KR20220076456A - 세포 동결용 조성물, 세포 동결 방법, 세포 배양 방법, 및 세포 동결용 키트 - Google Patents

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KR20220076456A
KR20220076456A KR1020227009632A KR20227009632A KR20220076456A KR 20220076456 A KR20220076456 A KR 20220076456A KR 1020227009632 A KR1020227009632 A KR 1020227009632A KR 20227009632 A KR20227009632 A KR 20227009632A KR 20220076456 A KR20220076456 A KR 20220076456A
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야스히코 다바타
고지 기무라
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이와타니 산교 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명의 세포 동결용 조성물은, 배지와, 동결 방지제와, 용존 수소를 포함하는 것이다.

Description

세포 동결용 조성물, 세포 동결 방법, 세포 배양 방법, 및 세포 동결용 키트
본 발명은, 세포 동결용 조성물, 세포 동결 방법, 세포 배양 방법, 및 세포 동결용 키트에 관한 것이다.
지금까지 세포 동결 기술에 대하여 다양한 개발이 이루어져 왔다. 이러한 종류의 기술로서, 예를 들어 특허문헌 1에 기재된 기술이 알려져 있다. 특허문헌 1에는, 90％ 소 태아 혈청 및 10％ DMSO로 구성되는 동결 보존 배지가 기재되어 있다(특허문헌 1, 단락 0073 등).
일본 특허 공표 제2012-512637호 공보
그러나, 본 발명자가 검토한 결과, 상기 특허문헌 1에 기재된 동결 보존 배지에 있어서, 동결 융해 후에 있어서의 세포 증식능의 점에서 개선의 여지가 있음이 판명되었다.
일반적인 세포 동결 방법에 있어서, 세포 배양용 배지에 DMSO 등의 동결 방지제를 포함하는 세포 동결용 보존액이 사용된다. 세포 동결용 보존액에 세포를 넣어, 냉동 보존한다. 냉동 보존한 세포를 융해, 배양하여 대량으로 증식시킨다. 이 통상의 방법에 있어서, 세포 동결 및 융해 시에 저온 스트레스 등의 대미지를 세포가 받으면, 동결 융해 후의 세포에 있어서, 세포 생존 활성이나 세포 증식 속도 등의 저감이 일어나, 세포 증식능이 저하되는 경우가 있었다.
본 발명자는 상기 사정을 근거로 하여, 세포 냉동용 보존액 중의 환경에 대하여 예의 검토한 결과, 세포 냉동용 보존액에 수소수 및/또는 수소 가스를 첨가하여 용존 수소를 포함시킴으로써, 동결 융해 후의 세포에 있어서 세포 증식능의 저하가 억제되는 것을 알아내고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명에 따르면,
배지와,
동결 방지제와,
용존 수소
를 포함하는, 세포 동결용 조성물이 제공된다.
또한 본 발명에 따르면,
배지와,
동결 방지제
를 포함하는, 세포 동결용 조성물이며,
대기압 하, 25℃에서 측정하였을 때의, 당해 세포 동결용 조성물의 산화 환원 전위가, -700㎷ 이상 -100㎷ 이하이고,
대기압 하, 25℃에서 측정하였을 때의, 당해 세포 동결용 조성물의 pH가, 6.8 이상 8.5 이하인,
세포 동결용 조성물이 제공된다.
또한 본 발명에 따르면,
상기 세포 동결용 조성물과 세포의 혼합물을 준비하는 공정과,
상기 혼합물을 동결하여, 동결물을 얻는 공정
을 포함하는, 세포 동결 방법이 제공된다.
또한 본 발명에 따르면,
상기 세포 동결 방법에 의해 얻어진 동결물을 융해하여, 융해물을 얻는 공정과,
얻어진 융해물 중에 포함되는 세포를 배양하는 공정
을 포함하는, 세포 배양 방법이 제공된다.
또한 본 발명에 따르면, 수소수를 포함하는 보존 용기를 구비하는, 세포 동결용 키트가 제공된다.
본 발명에 따르면, 동결 융해 후에 있어서의 세포 증식능이 우수한 세포 동결용 조성물, 그것을 사용한 세포 동결 방법, 세포 배양 방법, 및 세포 동결용 키트가 제공된다.
도 1은 실시예 1, 비교예 1의 세포당의 MTT 활성값을 도시하는 도면이다.
도 2는 실시예 1, 비교예 1의 세포 증식 곡선을 도시하는 도면이다.
도 3은 실시예 3 내지 5, 비교예 2의 MTT 활성값을 도시하는 도면이다.
본 실시 형태의 세포 동결용 조성물의 개요를 설명한다.
본 실시 형태의 세포 동결용 조성물의 하나는, 배지와, 동결 방지제와, 용존 수소를 포함한다.
본 발명자의 지견에 의하면, 세포의 영양소를 포함하는 세포 배양용 배지와 동결 방지제를 포함하는 세포 동결용 조성물에 수소수 및/또는 수소 가스를 첨가하여 용존 수소를 포함시킴으로써, 그 세포 동결용 조성물 중에 포함시킨 세포를 동결, 보존, 융해한 후, 동결 융해 후의 세포에 있어서, 세포 생존 활성이나 세포 증식 속도의 증대가 가능해지기 때문에, 세포 증식능의 저하를 억제할 수 있음을 알아냈다.
용존 수소란, 액 중에 용해되는 수소 분자를 의미한다. 용존 수소계를 사용하여, 대기압 하, 25℃에서, 예를 들어 0.1ppm 이상의 용존 수소 농도를 나타내는 경우를, 용존 수소를 포함하는 상태로 한다.
상세한 메커니즘은 분명치는 않지만, 세포 동결용 조성물 중의 용존 수소 농도가 비교적 높아지면, 동결 조작 전의 혼합 시에 세포의 활성을 촉진할 수 있기 때문에, 동결 과정에 세포가 받는 대미지를 저감할 수 있다고 생각된다. 또한, 세포의 대미지의 저감의 요인으로서, 용존 수소의 활성 산소 제거능에 의한 효과도 생각된다.
본 실시 형태의 세포 동결용 조성물을 사용함으로써, 동결 융해 후에 있어서의 세포 증식능, 즉 MTT 활성이 우수한 세포가 얻어지는 세포 동결 방법, 그 세포를 사용한 세포 배양 방법을 실현할 수 있다. 또한, 세포 증식 속도가 우수한 세포 동결 방법 및 세포 배양 방법을 실현할 수 있다.
이와 같은 방법은, 장기의 보관·반송에 사용할 수 있어, 재생 의료 등의 의료 기술에 유익한 방법이다.
이하, 본 실시 형태의 세포 동결용 조성물의 각 성분에 대하여 상세하게 설명한다.
세포 동결용 조성물은, 세포를 동결하기 위해 사용하는 수소 함유 세포 동결용 보존액이다.
세포는, 세포 단체, 복수의 세포, 세포가 집합된 조직, 혹은, 장기(기관) 중 적어도 어느 하나 이상을 포함한다.
세포 동결에 사용되는 세포로서, 예를 들어 동물 세포 또는 식물 세포를 사용할 수 있다.
동물 세포로서는, 예를 들어 곤충 세포 등의 무척추동물 유래 세포, 인간 세포나 마우스 세포 등의 포유동물 유래 세포, 조류 유래 세포, 양서류 유래 세포, 파충류 유래 세포, 어류 유래 세포 등의 척추동물 유래 세포 등을 들 수 있다. 이 중에서도, 포유동물 유래 세포를 사용해도 된다.
포유동물로서는, 인간 등의 영장류, 마우스, 모르모트, 래트, 소, 말, 돼지, 염소, 개, 토끼 등이 예시된다.
동물 세포는, 초대 배양 세포, 주화 세포, 계대 세포, 배양 세포, 체세포, 줄기 세포, 종양 세포 등 중 어느 형태의 세포여도 된다. 줄기 세포에는, 성체 줄기 세포, ES 세포, iPS 세포가 포함된다.
보다 구체적인 세포로서는, 예를 들어 ES 세포, iPS 세포, 간엽계 세포, 섬유 아세포, 근세포, 골세포, 지방 세포, 신경 세포, 상피 세포, 및 그것들의 줄기 세포 또는 전구 세포, 그리고 그것들로부터 분화 유도되는 세포 등을 들 수 있다. 세포는, 접착 세포여도 되고, 부유 세포여도 된다.
세포 동결용 조성물은, 배지를 포함한다. 배지에는 세포의 생명 유지에 필요한 성분을 포함시킬 수 있다.
배지는, 세포의 영양분을 포함하는 것이면 특별히 한정되지는 않지만, 예를 들어 동결용 배지, 완전 배지, 혈청 함유 배지, 무혈청 배지 등을 들 수 있다. 재생 의료에 사용하는 세포의 경우, 무혈청 배지를 사용해도 된다.
배지의 구체예는, 공지의 기초 배지를 사용해도 되고, DMEM 배지, EMEM 배지, RPMI-1640 배지, α-MEM 배지, F-12 배지, F-10 배지, M-199 배지, HAM 배지, ERDF 배지, L-15 배지, 윌리엄스 E 배지 등을 들 수 있다. 이들을 단독으로 사용해도 되고 2종 이상을 조합하여 사용해도 된다.
세포 동결용 조성물은, 동결 방지제를 포함한다. 이에 의해, 빙정이나 침투압 작용에 의한 세포 손상으로부터 세포를 보호할 수 있다.
동결 방지제로서, 특별히 한정되지는 않고, 공지의 것을 사용해도 되고, 구체적으로는, 디메틸술폭시드(DMSO), 하이드록시에틸스타치(HES), 에틸렌글리콜(EG), 및 글리세롤 등을 들 수 있다. 이들을 단독으로 사용해도 되고 2종 이상을 조합하여 사용해도 된다.
동결 방지제의 농도는, 동결 방지제의 종류나 세포종 등에 따라 적절하게 선택되지만, 배지 전체에 대하여, 예를 들어 1％(v/v) 내지 15％(v/v)로 해도 되고, 바람직하게는 5％(v/v) 내지 10％(v/v)로 해도 된다.
세포 동결용 조성물은, 수소수를 포함하도록 구성되어도 된다.
수소수는, 수소가 용해된 물이며, 대기압 하, 25℃에서, 소정 이상의 용존 수소 농도를 갖는 물을 의미한다.
수소수는, 원수를 사용하고, 가압 용해 방식, 선회류 방식, 초음파 방식, 미세 구멍 방식 등의 각종 방법을 사용하여 조제하여 얻어진다. 이 중에서도, 가압 용해 방식을 사용해도 된다. 적당한 방식을 선택함으로써, 용존 수소 농도, 용존 산소 농도를 적절하게 제어할 수 있다. 예를 들어, 가압 용해 방식은, 수중의 용존 수소 농도를 높이는 한편, 용존 산소 농도를 저감시키는 것이 가능하다.
원수에는, 증류수, 이온 교환수, 초순수 등을 사용해도 된다. 이들 물은 가열 처리나 필터 처리 등의 멸균 처리된 것을 사용할 수 있다.
대기압 하, 25℃에서 측정하였을 때의, 수소수의 용존 수소 농도의 하한은, 예를 들어 0.1ppm 이상, 바람직하게는 0.2ppm 이상, 보다 바람직하게는 0.3ppm 이상이다. 이에 반해, 대기와 접촉하도록 개방 환경 중에 놓인 원수의 용존 수소 농도는, 통상, 대기압 하, 25℃에서 0.0ppm이었다. 한편, 수소수의 용존 수소 농도의 상한은, 예를 들어 10.0ppm 이하, 5.0ppm 이하, 바람직하게는 2.0ppm 이하, 1.6ppm 이하, 1.5ppm 이하로 해도 된다.
대기압 하, 25℃에서 측정하였을 때의, 수소수의 용존 산소 농도의 상한은, 예를 들어 9.0ppm 이하이고, 바람직하게는 5.0ppm 이하, 보다 바람직하게는 3.0ppm 이하이다. 한편, 수소수의 용존 산소 농도의 하한은, 특별히 한정되지는 않지만, 0.0ppm 이상이어도 된다.
수소수는, 1㎛ 이하의 울트라 파인 버블이나 1㎛ 초과 내지 100㎛ 이하의 마이크로 버블 등의 파인 버블을 포함해도 되지만, 이들 파인 버블을 포함하지 않도록 구성되어도 된다.
세포 동결용 조성물은, 상기 성분에 더하여, 본 발명의 효과를 손상시키지 않는 범위에 있어서, 필요에 따라서 적당한 혈청, 첨가물 중 어느 하나 이상을 포함해도 된다.
첨가물로서는, 예를 들어 아미노산, 비필수 아미노산, 비타민, 저분자 화합물, 당류, 단백질, 완충제, 무기염류, 항생 물질, 항균제, 항산화제, 동결 방지제 등을 들 수 있다. 이들을 단독으로 사용해도 되고 2종 이상을 조합하여 사용해도 된다.
혈청으로서, 예를 들어 동물 혈청을 사용해도 되고, 구체적으로는, 인간 혈청, 소 태아 혈청(FBS), 소 혈청, 송아지 혈청, 염소 혈청, 말 혈청, 돼지 혈청, 양 혈청, 토끼 혈청, 래트 혈청 등을 들 수 있다.
완충제로서는, 예를 들어 PBS, HEPES, MES, HANK'S 등을 들 수 있다.
세포 동결용 조성물의 조제 방법은, 특별히 한정되지는 않지만, 상기 각 성분을 혼화함으로써 얻어진다. 성분의 첨가하는 순번은 적절히 변경 가능하고, 한정되지는 않는다. 예를 들어, 수소수, 배지, 동결 방지제를 혼화해도 되지만, 미리 제작해 둔 수소수와 배지의 혼액에, 동결 방지제를 첨가해도 된다.
혹은, 배지에 미리 수소 가스를 첨가한 것을 다른 성분과 혼화해도 되고, 배지나 다른 성분을 혼화한 것에 수소 가스를 첨가해도 된다.
이상에 의해 얻어진 세포 동결용 조성물은, 다음과 같은 특성을 갖는다.
대기압 하, 25℃에서 측정하였을 때의, 세포 동결용 조성물의 산화 환원 전위의 상한은, 예를 들어 -100㎷ 이하, 바람직하게는 -150㎷ 이하, 보다 바람직하게는 -200㎷ 이하이다. 이에 의해, 동결 융해 후에 있어서의 세포 증식능을 높일 수 있다. 한편, 세포 동결용 조성물의 산화 환원 전위의 하한은, 예를 들어 -700㎷ 이상으로 해도 되고, -600㎷ 이상으로 해도 된다.
대기압 하, 25℃에서 측정하였을 때의, 세포 동결용 조성물의 용존 수소 농도의 하한은, 예를 들어 0.1ppm 이상, 바람직하게는 0.2ppm 이상, 보다 바람직하게는 0.3ppm 이상이다. 이에 의해, 동결 융해 후에 있어서의 세포 증식능을 높일 수 있다. 한편, 세포 동결용 조성물의 용존 수소 농도의 상한은, 예를 들어 10.0ppm 이하, 5.0ppm 이하, 바람직하게는 2.0ppm 이하, 1.6ppm 이하, 1.5ppm 이하로 해도 된다.
대기압 하, 25℃에서 측정하였을 때의, 세포 동결용 조성물의 용존 산소 농도의 상한은, 예를 들어 9.0ppm 이하이고, 바람직하게는 5.0ppm 이하, 보다 바람직하게는 3.0ppm 이하이다. 이에 의해, 동결 융해 후에 있어서의 세포 증식능을 높일 수 있다. 한편, 세포 동결용 조성물의 용존 산소 농도의 하한은, 특별히 한정되지는 않지만, 0.0ppm 이상이어도 된다.
대기압 하, 25℃에서 측정하였을 때의, 세포 동결용 조성물의 pH의 하한은, 예를 들어 6.8 이상이며, 바람직하게는 7.0 이상이다. 한편, 세포 동결용 조성물의 pH의 상한은, 예를 들어 8.5 이하이고, 바람직하게는 8.4 이하이다. pH를 상기 수치 범위 내로 함으로써, 세포 배양에 적당한 환경을 실현할 수 있다.
또한, 본 실시 형태의 세포 동결용 조성물의 다른 하나로서는, 배지와, 동결 방지제를 포함하고, 대기압 하, 25℃에서 측정하였을 때의, 세포 동결용 조성물의 산화 환원 전위가, -700㎷ 이상 -100㎷ 이하이고, 대기압 하, 25℃에서 측정하였을 때의, 세포 동결용 조성물의 pH가, 6.8 이상 8.5 이하를 충족하는 세포 동결용 조성물을 들 수 있다.
이때의 세포 동결용 조성물의 산화 환원 전위, pH의 수치에 대해서는, 상술한 상한값이나 하한값을 적절히 조합하여 사용해도 된다.
본 실시 형태에 따르면, 세포 동결용 조성물의 산화 환원 전위의 수치 범위와 pH의 수치 범위의 각각을 적절하게 조제함으로써, 그 세포 동결용 조성물을 사용하여 동결·융해한 세포에 대하여, 동결 융해 후에 있어서의 세포 증식능의 저하를 억제할 수 있다.
본 실시 형태에서는, 예를 들어 세포 동결용 조성물 중에 포함되는 각 성분의 종류나 배합량 세포 동결용 조성물의 조제 방법 등을 적절하게 선택함으로써, 상기 산화 환원 전위, 용존 수소 농도, 용존 산소 농도 및 pH를 제어하는 것이 가능하다. 이들 중에서도, 예를 들어 용존 수소 농도가 과포화 상태, 포화 상태 또는 포화에 가까운 상태의 수소수를 사용하는 것, 수소수의 보관 조건, 세포 동결용 조성물의 조제 후부터 세포를 첨가할 때까지의 시간 등을 적절하게 조정하는 것 등이, 상기 산화 환원 전위, 용존 수소 농도, 용존 산소 농도 및 pH를 원하는 수치 범위로 하기 위한 요소로서 들 수 있다.
세포 동결용 조성물의 산화 환원 전위, 용존 수소 농도, 용존 산소 농도 및 pH는, 상온(23℃) 상압 하에서 측정되는 값이며, 세포 동결에 사용하기 직전의 값인 것이 바람직하다. 직전이란, 예를 들어 1시간 이내, 바람직하게는 30분 이내, 보다 바람직하게는 15분 이내를 의미한다.
특히, 용존 수소 농도는, 수소수/세포 동결용 조성물이 개방 환경 하에 있으면 시간 경과에 따라서 서서히 농도가 저하되기 때문에, 세포 동결에 사용하기 직전의 값인 것이 바람직하다.
물의 상온 상압의 포화 수소 농도는 1.6ppm이지만, 가압 조건 하에서, 물 및/배지 중에 수소 가스를 첨가함으로써, 용존 수소 농도가 과포화 상태인 수소수/세포 동결용 조성물을 조제할 수 있다.
수소 가스의 첨가는, 가압 하, 예를 들어 알루미늄 파우치, 수지제 봉투나 수지제 박스 등의 용기 중에서 행하는 것이 가능하다. 용존 수소 농도를 상기 상한값 이하로 함으로써, 동결 세포나 조작자(인간)에 대한 영향이 없는 수소수/세포 동결용 조성물을 조제할 수 있다. 또한, 세포 동결 조작의 현장 근처에서, 조작자가 소정의 용존 수소 농도를 갖는 수소수/세포 동결용 조성물을 조제할 수 있다.
소정의 용존 수소 농도를 갖는 수소수/세포 동결용 조성물에 대해서는, 조작자가, 세포 동결의 직전에, 작업 현장 근방에서 조제하는 것이 가능하다.
또한, 다른 시설에서 제조된 수소수를 보존 용기로 보관, 반송된 것을 사용하여, 세포 동결용 조성물을 조제해도 된다.
본 실시 형태의 세포 동결 방법, 세포 배양 방법에 대하여 설명한다.
세포의 동결, 보관, 냉각에 사용하는 장치, 기구, 이들에 사용하는 각종 시약이나 성분에 대해서는, 필요에 따라 멸균된 것을 사용해도 된다.
세포 동결 방법은, 상기 세포 동결용 조성물과 세포의 혼합물을 준비하는 공정과, 혼합물을 동결하여, 동결물을 얻는 공정을 포함한다. 혼합물은, 예를 들어 세포 동결용 조성물 중에 세포를 현탁시킴으로써 얻어진다.
세포는, 예를 들어 계대 배양된 세포를 회수함으로써 얻어도 된다. 접착 세포는, 세포 용기 중의 표면으로부터 박리하고, 소정의 배지 중에서 원심 분리함으로써, 침전물로서 회수할 수 있다. 부유 세포는, 배양 용기 중의 현탁액을 원심 분리함으로써, 침전물로서 회수할 수 있다.
파종되는 세포의 밀도는, 세포의 종류 등에 따라 다르지만, 예를 들어 약 1×103 세포/mL 내지 약 1×109 세포/mL, 보다 바람직하게는 약 1×104 세포/mL 내지 약 1×107 세포/mL로 해도 된다.
세포 동결은, 세포를 동결하기 위한 프로토콜에 따라서 행해져도 된다.
이하에, 세포 동결용 프로토콜의 일례를 나타낸다.
(1) 세포를 배양 배지에 현탁시키고, 그 현탁액을 15mL의 코니컬 튜브에 넣는다.
(2) 세포 현탁액, 혈청, 디메틸술폭시드가 7:2:1의 비율로 되도록, 혈청과 디메틸술폭시드(DMSO)를 첨가한다.
(3) 크라이오 튜브에, 상기 (2)에서 얻어진 혼합액을 1mL 분주한다.
(4) 세포를 동결 보존한다.
상기 프로토콜에 있어서, 수소수는, 수순 (1)에서 현탁액에 첨가해도 되고, 수순 (2)에서 혈청 등과 함께 첨가해도 된다. 현탁액 중의 각 성분, 혈청, DMSO의 농도의 조정이 용이해지기 때문에, 수소수를 수순 (1)에서 첨가할 수 있다.
세포 동결용 조성물의 조제 방법은, 특별히 한정되지는 않지만, 배지에 수소수를 혼합하는 방법, 동결 방지제에 수소수를 첨가하는 방법, 배지 및 동결 방지제를 포함하는 혼액에 수소수를 첨가하는 방법, 배지에 수소 가스를 첨가하는 방법, 동결 방지제에 수소 가스를 첨가하는 방법, 및 배지 및 동결 방지제를 포함하는 혼액에 수소 가스를 첨가하는 방법 중 적어도 한쪽을 사용할 수 있다.
수소수를 혼합하는 방법의 경우, 수소수, 배지, 동결 방지제 등의 성분을 혼화해도 되지만, 미리 제작해 둔 수소수와 배지의 혼액에 대하여, 동결 방지제 등의 성분을 첨가해도 된다.
수소 가스를 첨가하는 방법의 경우, 배지나 동결 방지제 등의 각 성분에 수소 가스를 첨가한 것과, 다른 성분을 혼화해도 되고, 배지 및 동결 방지제 중 적어도 한쪽 또는 양쪽을 포함하는 혼액에 수소 가스를 첨가해도 된다.
수소수는, 조제 직후의 것을 사용해도 되지만, 수소 가스가 충전된 밀폐 용기 중에 보관한 수소수를 사용해도 된다.
수소 가스는, 대기 하 중에서 첨가해도 되지만, 밀폐 공간 중 가압 하에서 첨가해도 된다.
세포 동결은, 냉각 속도를 -1℃/분 정도의 온화한 조건에서 냉각해도 된다.
세포 보존은, 예를 들어 -80℃ 이하, 바람직하게는 -130℃ 이하, 보다 바람직하게는 -150℃ 이하의 환경 하에서 보관해도 된다. 예를 들어, 액체 질소 보존 용기를 사용하여 보관할 수 있다.
세포 배양 방법은, 세포 동결 방법에 의해 얻어진 동결물을 융해하여, 융해물을 얻는 공정과,
얻어진 융해물 중에 포함되는 세포를 배양하는 공정을 포함한다.
세포 융해에는, 동결에 사용한 세포 동결용 조성물이나 세포의 종류에 따라 다르지만, 예를 들어 0℃ 내지 40℃, 바람직하게는 약 36℃ 내지 37℃의 환경에, 예를 들어 30초 내지 10분간, 동결물을 폭로해도 된다. 예를 들어, 동결물을 약 37℃의 워터 배스 중에 침지시켜도 된다. 이에 의해, 동결물 중의 세포를 적당히 융해할 수 있다.
동결 융해한 세포에 대하여 세포 배양을 행한다.
배양 조건은, 배양하는 세포종에 따라 다르고, 통상 실시되는 조건에서 실시할 수 있다. 특별히 한정되지는 않지만, 예를 들어 포유류의 세포를, 5％ CO2 분위기 하 37℃에서 배양해도 된다.
본 실시 형태의 세포 동결용 키트에 대하여 설명한다.
세포 동결용 키트는, 세포 동결 방법에 사용하기 위한, 세포 동결용 조성물, 혹은, 세포 동결용 조성물의 조제에 사용하는 성분을 포함하는 것이다.
세포 동결용 키트의 하나는, 수소수를 포함하는 보존 용기를 적어도 구비하는 것이다.
보존 용기는, 액상에 수소수를 포함하고, 기상에 수소 가스를 포함해도 된다. 기상을 수소 가스로 충전함으로써, 수소수 중의 용존 수소 농도를 일정 이상으로 유지할 수 있다. 보관 온도는, 예를 들어 0℃ 내지 30℃, 바람직하게는 23℃ 내지 27℃로 해도 된다.
보관 용기로부터의 개봉 직후의, 대기압 하, 25℃에서 측정하였을 때의, 수소수의 용존 수소 농도의 하한은, 예를 들어 0.1ppm 이상, 바람직하게는 0.2ppm 이상, 보다 바람직하게는 0.3ppm 이상이다. 한편, 그 수소수의 용존 수소 농도의 상한은, 예를 들어 10.0ppm 이하, 5.0ppm 이하, 바람직하게는 2.0ppm 이하, 1.6ppm 이하, 1.5ppm 이하로 해도 된다.
보관 용기는, 수소 투과율이나 산소 투과율이 낮은 재료로 구성되어 있어도 되고, 예를 들어 알루미늄 백을 사용해도 된다.
유저는, 세포 동결용 키트 중의 보관 용기로부터 취출한 수소수를 사용하여, 세포 동결용 조성물을 조제할 수 있다. 이것을 사용함으로써, 동결 융해 후에 있어서의 세포 증식능을 높일 수 있다.
세포 동결용 키트 중의 보존 용기는, 적어도 수소수와 배지의 혼합액을 포함해도 된다.
수소수를 혼합액으로서 사용해도, 수소수를 포함하는 세포 동결용 조성물에 의해, 동결 융해 후에 있어서의 세포 증식능을 높일 수 있다.
세포 동결용 키트는, 세포를 동결하기 위한 프로토콜을 포함해도 된다.
프로토콜에는, 세포 동결용 조성물을 사용한 세포의 동결 수순이나 동결 조건이 기록되어 있다.
또한, 세포 동결용 키트는, 세포를 융해하기 위한 프로토콜을 더 포함하고 있어도 된다.
이상, 본 발명의 실시 형태에 대하여 설명하였지만, 이들은 본 발명의 예시이며, 상기 이외의 다양한 구성을 채용할 수 있다. 또한, 본 발명은 상술한 실시 형태에 한정되는 것은 아니고, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 범위에서의 변형, 개량 등은 본 발명에 포함된다.
이하, 참고 형태의 예를 부기한다.
1. 배지와,
동결 방지제와,
수소수
를 포함하는, 세포 동결용 조성물.
2. 1.에 기재된 세포 동결용 조성물이며,
대기압 하, 25℃에서 측정하였을 때의, 당해 세포 동결용 조성물의 산화 환원 전위가, -700㎷ 이상 -100㎷ 이하인, 세포 동결용 조성물.
3. 1. 또는 2.에 기재된 세포 동결용 조성물이며,
대기압 하, 25℃에서 측정하였을 때의, 당해 세포 동결용 조성물의 용존 수소 농도가, 0.1ppm 이상 1.6ppm 이하인, 세포 동결용 조성물.
4. 1. 내지 3. 중 어느 하나에 기재된 세포 동결용 조성물이며,
대기압 하, 25℃에서 측정하였을 때의, 당해 세포 동결용 조성물의 pH가, 6.8 이상 8.5 이하인, 세포 동결용 조성물.
5. 1. 내지 4. 중 어느 하나에 기재된 세포 동결용 조성물이며,
대기압 하, 25℃에서 측정하였을 때의, 당해 세포 동결용 조성물의 용존 산소 농도가, 5.0ppm 이하인, 세포 동결용 조성물.
6. 1. 내지 5. 중 어느 하나에 기재된 세포 동결용 조성물이며,
상기 동결 방지제가, 디메틸술폭시드(DMSO), 하이드록시에틸스타치(HES), 에틸렌글리콜(EG), 및 글리세롤로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 이상을 포함하는, 세포 동결용 조성물.
7. 1. 내지 6. 중 어느 하나에 기재된 세포 동결용 조성물이며,
세포 동결에 사용하는 세포가 동물 세포를 포함하는, 세포 동결용 조성물.
8. 배지와,
동결 방지제
를 포함하는, 세포 동결용 조성물이며,
대기압 하, 25℃에서 측정하였을 때의, 당해 세포 동결용 조성물의 산화 환원 전위가, -700㎷ 이상 -100㎷ 이하이고,
대기압 하, 25℃에서 측정하였을 때의, 당해 세포 동결용 조성물의 pH가, 6.8 이상 8.5 이하인,
세포 동결용 조성물.
9. 1. 내지 8. 중 어느 하나에 기재된 세포 동결용 조성물과 세포의 혼합물을 준비하는 공정과,
상기 혼합물을 동결하여, 동결물을 얻는 공정
을 포함하는, 세포 동결 방법.
10. 9.에 기재된 세포 동결 방법에 의해 얻어진 동결물을 융해하여, 융해물을 얻는 공정과,
얻어진 융해물 중에 포함되는 세포를 배양하는 공정
을 포함하는, 세포 배양 방법.
11. 수소수를 포함하는 보존 용기를 구비하는, 세포 동결용 키트.
12. 11.에 기재된 세포 동결용 키트이며,
상기 보존 용기가, 적어도 상기 수소수와 배지의 혼합액을 포함하는, 세포 동결용 키트.
13. 11. 또는 12.에 기재된 세포 동결용 키트이며,
세포를 동결하기 위한 프로토콜을 포함하는, 세포 동결용 키트.
실시예
이하, 본 발명에 대하여 실시예를 참조하여 상세하게 설명하지만, 본 발명은, 이들 실시예의 기재에 전혀 한정되는 것은 아니다.
<수소수의 조제>
(수소수 A)
수소수 발생 장치(IDEC사제, Ultra Fine GALF, 가압 용해 방식)를 사용하고, 환경 온도 25℃에서, 증류수를 사용하여 수소수 A를 조제하였다.
사용한 증류수는, 용존 수소 농도: 0.00ppm, 용존 산소 농도: 8 내지 9ppm이었다.
조제 직후의 수소수 A는, 용존 수소 농도: 1.5ppm, 용존 산소 농도: 2ppm, pH: 7.42, ORP: -476㎷였다.
또한, 조제 직후로부터 15분 경과 후의 수소수 A에 있어서, 용존 수소 농도, 용존 산소 농도, pH, 및 ORP의 수치에 변동은 거의 없었다.
용존 수소 농도는, 대기압 하, 25℃에서, 용존 수소계(유니 센스사제, H2 마이크로센서)를 사용하여 측정하였다.
용존 산소는, 대기압 하, 25℃에서, 용존 산소계(센트럴 가가쿠사제, CGS-5)를 사용하여 측정하였다.
pH, OPR은, 대기압 하, 25℃에서, pH/ORP 미터(도코 가가쿠 겐큐죠성, TPX-999Si)를 사용하여 측정하였다.
(수소수 B)
얻어진 조제 직후의 수소수 A를, 알루미늄 백(지엘 사이언스사제, CCK-1)에 봉입하고, 백 내부에 수소 가스를 충전한 상태에서, 대기압 하, 25℃, 2 내지 4주간 보관하였다. 당해 알루미늄 백으로부터 취출한 직후의 것을, 수소수 B로서 사용하였다.
보관한 후, 개봉 직후의 수소수 B는, 용존 수소 농도: 1.5ppm, 용존 산소 농도: 2ppm, pH: 7.43, ORP: -525㎷였다.
<세포 동결용 조성물의 조제, 세포 동결 보존, 융해>
(실시예 1)
(1) 세포 동결용 조성물의 조제
마우스 유래의 세포(K·A·C사제, MC3T3-E1, 접착 세포)를, 5×105cells/mL의 농도가 되도록, 배양 배지(α-MEM 배지)에 현탁하고, 세포액을 15mL의 멸균 완료 코니컬 튜브 내에서 조제하였다.
얻어진 세포액 100μL에 조제 직후의 수소수 A를 첨가하여 용존 수소 농도를 조정한 후, 이에 대하여, 멸균한 α-MEM 배지(기브코사제, 제품명: Mem alpha basic(powder))를 혼화하여, 표 1의 용존 수소 농도를 갖는 혼액 900μL를, 15ml의 멸균 완료 코니컬 튜브 내에 얻었다.
얻어진 혼액 700μL, FCS(송아지 혈청, GE 헬스케어사제, 제품명: 하이클론 Fetal Bovine Serum) 200μL, 및 DMSO(디메틸술폭시드, 나카라이테스크사제, 동결 방지제) 100μL를, 용량 1mL의 크라이오 튜브에 넣고, 혼화하여, 동결 전의 세포 보존액(세포 동결용 조성물)을 조제하였다. 마찬가지로 하여, 세포 보존액 중에 세포를 포함하는 세포 현탁액이 충전된 마이크로튜브를 6개 준비하였다.
(2) 세포 동결 조작
각 크라이오 튜브를, 세포 동결 용기(코스모 바이오사제, 미스터 프로스티)를 사용하여 -1℃/min으로 -80℃까지 냉각시킨 후, 액체 질소를 포함하는 보존 용기에서, -150℃ 이하로 냉각하여 동결하였다. 동결을 확인한 후, 각 마이크로튜브를, 액체 질소를 포함하는 보존 용기 중에서 2주간 보관하였다.
(3) 세포 융해 조작
보존 용기로부터 각 크라이오 튜브를 취출하여, 37℃의 항온조 중에 3분간 넣어, 세포 보존액의 융해를 확인하였다.
(4) 활성 평가, 증식 평가
이상의 (1) 내지 (3)의 조작에 의해, 동결, 보존, 융해한 세포 보존액 중에 세포를 포함하는 세포 현탁액을, 평가 대상의 샘플로 하였다. 6개의 크라이오 튜브의 각각으로부터, 6개의 샘플을 얻었다.
얻어진 각 샘플에 대하여, 하기의 MTT 어세이, 융해 후로부터 7일간의 세포 증식 변화를 평가하였다.
또한, 상기 조작은, 특별히 언급하지 않는 한, 대기압, 25℃의 환경 하에서 행하였다.
조제한 직후의 혼액, 조제한 직후의 동결 전 세포 보존액, 융해한 직후의 동결 후 세포 보존액의 각각에 대하여, 용존 수소 농도, pH, ORP에 대하여 측정하였다. 결과를 표 1에 나타낸다.
(비교예 1)
혼액으로서, 수소수 A 대신에 멸균수를 사용하고, 그 멸균수와 α-MEM 배지의 혼액을 사용한 것 이외에는, 실시예 1과 마찬가지로 하여, 샘플을 얻었다.
사용한 멸균수는, 용존 수소 농도: 0.00ppm, 용존 산소 농도: 8 내지 9ppm이었다.
(실시예 2)
수소수 A 대신에, 알루미늄 백으로 보관한 수소수 B를 사용한 것 이외에는, 실시예 1과 마찬가지로 하여, 샘플을 얻었다.
Figure pct00001
<MTT 어세이>
이하의 수순에 따라서, 세포수당의 MTT 활성값을 측정하였다.
실시예·비교예에서 얻어진 측정 대상의 샘플을 사용하여, 세포가 5.0×105cells/mL 내지 1.5×106cells/mL의 농도가 되도록 배양 배지(α-MEM 배지)를 첨가하고, 혼화하여 용액을 조제하였다.
혼화한 용액을 100μL씩, 96웰 플레이트(코닝사제)의 96웰에 파종하고, 37℃, 이산화탄소 농도 5％의 조건 하, CO2 인큐베이터 중 내에서 30분간 배양하였다.
WST-8과 1-Methoxy PMS의 혼합 용액을, 각 웰에 10μL씩 첨가하였다.
계속해서, 37℃, 이산화탄소 농도 5％의 조건 하, CO2 인큐베이터 중 내에서 60분간 배양하였다.
배양 종료 후, 마이크로플레이트 리더(몰레큘러 디바이스사제, 상품명: SpectraMax i3)를 사용하여, 450㎚의 흡광도를 측정하였다. 얻어진 흡광도의 값을, 세포의 대사(호흡)의 세포 생존 활성(MTT 활성값)으로 하였다.
6개의 샘플에 대하여, 마찬가지로 하여 MTT 활성값을 측정하였다.
얻어진 흡광도를, 사용한 세포수로 제산함으로써, 세포수당의 MTT 활성값을 산출하였다. 도 1에, 실시예 1, 비교예 1의 세포수당의 MTT 활성값(6개의 샘플의 평균값)을 나타낸다.
또한, 세포수의 측정에는, 혈구 계산반을 사용하였다.
<세포 증식>
실시예·비교예에서 얻어진 측정 대상의 샘플을 사용하여, 하기의 수순에 따라서, 세포를 배양하고, 배양 일수가 7일까지인 세포수를 경시적으로 측정하였다.
도 2에, 실시예 1, 비교예 1의, 세포수(6개의 샘플의 평균값)와 배양 일수의 관계를 나타내는 세포 증식 곡선을 나타낸다.
융해시킨 세포 보존액을 코니컬 튜브로 옮기고, 1,000rpm으로 3분간 원심하고, 상청을 버렸다. 그 후, 5.0×105cells/mL로 되도록 배양 배지(α-MEM 배지)에 현탁시켰다. 별도로 준비한 직경 100㎜의 배양 접시에 배양 배지 10mL와 세포 현탁액을 혼화시켰다.
그 후, 37℃, 이산화탄소 농도 5％의 조건 하, CO2 인큐베이터에서 배양을 행하였다. 배양 후, 배양 접시로부터 세포를 박리시켜, 세포를 회수하였다. 혈구 계산반을 사용하여, 회수한 세포수를 계측하였다.
실시예 1의 수소수를 포함하는 세포 동결용 조성물을 사용함으로써, 비교예 1과 비교하여, 동결 융해 후에 있어서의 세포의 MTT 활성값이 높아, 세포 증식률이 증대되는 결과가 나타났다. 실시예 2도, 실시예 1과 마찬가지의 경향을 나타냈다.
따라서, 실시예 1, 2의 수소수의 사용 직전 조제의 유무에 관계없이 세포 동결용 조성물을 사용하여 동결 보존한 세포에 대하여, 융해 후에 있어서의 세포 증식률이 증대되는 것을 알 수 있었다.
(실시예 3 내지 5, 비교예 2)
(1') 세포 동결용 조성물의 조제
마우스 유래의 세포(K·A·C사제, MC3T3-E1, 접착 세포)를, 5×105cells/mL의 농도가 되도록, 배양 배지(α-MEM 배지)에 현탁하고, 세포액을 15mL의 멸균 완료 코니컬 튜브 내에서 조제하였다.
별도로, 수소 가스를 α-MEM 배지에 가압 용해시켜, 수소 함유 배지를 조제하였다.
얻어진 세포액 100μL에, 수소 함유 배지, 및 통상의 α-MEM 배지를 첨가하여, 용존 수소 농도를 소정의 농도가 되도록 조제한 혼액을 얻었다.
실시예 3, 4에서는, 대기 하에서, 수소 가스를 배지에 첨가하여, 수소 함유 배지를 조제하였다.
실시예 5에서는, 배지를 알루미늄 백(지엘 사이언스사제, CCK-1)에 봉입하고, 0.04 내지 0.2㎫로 가압한 상태에서, 수소 가스를 첨가하고, 3 내지 5분 이상 요동시켜, 용존 수소가 과포화 상태인 수소 함유 배지를 조제하였다.
비교예 2에서는, 수소 가스를 첨가하지 않고, 즉, 수소 함유 배지를 사용하지 않았다.
얻어진 혼액 700μL, FCS(송아지 혈청, GE 헬스케어사제, 제품명: 하이클론 Fetal Bovine Serum) 200μL, 및 DMSO(디메틸술폭시드, 나카라이테스크사제, 동결 방지제) 100μL를, 용량 1mL의 크라이오 튜브에 넣고, 혼화하여, 표 2의 용존 수소 농도를 갖는 동결 전의 세포 보존액(세포 동결용 조성물)을 조제하였다.
마찬가지로 하여, 세포 보존액 중에 세포를 포함하는 세포 현탁액이 충전된 마이크로튜브를 6개 준비하였다.
용존 수소 농도는, 대기압 하, 25℃에서, 용존 수소계(유니 센스사제, H2 마이크로센서)를 사용하여 측정하였다.
(2) 세포 동결 조작
각 크라이오 튜브를, 세포 동결 용기(코스모 바이오사제, 미스터 프로스티)를 사용하여 -1℃/min으로 -80℃까지 냉각시킨 후, 액체 질소를 포함하는 보존 용기에서, -150℃ 이하로 냉각하여 동결하였다. 동결을 확인한 후, 각 마이크로튜브를, 액체 질소를 포함하는 보존 용기 중에서 2주간 보관하였다.
(3) 세포 융해 조작
보존 용기로부터 각 크라이오 튜브를 취출하여, 37℃의 항온조 중에 3분간 넣어, 세포 보존액의 융해를 확인하였다.
(4) 활성 평가, 증식 평가
이상의 (1') 내지 (3)의 조작에 의해, 동결, 보존, 융해한 세포 보존액 중에 세포를 포함하는 세포 현탁액을, 평가 대상의 샘플로 하였다. 6개의 크라이오 튜브의 각각으로부터, 6개의 샘플을 얻었다.
또한, 비교예 2에 있어서, 상기 (2), (3)의 동결을 행하지 않은 샘플(참고예)도 준비하였다.
얻어진 각 샘플에 대하여, 상기 <MTT 어세이>를 평가하였다. 결과를 표 3, 도 3에 나타낸다. 세포수당의 MTT 활성값에 대하여, 「동결 없음」의 샘플(참고예)을 1.00으로 규격화하였다.
Figure pct00002
실시예 3 내지 5의 세포 동결용 조성물을 사용한 세포 동결 보존 방법은, 비교예 2와 비교하여, 동결 융해 후에 있어서의 세포의 MTT 활성값이 높은 결과가 얻어졌다.
마우스 유래의 세포(MC3T3-E1) 대신에, 마우스 유래의 세포(RAW 264.7), 또는 인간 유래의 세포(THP-1)를 사용한 경우에도, 상기 실시예 1 내지 2는, 비교예 1과 비교하여, 상기 실시예 3 내지 5는, 비교예 2와 비교하여, 동결 융해 후에 있어서의 세포의 MTT 활성값이 높은 결과가 얻어졌다.
이 출원은, 2019년 10월 8일에 출원된 일본 출원 특원 제2019-185161호를 기초로 하는 우선권을 주장하고, 그 개시의 전부를 여기에 포함한다.

Claims (15)

  1. 배지와,
    동결 방지제와,
    용존 수소
    를 포함하는, 세포 동결용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    수소수를 포함하는, 세포 동결용 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    대기압 하, 25℃에서 측정하였을 때의, 당해 세포 동결용 조성물의 용존 수소 농도가, 0.1ppm 이상 10.0ppm 이하인, 세포 동결용 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    대기압 하, 25℃에서 측정하였을 때의, 당해 세포 동결용 조성물의 산화 환원 전위가, -700㎷ 이상 -100㎷ 이하인, 세포 동결용 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    대기압 하, 25℃에서 측정하였을 때의, 당해 세포 동결용 조성물의 pH가, 6.8 이상 8.5 이하인, 세포 동결용 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    대기압 하, 25℃에서 측정하였을 때의, 당해 세포 동결용 조성물의 용존 산소 농도가, 5.0ppm 이하인, 세포 동결용 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 동결 방지제가, 디메틸술폭시드(DMSO), 하이드록시에틸스타치(HES), 에틸렌글리콜(EG), 및 글리세롤로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 이상을 포함하는, 세포 동결용 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포 동결에 사용하는 세포가 동물 세포를 포함하는, 세포 동결용 조성물.
  9. 배지와,
    동결 방지제
    를 포함하는, 세포 동결용 조성물이며,
    대기압 하, 25℃에서 측정하였을 때의, 당해 세포 동결용 조성물의 산화 환원 전위가, -700㎷ 이상 -100㎷ 이하이고,
    대기압 하, 25℃에서 측정하였을 때의, 당해 세포 동결용 조성물의 pH가, 6.8 이상 8.5 이하인, 세포 동결용 조성물.
  10. 배지, 동결 방지제, 및 용존 수소를 포함하는 세포 동결용 조성물과 세포의 혼합물을 준비하는 공정과,
    상기 혼합물을 동결하여, 동결물을 얻는 공정
    을 포함하는, 세포 동결 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 세포 동결용 조성물을 조제하는 방법은, 상기 배지에 수소수를 혼합하는 방법, 상기 동결 방지제에 수소수를 혼합하는 방법, 상기 배지 및 상기 동결 방지제를 포함하는 혼액에 수소수를 첨가하는 방법, 상기 배지에 수소 가스를 첨가하는 방법, 상기 동결 방지제에 수소 가스를 첨가하는 방법, 및 상기 배지 및 상기 동결 방지제를 포함하는 혼액에 수소 가스를 첨가하는 방법 중 적어도 한쪽을 사용하는, 세포 동결 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 기재된 세포 동결 방법에 의해 얻어진 동결물을 융해하여, 융해물을 얻는 공정과,
    얻어진 융해물 중에 포함되는 세포를 배양하는 공정
    을 포함하는, 세포 배양 방법.
  13. 수소수를 포함하는 보존 용기를 구비하는, 세포 동결용 키트.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 보존 용기가, 적어도 상기 수소수와 배지의 혼합액을 포함하는, 세포 동결용 키트.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    세포를 동결하기 위한 프로토콜을 포함하는, 세포 동결용 키트.
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