CN110437486B - 一种疏水材料表面修饰方法及修饰后材料的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种疏水材料表面修饰方法及修饰后材料的应用。该方法包括将多聚赖氨酸偶联泊洛沙姆溶液与疏水材料表面接触。根据本发明所提供的方法，通过极其简单的一步法表面修饰就能够显著提高疏水材料表面的细胞黏附性，无需多步骤修饰，并极大地增强了疏水材料表面的活细胞黏附、生长培养及检测分析能力，便于多学科领域研究人员掌握和使用；且修饰方法操作简单、快捷、高效，适用于各种体外活细胞微工程操作与分析应用。

Description

一种疏水材料表面修饰方法及修饰后材料的应用
技术领域
本发明属于材料表面修饰技术领域，具体涉及一种疏水材料表面修饰方法及修饰后材料在活细胞黏附、培养及检测分析方面的应用。
背景技术
细胞微工程(Cell microengineering)技术是本世纪备受国内外研究机构和学者关注的新兴技术，可用于开展多种微米级尺度界面上的器官组织微环境仿生式细胞操作与分析。其代表性技术包括细胞图样化技术(Cell patterning)和微流控细胞芯片技术(Microfluidic cell chip)。目前细胞微工程技术所使用的材料主要包括：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、玻璃、硅片等。然而，上述绝大部分材料(尤其是聚二甲基硅氧烷)表面疏水，多表现为细胞黏附排斥和极低的细胞亲和性，不利于活细胞在其表面的操控与检测分析，很大程度上限制了该技术在细胞生命科学领域的应用。
为了解决微工程技术所涉及材料的细胞黏附排斥问题，国内外学者使用物理或化学的方法对材料表面进行改性，来增强其亲水性和细胞黏附性。然而，常规细胞黏附分子物理修饰方法只能短暂地提高疏水材料表面的细胞黏附性，稳定性较差，无法保证和实现长期效应；化学改性方法大多需要苛刻的实验条件和复杂的多步骤工艺流程，不利于技术方法的多学科领域相关人员的广泛使用和普及。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高疏水材料表面细胞黏附性的简单修饰方法以及修饰后的材料在细胞微工程中的应用。该方法不仅操作简单，而且能够显著地提高材料表面的细胞黏附性，且修饰稳定性优良。
为实现上述目的，本发明提供一种疏水材料表面修饰方法，包括将多聚赖氨酸偶联泊洛沙姆溶液与疏水材料表面接触。
所述多聚赖氨酸偶联泊洛沙姆，泊洛沙姆分子与多聚赖氨酸分子的偶联比大于等于50：1，且小于等于500：1；优选偶联比大于等于100：1，且小于等于300：1。
多聚赖氨酸偶联泊洛沙姆的合成制备方法如下：
将泊洛沙姆和氯甲酸对硝基苯酯，加入无水二氯甲烷进行溶解，再加入三乙胺，氮气环境保护和室温条件下反应；将反应后的物质倒入4℃预冷的乙醚中进行沉淀纯化；将纯化产物进行真空干燥，获得氯甲酸对硝基苯酯激活的泊洛沙姆产物；将氯甲酸对硝基苯酯激活的泊洛沙姆加入二甲基亚砜进行溶解，然后将二甲基亚砜溶解的多聚赖氨酸缓慢滴加进来，室温条件下搅拌反应；将反应后的物质进行透析纯化，然后将纯化产物冷冻干燥，即获得多聚赖氨酸偶联泊洛沙姆。
所述的表面修饰方法：所述多聚赖氨酸偶联泊洛沙姆溶液的溶剂为水。
所述的表面修饰方法：在所述多聚赖氨酸偶联泊洛沙姆溶液中，多聚赖氨酸偶联泊洛沙姆浓度为10μg/mL～10mg/mL，优选为50μg/mL～1mg/mL。
所述的表面修饰方法：所述接触的时间为0.5小时～10小时，优选为1小时～6小时，最优选为2小时。
所述的表面修饰方法：所述多聚赖氨酸为多聚-D-赖氨酸和多聚-L-赖氨酸中的一种或两种，优选为多聚-D-赖氨酸。
所述的表面修饰方法：所述多聚赖氨酸的分子量为70000～300000，优选为150000-300000。
所述的表面修饰方法：所述泊洛沙姆为Pluronic F127、F108、F98、F88、F68、P123、P105、P104、P103、L123、L122、L121中的一种或多种，优选为Pluronic F127、F108、F98中的一种或多种，最优选为Pluronic F127。
所述的表面修饰方法：所述疏水材料选自以下一种或多种：聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚碳酸酯、甲基化玻璃。
本发明还提供了上述方法修饰后获得的材料在活细胞黏附、培养、检测分析用材料中的应用。例如：细胞图样化技术(Cell patterning)和微流控细胞芯片技术(Microfluidic cell chip)中的应用。
所述活细胞为各种原代和建系的哺乳动物细胞，特别是原代神经细胞。
本发明的疏水材料表面修饰方法可以具有但不限于以下有益效果：
本发明修饰操作步骤仅包含一步，操作步骤极其简单、高效、修饰稳定性好，对不同疏水材料均具有很好的修饰效果。利用该方法修饰的疏水材料表面，可以显著地提高材料表面细胞黏附及细胞培养效果，并进一步显著改善活细胞培养相关的微米级尺度细胞操作与检测分析应用。该发明能够广泛用于多种疏水材料表面的修饰，在细胞微工程领域的应用前景广阔。
附图说明
为了使本发明内容更容易被清楚地理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细地说明：
图1A为实施例1中未修饰聚二甲基硅氧烷(PDMS)表面接种培养0.5天的神经细胞黏附白光图，图1B为实施例1中多聚赖氨酸(PDL)修饰PDMS表面接种培养0.5天的神经细胞黏附白光图，图1C为实施例1中PDL偶联Pluronic F127(PDL-F127)修饰PDMS表面接种培养0.5天的神经细胞黏附白光图。
图2A为实施例1中未修饰PDMS表面培养4天神经细胞的白光图，图2B为实施例1中PDL修饰PDMS表面培养4天神经细胞的白光图，图2C为实施例1中PDL-F127修饰的PDMS表面培养4天神经细胞的白光图。
图3A为实施例2中用于微流控管道辅助的神经细胞图样化装置结构示意图，其中31为PDMS微管道层，32为PDMS基底层，33为PDMS微管道层内的平行微管道，34为装置入口，35为装置出口，图3B为实施例2中区域定位PDL-F127修饰的PDMS基底示意图，其中36为PDMS基底层表面区域定位修饰的PDL-F127层，图3C为实施例2中区域定位PDL-F127修饰PDMS基底层表面的神经细胞图样化示意图，其中37为神经细胞。
图4A为实施例2中区域定位PDL-F127修饰PDMS基底层表面图样化培养5天的神经细胞荧光标记图，图4B为实施例2中区域定位PDL-F127修饰PDMS基底层表面图样化培养5天的神经细胞荧光标记放大图。
图5A为实施例3中微流控芯片结构示意图，其中51为PDMS芯片流动层，52为PDMS芯片基底层，53为PDMS芯片流动层内的微管道网络，54为芯片入口，55为芯片出口，图5B为实施例3中微流控芯片内神经细胞接种示意图，其中56为神经细胞。
图6为实施例3中微流控芯片内培养10天的神经细胞和神经网络荧光标记图。
具体实施方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。应当理解，优选实施例仅为了说明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。
实施例1
本实施例提供一种可增强PDMS疏水材料表面神经细胞黏附的修饰方法，具体包括以下步骤：
本实施例中除了本发明涉及的修饰方法，还设置了两个对照组(未修饰组和PDL修饰组)进行细胞黏附效果的比较。
将3片PDMS膜分别放置于3个常规35mm细胞培养皿内。
在皿1中(未修饰组)，用新鲜的神经细胞基础培养液(Gibco公司)清洗PDMS膜3min。
在皿2中(PDL修饰组)，将100μg/mL PDL溶液加至PDMS表面，2mL/皿，20℃孵育2小时，然后用新鲜细胞培养液清洗3min。
在皿3中(本发明涉及修饰方法)，将100μg/mL PDL-F127溶液加至PDMS表面，2mL/皿，20℃孵育2小时，用新鲜细胞培养液清洗3min。
采用常规两步化学反应法进行F127分子上羟基位点与PDL分子上氨基位点的偶联，合成制备PDL-F127，具体步骤如下：将1.26g Pluronic F127(分子量为12600)和0.202g氯甲酸对硝基苯酯放置于烧瓶内，加入8mL无水二氯甲烷进行溶解，再加入50μL三乙胺，氮气环境保护和室温条件下反应12小时；将烧瓶中的物质倒入30mL 4℃预冷的乙醚中进行沉淀纯化，重复3次；将纯化产物进行真空干燥3小时，获得氯甲酸对硝基苯酯激活的PluronicF127产物；将65mg氯甲酸对硝基苯酯激活的Pluronic F127放置于烧瓶内，加入5mL二甲基亚砜进行溶解，然后将3mL二甲基亚砜溶解的10mg PDL(分子量为150000～300000，多聚-D-赖氨酸)缓慢滴加至烧瓶中，室温条件下搅拌反应36小时；将烧瓶中的物质倒入分子截流量为300000的透析袋中进行透析纯化，然后将纯化产物冷冻干燥，即获得PDL-F127产物，其中，Pluronic F127与PDL的偶联比约为100:1。
将1×106个/mL原代神经细胞悬液加至培养皿中，细胞自然沉降至PDMS膜表面，将培养皿放置于37℃、5％CO2饱和湿度条件下进行0.5天的培养。
去除培养皿内的含有悬浮细胞的旧培养液，更换新鲜的含2％B27的神经细胞培养液(Gibco公司)，然后对3个培养皿内未修饰(图1A)、PDL修饰(图1B)、PDL-F127修饰(图1C)处理PDMS膜表面的神经细胞黏附情况分别进行显微观察记录。
将3个培养皿放置于37℃、5％CO2饱和湿度条件下进行4天的培养，并对3个培养皿内未修饰(图2A)、PDL修饰(图2B)、PDL-F127修饰(图2C)处理PDMS膜表面的神经细胞黏附与生长情况分别进行显微观察记录。
图1和2的结果可知，本发明PDL-F127修饰处理PDMS膜表面的神经细胞黏附性能大大提高，细胞培养密度显著增加。
实施例2
本实施例为实施例1提供PDMS疏水材料表面修饰方法的神经细胞图样化应用，具体包括以下步骤：
首先，如图3A所示，组装可用于微流控管道辅助的神经细胞图样化装置，即将PDMS微管道层(31)放置于一张PDMS基底层(32)上，其中PDMS微管道层采用常规软光刻技术制备，微管道层包含平行微管道(33)、入口(34)、出口(35)。
将该装置放置于常规35mm细胞培养皿内。
将100μg/mL PDL-F127溶液由微管道层入口(34)，灌注进入平行微管道(33)，对微管道内表面进行修饰，20℃孵育2小时，用新鲜细胞培养液清洗3min。
揭去PDMS微管道层(31)，保留区域定位PDL-F127修饰(36)的PDMS基底层(32)于皿内(如图3B所示)。
将1×106个/mL原代神经细胞悬液加至培养皿中，细胞自然沉降至PDMS膜表面，将培养皿放置于37℃、5％CO2饱和湿度条件下进行0.5天的培养。
去除培养皿内的含有悬浮细胞的旧培养液，更换新鲜细胞培养液，将培养皿放置于37℃、5％CO2饱和湿度条件下进行5天的长期培养，实现区域定位PDL-F127修饰PDMS基底层膜表面的神经细胞(37)图样化(如图3C所示)，并对图样化神经细胞的黏附与生长情况进行显微观察记录。结果显示(图4A和B)，神经细胞能够很好地在区域定位PDL-F127修饰PDMS基底层膜表面进行平行排列式图样化，且细胞黏附性很好。
实施例3
本实施例为实施例1提供PDMS疏水材料表面修饰方法的微流控芯片内神经细胞长期培养与神经网络形成，具体包括以下步骤：
首先，如图5A所示，本实施例所使用的微流控芯片自上而下由PDMS芯片流动层(51)和PDMS芯片基底层(52)组成，其中芯片流动层采用常规软光刻技术制备，流动层包含微管道网络(53)、芯片入口(54)，芯片出口(55)。
将100μg/mL PDL-F127溶液由芯片入口(54)，灌注进入微管道网络(53)，对微管道网络内表面进行修饰，20℃孵育2小时，用新鲜的神经细胞基础培养液(Gibco公司)清洗3min。
如图5B所示，将2×106个/mL原代神经细胞(56)悬液由芯片入口(54)，灌注进入微管道网络(53)，实现芯片内神经细胞接种。
将新鲜的含2％B27的神经细胞培养液(Gibco公司)灌注进入芯片内，再将该芯片放置于37℃、5％CO2饱和湿度条件下进行10天的长期培养，待神经细胞轴突和树突生成并与其他神经细胞相互连接，形成神经网络，并对神经网络进行检测鉴定分析。结果显示(如图6所示)，神经细胞可以在PDL-F127修饰PDMS微管道网络内进行长期的黏附与培养及神经突起生成，并形成了明显的神经网络。

Claims (15)

1.一种疏水材料表面修饰方法，其特征在于：包括将多聚赖氨酸偶联泊洛沙姆溶液与疏水材料表面接触；所述多聚赖氨酸的分子量为 70000～300000；所述多聚赖氨酸偶联泊洛沙姆，泊洛沙姆分子与多聚赖氨酸分子的偶联比大于等于50：1，且小于等于500：1；多聚赖氨酸偶联泊洛沙姆浓度为10μg/mL～10mg/mL；所述接触的时间为0.5小时～10 小时。
2.根据权利要求1所述的表面修饰方法，其特征在于：泊洛沙姆分子与多聚赖氨酸分子的偶联比大于等于100：1，且小于等于300：1。
3.根据权利要求1所述的表面修饰方法，其特征在于：多聚赖氨酸偶联泊洛沙姆浓度为50μg/mL～1mg/mL。
4.根据权利要求1所述的表面修饰方法，其特征在于：所述接触的时间为1小时～6小时。
5.根据权利要求4所述的表面修饰方法，其特征在于：所述接触的时间为2小时。
6.根据权利要求1所述的表面修饰方法，其特征在于：所述多聚赖氨酸为多聚-D-赖氨酸和多聚-L-赖氨酸中的一种或两种。
7.根据权利要求6所述的表面修饰方法，其特征在于：所述多聚赖氨酸为多聚-D-赖氨酸。
8.根据权利要求1所述的表面修饰方法，其特征在于：所述多聚赖氨酸的分子量为150000-300000。
9.根据权利要求1所述的表面修饰方法，其特征在于：所述泊洛沙姆为Pluronic F127、F108、F98、F88、F68、P123、P105、P104、P103、L123、L122、L121中的一种或多种。
10.根据权利要求9所述的表面修饰方法，其特征在于：所述泊洛沙姆为PluronicF127、F108、F98中的一种或多种。
11.根据权利要求10所述的表面修饰方法，其特征在于：所述泊洛沙姆为PluronicF127。
12.根据权利要求1所述的表面修饰方法，其特征在于，所述疏水材料选自以下一种或多种：聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚碳酸酯、甲基化玻璃。
13.权利要求1–12任一项所述方法修饰后获得的材料在活细胞黏附、培养、检测分析用材料中的应用。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述活细胞为各种原代和建系的哺乳动物细胞。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述活细胞为原代神经细胞。
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