期凍結保存後および多数回の洗浄工程を通じた、HEK293細胞接着の促進および維持。ポリリジンが仲介する細胞付着は、HEK293細胞に関してよく確立された現象であり;実際に、細胞接着の増加は、ポリリジンの主な細胞生物学的用法の1つである。
細胞培養表面上で凍結される細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、両生類細胞、魚類細胞、爬虫類細胞および鳥類細胞からなる群より選択される。好ましくは細胞は哺乳動物細胞であり;より好ましくは、CHO細胞、HEK293細胞およびAD293細胞からなる群より選択される哺乳動物細胞である。
HeLa 黒人系子宮頸部腺癌(ヒト)
HEK 293 胚性腎臓(ヒト)
1321−N1 脳星状細胞腫(ヒト)
U−2 OS 骨骨肉腫細胞(ヒト)
Huh−7 肝細胞腫(ヒト)
K−562 リンパ芽球(慢性骨髄性白血病)(ヒト)
HepG2 肝細胞癌(ヒト)
Hep3B 肝細胞癌腫(ヒト)
BJ 包皮線維芽細胞(ヒト)
CACO2 結腸直腸腺癌(ヒト)
MCF7 ヒト乳腺癌(ヒト)
SwissおよびNIH 3T3 胚線維芽細胞(マウス)
COS−1および−7 SV40形質転換腎細胞株(アフリカミドリザル(African green monkey))
CHO(CHO−K1) チャイニーズハムスター卵巣細胞(ハムスター)
b.代表的な初代細胞
HUVEC 臍帯静脈内皮細胞(ヒト)
MHEpC 乳腺上皮細胞(ヒト)
HTEpC 気管上皮細胞(ヒト)
HAOEC 大動脈内皮細胞(ヒト)
PBMC 末梢血単核細胞(ヒト)
c.代表的な幹/前駆細胞
hESC−BG01V 胚性幹細胞株(ヒト)
ES−C57BL/6 胚性幹細胞株(マウス)
MLPC 臍帯血多細胞系譜前駆細胞(ヒト)
d.代表的な癌細胞
NTERA 1および2 精巣胚性癌細胞(ヒト)
低分子量ポリリジン(Mr=30,000〜70,000kD)は、溶液中でより粘性が低いため使用しやすいが、より高分子量の>300,000kDのものは、分子あたり、より優れた細胞付着を提供する。細胞生物学において一般的に使用するためのポリリジンの分子量は、典型的には、70,000〜150,000kDの範囲である。
ポリD−リジン臭化水素酸塩(Sigma、P7405、>300kまたはP6407、70〜150k)−ポリD−リジンを滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中、1mlあたり100ngの濃度に溶解する。アリコット(50μl)を細胞培養96ウェルプレートのウェルに分配する。これを室温(典型的には25℃)で30分間インキュベーションする。この時間の後、いかなる過剰なポリD−リジン溶液もデカントし、そしてウェルを無菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(200μl)で3回洗浄する。
2.凍結保存
“Cells − A laboratory Manual”, Spector D.L., Goldman R.D.およびLeinwand L.A., Cold Spring Harbor laboratory press(1998)に記載されるようなルーチンの細胞培養技術を用いて、細胞を細胞培養容器中で増殖させた。適切な増殖期に、商業的に入手可能なx1トリプシン/EDTA(エチレンジアミン四酢酸)を用いて、細胞培養容器表面から細胞を取り除き、そして適切な細胞培地に再懸濁する。製造者の指示にしたがって、Chemotec Nucleocounterを用いて、細胞数を決定する。
再生(resurrection)に際して、凍結細胞培養プレートを−140℃から取り出し、そして解凍させた。凍結保存培地を取り除き、そして細胞をあらかじめ温めたPBSで2回洗浄した。次いで、適切なアゴニストを補充したアッセイ培地を添加した。使用するレポーター系に関して、最も適切な方法および/または商業的に入手可能なキットを用いて、細胞に基づくアッセイを行った。
細胞付着および形態に対するポリリジンの影響を理解するプロセスにおいて、凍結保存前および保存後、ポリリジンでコーティングされたおよびコーティングされないプレート上で増殖させた細胞の画像を比較した(図1)。
Cell Titer−Glo発光細胞生存度アッセイ(Promega)を用いて、融解後に、ポリリジンコーティングプレート上に植え付けられた細胞株の生存度を決定した。
図2からわかるように、CHO VSV−β2AR−EGFP安定細胞株の場合、CHO細胞をポリリジンとともにまたはポリリジンを含まずにプレーティングした場合、細胞生存度には有意な相違は見られず、ポリリジンが細胞付着を促進せず、または凍結保存を改善しないことが示された。
ポリリジンを含み(+)および含まず(−)、96ウェルプレート中、ウェルあたり20,000細胞で細胞を植え付け、そして一晩付着させ、増殖培地を取り除き、そして凍結培地(90%ウシ胎児血清および10%DMSO)を添加した。プレートを密封し、そして凍結保存した。対照として、伝統的な「クライオバイアル」保存系(Cells − A laboratory Manual, Spector D.L., Goldman R.D.およびLeinwand L.A., Cold Spring Harbor laboratory press(1998))を用いてもまた、細胞を凍結保存した。
DiscoveRx HitHunter cAMP IIアッセイ−製造者の支持にしたがって、これを行い、そして簡潔には、該アッセイには以下を伴った。−140℃での保存からの再生に際して、細胞培養処理96ウェルプレート上で凍結した細胞を融解させた。解凍したら、凍結保存培地を取り除き、そして細胞をPBSで2回洗浄した。次いで、1mM IBMXおよび適切なアゴニストおよび/またはアンタゴニストを補充したアッセイ培地を添加した。
イソプロテレノール Ec50値−i)伝統的なクライオバイアル系を用いて凍結保存されている(そして続いて、±ポリリジンコーティング・アッセイマイクロタイタープレートに移され、そしてアッセイされている)か、またはii)ポリリジンでコーティングされたマイクロタイタープレート上で直接凍結保存され、そしてアッセイされているかいずれかの細胞を用いて行ったアッセイに関して、匹敵するアッセイ性能が示される(図4a)。
イソプロテレノールEc50値−細胞がポリリジンでコーティングされたマイクロタイタープレート上に植え付けられているアッセイに関してのみ、匹敵するアッセイ性能が示される。これには、i)クライオバイアル中で凍結保存され、そして続いてアッセイのために、ポリリジンでコーティングされたプレートに移された細胞、およびii)ポリリジンでコーティングされたプレート中で直接凍結保存された細胞が含まれる(図5a)。
Claims (26)
- 少なくとも表面を有する容器、
前記表面上に支持された凍結細胞
を含む凍結保存細胞培養であって、
表面がポリリジンでコーティングされていることで特徴付けられる、前記細胞培養。 - ポリリジンが、ポリD−リジン、ポリL−リジンおよびその混合物からなる群より選択される、請求項1記載の細胞培養。
- 前記容器が、器、バイアル、マイクロタイタープレートおよび細胞培養プレートからなる群より選択される、先行する請求項いずれか記載の細胞培養。
- 前記細胞が接着細胞である、先行する請求項いずれか記載の細胞培養。
- 前記細胞が、哺乳動物細胞、昆虫細胞、両生類細胞、魚類細胞、爬虫類細胞および鳥類細胞からなる群より選択される、先行する請求項いずれか記載の細胞培養。
- 細胞が哺乳動物細胞である、先行する請求項いずれか記載の細胞培養。
- 前記細胞が、CHO細胞、HEK293細胞およびAD293細胞からなる群より選択される、請求項6記載の細胞培養。
- 細胞培養中の細胞を凍結保存する方法であって:
a)細胞を含有する培地を容器表面に添加して、前記細胞が前記表面に付着して、そして細胞培養を形成するのを可能にし、
b)凍結保存培地を添加し、そして
c)前記細胞培養の温度を−20℃以下に下げる
工程を含み;
工程a)の前に表面をポリリジンでコーティングすることによって特徴付けられる、前記方法。 - ポリリジンが、ポリD−リジン、ポリL−リジンおよびその混合物からなる群より選択される、請求項8の方法。
- 表面をポリリジン溶液で洗浄することによって、表面をコーティングする、請求項8または9記載の方法。
- 容器が、器、バイアル、マイクロタイタープレートおよび細胞培養プレートからなる群より選択される、請求項8〜10のいずれか記載の方法。
- 細胞が接着細胞である、請求項8〜11のいずれか記載の方法。
- 細胞が、哺乳動物細胞、昆虫細胞、両生類細胞、魚類細胞、爬虫類細胞および鳥類細胞からなる群より選択される、請求項8〜12のいずれか記載の方法。
- 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項8〜13のいずれか記載の方法。
- 細胞が、CHO細胞、HEK293細胞およびAD293細胞からなる群より選択される、請求項8〜14のいずれか記載の方法。
- 細胞培養を−80℃未満の温度で保存する工程をさらに含む、請求項8〜15のいずれか記載の方法。
- 細胞アッセイを行うための方法であって:
a)細胞を含有する培地を容器表面に添加して、前記細胞が前記表面に付着して、そして細胞培養を形成するのを可能にし、
b)凍結保存培地を添加し
c)前記培地の温度を下げて、前記細胞培養を凍結させ、
d)−20℃未満の温度で細胞培養を保存し、
e)細胞培養の温度を上げることによって、前記細胞を融解し、
f)細胞に対して細胞アッセイを行う
工程を含み;
工程a)の前に前記容器表面をポリリジンでコーティングすることによって特徴付けられる、前記方法。 - 細胞培養を−80℃未満の温度で保存する、請求項17記載の方法。
- ポリリジンが、ポリD−リジン、ポリL−リジンおよびその混合物からなる群より選択される、請求項17または18のいずれか記載の方法。
- 容器が、器、バイアル、マイクロタイタープレートおよび細胞培養プレートからなる群より選択される、請求項17〜19のいずれか記載の方法。
- 細胞が接着細胞である、請求項17〜20のいずれか記載の方法。
- 工程a)の細胞が1以上のマイクロキャリアーに付着している、請求項17〜21のいずれか記載の方法。
- 前記の1以上のマイクロキャリアーがポリリジンでコーティングされている、請求項22記載の方法。
- 細胞が、哺乳動物細胞、昆虫細胞、両生類細胞、魚類細胞、爬虫類細胞および鳥類細胞からなる群より選択される、請求項17〜23のいずれか記載の方法。
- 細胞が哺乳動物細胞である、請求項17〜24のいずれか記載の方法。
- 細胞が、CHO細胞、HEK293細胞およびAD293細胞からなる群より選択される、請求項17〜25のいずれか記載の方法。
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