CN102256481B - 用于进行细胞测定的方法 - Google Patents

用于进行细胞测定的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102256481B
CN102256481B CN200980151813.8A CN200980151813A CN102256481B CN 102256481 B CN102256481 B CN 102256481B CN 200980151813 A CN200980151813 A CN 200980151813A CN 102256481 B CN102256481 B CN 102256481B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
polylysine
cryopreservation
culture
mensuration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN200980151813.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102256481A (zh
Inventor
P·J·塔特内尔
S·盖姆
A·M·多伊尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GE Healthcare UK Ltd
Original Assignee
GE Healthcare UK Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by GE Healthcare UK Ltd filed Critical GE Healthcare UK Ltd
Publication of CN102256481A publication Critical patent/CN102256481A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102256481B publication Critical patent/CN102256481B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

本发明涉及深低温保藏细胞培养物、用于深低温保藏细胞的方法和用于对这样的细胞进行细胞测定的方法。本发明的深低温保藏细胞培养物包括至少具有用聚赖氨酸涂覆的表面的容器和承载在所述表面上的冷冻细胞。

Description

用于进行细胞测定的方法
发明领域
本发明涉及细胞测定或基于细胞的测定，尤其涉及用于这样的测定的深低温保藏细胞的提供。
发明背景
如同本领域的当前实践，药物发现是长时间的多步骤过程。首先，该过程涉及识别特定疾病靶标、开发基于特定靶标的测定、验证该测定、优化和接着使该测定自动化以进行筛选。随后可利用该测定进行化合物文库的高通量筛选(HTS)以鉴别表现出作为潜在药物的前景的候选化合物；接着验证并化学优化这些化合物。该过程得到先导化合物，先导化合物进入临床前试验，若经验证，则最终进入临床试验。在该过程中，筛选阶段与测定开发阶段不同，且包括测试化合物在活生物系统中的功效。
历史上，药物发现是费时的高成本过程，每种药物的产生历时多年并耗费数亿美元。基因组和HTS领域的发展已经引起靶标识别和化合物筛选领域中能力和效率的增加。
HTS技术的应用提供了解决和易化药物发现过程中当前遭遇的瓶颈的可能。在HTS方法中，针对在生物系统中的可能效果和所选先导化合物对特定靶标的特异性筛选候选药物。初级筛选已经由于HTS测定法和测定微型化的发展而解决，测定微型化采用96、384、1536或更多微型孔的微量滴定孔板形式，其能够达到超过100,000次试验/天的通量水平。
多种原本开发用于测量纯化蛋白质(主要是酶)的生化活性的无细胞测定可容易地通过应用不需要将反应产物与底物分离的检测系统而转变成HTS。例如，基于荧光的技术允许在不需要分离、分级或纯化步骤的情况下检测酶活性以及分子间相互作用(Hertzbamerg R P和Pope AJ.High-throughput screening：new technology for the 21st century(高通量筛选：21世纪的新技术).Curr.Opin.Chem.Biol.4，第445-451页，2000)。这些自动化测定使得能够快速筛选大的化合物文库，以鉴定所谓的“命中物(hit)”，即在离体的体外系统中对特定靶标的生化活性表现出所需效应的化合物。然后对命中物进行化学修饰，并通过HTS系统进一步筛选，以选择更具特异性和有效性的称为“先导”化合物的衍生物。在经典的药物发现过程中，随后利用细胞模型和动物模型在多种体内测定中测试先导化合物，以选择可成为临床试验候选药物的那些先导化合物。
近几年，对于药物发现过程早期的HTS，利用基因工程细胞和微生物的基于细胞的测定已经成为体外生化测定日益吸引人的备选方案。这样的测定需要检查由限定的靶标所引发的特异性细胞过程的能力和容易地在HTS系统中测定其输出的工具。越来越多可用的基因修饰细胞和微生物的生物技术工具的利用已使得能够开发简单的容易地应用于HTS的自动化系统的对于细胞过程的读出测定。
与传统体外生化测定相比，基于细胞的测定具有显著的优点。首先，这些细胞测定不需要纯化靶蛋白，因此消除了对获取用于获得生化活性靶标的必要知识的资源的投入—该优点已随着可被潜在药物治疗靶向的蛋白质数量日益增多而变得尤为重要，因为建立用于天然底物仍基本未知的数百新蛋白质的特异性生化测定实在困难。其次，靶蛋白的构象和活性以及用于监测化合物效果的读数在与体外测定相比较很可能更为接近地表现自然生理状态的细胞环境中研究。再次，基于细胞的测定可立即选择排除通常具有细胞毒性的化合物或不能穿过细胞膜到达胞内靶标的化合物。因此，通过基于细胞的测定确定的命中物和先导化合物已经通过了重要的验证步骤。该信息的可用性比许多体外测定领先，并可在药物开发中节省宝贵的时间和成本。
然而，近来用于药物发现(尤其是用于HTS)的细胞生长对细胞供应商和用户提出许多挑战；即，批量性能变化、细胞生产计划以及能力和容量管理。
细胞系通常每周传代培养两次并放大用于每次测定。该传代培养和放大通常在数月期间内循环重复。在大的单一批次中生长并保存于冰箱中的深低温保藏细胞的应用具有显著优点：(a)改善基于细胞的测定结果的一致性—一旦冷冻，同批细胞可在长时期内使用，(b)增加灵活性—新的测定可在需要测试化合物的任何时刻开始，以及(c)降低成本—节省在药物筛选活性同期将细胞系保持在培养物中所花费的时间。因此，减少了细胞培养试剂、一次性用品和细胞培养设备的使用。
深低温保藏本身通常对化合物的药理学没有影响，并可用于许多细胞类型和测定(Guido J.R.Zaman，等.Cryopreserved cells facilitatecell-based drug discovery(深低温保藏细胞有利于基于细胞的药物发现).Drug Discovery Today.第12卷，第13/14期，2007年7月)。例如，比较深低温保藏的瞬时转染HepG2细胞和新转染HepG2细胞在孕烷X受体(PXR)反式激活测定中的使用。两种细胞制品的测定性能相仿；但是，深低温保藏细胞表现较少的测定间变化。用不同PXR活化效能和功效的药物验证表明在深低温保藏细胞和新鲜细胞之间的优异相关性(r2＞0.95)。深低温保藏不改变细胞渗透性差的已知CYP3A4诱导物的效果，表明深低温保藏对膜透性几乎没有影响。此外，深低温保藏HepG2细胞与瞬时转染对照细胞相比未表现出对细胞毒性化合物提高的敏感度。深低温保藏细胞的应用使该测定能够以提高的效率进行(Zhu，Z.等.Use of cryopreserved transiently transfected cells in high-throughput pregnane X receptor transactivation assay(深低温保藏的瞬时转染细胞在高通量孕烷X受体反式激活测定中的使用).Journal ofBiomolecular Screening.12，248-254，2007)。在文献中描述的实例包括广泛用于药物筛选的细胞类型(例如CHO和HEK293)和读出(例如β-内酰胺酶和FLIPR)。
来自AstraZeneca(Molndal，Sweden)的Louise Stjernborg和同事描述了冷冻细胞在用铷流出量测定筛选化合物对人ERG(hERG)途径的副作用中的用途。在他们的团体中，hERG途径筛选不是每天进行，而是以每月一次为基础(当收集了足够的新化合物时)。冷冻细胞的应用明显节约了维持细胞培养物所花时间(Ding，M.等.Application ofcryopreserved cells to hERG screening using a non-radioactive Rb+efflux assay(深低温保藏细胞在用非放射活性Rb+流测定的hERG筛选中的应用).Assay Drug Dev.Technol.4，83-88，2006.)
因此，在药物发现中使用深低温保藏细胞具有三个优点。第一，增加灵活性，因为新的测定可在任何时间开始。第二，提高数据质量，因为在某测定中某化合物的全部试验结果可来自于同批细胞。第三，用冷冻细胞工作实质上减少了在细胞培养工作(尤其是维持细胞系)上花费的时间，从而减少了细胞培养设备、材料和一次性用品的使用。
聚赖氨酸被用作非特异性细胞附着因子，并常规用于促进某些细胞类型粘着到固体底物，例如合成培养表面；载玻片电镜格栅等(Jacobson，B.等.Plasma membrane：rapid isolation and exposure of thecytoplasmic surface by use of positively charged beads(等离子膜：通过使用带正电珠粒快速分离并暴露细胞质表面).Science 195：302-304，1977)。其通常用于一般不附着于固体表面的细胞(Mazia，等.Adhesion of cells to surfaces coated with polylysine.Applications toelectron microscopy(细胞与涂覆有聚赖氨酸的表面的粘着，应用于电子显微镜术).The Journal of Cell Biology，第66卷，198-200，1975)。这通过简单地用阳离子聚赖氨酸的溶液涂布固体表面(塑料、玻璃等)来实现。聚赖氨酸部分与存在于塑料和玻璃表面上的带负电荷的分子产生静电相互作用。
然而，聚赖氨酸也用于在从传统的基于活细胞的分析到免疫组织化学的方法中增加许多其他非哺乳动物细胞和组织的粘着。在科学文献中存在其用于促进哺乳动物/非哺乳动物细胞附着的许多实例。聚赖氨酸用于附着来源于全部主要生物物种(包括哺乳动物类、昆虫类、两栖动物类、鱼类、爬行动物类和禽类)的细胞。此外，给出的实例包括来源于细菌、线虫和腹足类等不同物种的细胞。
在聚赖氨酸上常规培养的一些细胞系实例包括-HEK293人胚肾细胞(Sugawara，T.等.A missense mutation of the Na+channel alpha IIsubunit gene Na(v)1.2 in a patient with febrile and afebrile seizurescauses channel dysfunction(在患有发热性和无热性癫痫患者中Na+通道αII亚基基因Na(v)1.2的错义突变导致通道功能障碍).Proc NatlAcad Sci U S A.98(11)，6384-9，2001)、MDA-231乳腺癌细胞系(Yoneda，T.等.Inhibition of溶骨性骨转移of breast cancer by combinedtreatment with the bisphosphonate ibandronate and tissue inhibitor of the基质金属蛋白酶-2(通过用伊班二膦酸盐(bisphosphonate ibandronate)和基质金属蛋白酶-2组织抑制剂的联合治疗抑制乳腺癌的溶骨性骨转移).J.Clin.Invest.99(10)，2509-17，1997)、垂体前叶细胞(Hinuma，S，等.A prolactin-releasing peptide in the brain(脑中释放催乳素的肽).Nature，393(6682)，22-6，1998)、小胶质MG-7细胞(Szczepanik，AM.等.Amyloid-beta peptide fragments p3 and p4 induce pro-inflammatorycytokine and chemokine production in vitro and in vivo(淀粉状β肽片段p3和p4诱发体外和体内促炎细胞因子和趋化因子产生).J.Neurochemistry，77(1)，304-17，2001)和大鼠原代星形胶质细胞(Little，EB.等.A short segment within the cytoplasmic domain of the neural celladhesion molecule(N-CAM)is essential for N-CAM induced NF-kappa Bactivity in astrocytes(神经细胞粘着分子(N-CAM)的胞质域内的短节段对于星形胶质细胞中的N-CAM诱导的NF-kappa B活性是必不可少的).PNAS USA，98(5)，2238-43，2001)。
GB2427411A涉及使用藻酸盐/多糖微胶囊/水凝胶的用于来源于组织的细胞的深低温保藏方法。聚赖氨酸用于促进细胞附着到多糖。在该文件中没有提及将聚赖氨酸用于改进测定性能。
美国专利6657003公开了用于涂布基材的液体溶液，该液体溶液表现出长期的稳定性和细胞粘着性质。更具体而言，其涉及用于施用于细胞样品载玻片的包含交联氨基酸聚合物的溶液。该发明中所用氨基酸聚合物选自中性或碱性氨基酸，例如聚1-赖氨酸或聚1-精氨酸。
WO 2005/034625涉及一种表面(例如细胞培养表面)，其包括结合抗细胞粘着(CAR)材料的载体和结合该CAR材料的胶原VI或其生物活性片段或变体，以及任选的一种或多种其他ECM蛋白质或其生物活性片段或变体和/或一种或多种聚阳离子聚合物。
美国专利5512474描述了细胞生物学领域的生物反应器的细胞培养表面，尤其描述了改善表面以获得更好的细胞附着和细胞生长的方法。公开了细胞培养载体，其包括微载体形式的载体材料和用于细胞附着的承载表面，该表面具有包括以下物质的组合：带正电荷的分子和由丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺聚合而成的丙烯酸类物质。
美国专利5932473描述了用组合物涂布的细胞培养基材，所述组合物包含在盐溶液中的促细胞粘着剂。用在0.005M-约0.5M柠檬酸盐或硫酸盐溶液中包含约5μg/ml-约1000μg/ml聚D-赖氨酸的组合物涂布基材，例如塑料、玻璃或微孔纤维，以便为每cm2基材提供约50μl-约500μl该组合物。
Ma，M.等，2006(Neuroscience Lett.，403，84-89)描述了粘着性哺乳动物神经元网络的深低温保藏。将分离的脊髓细胞附着于35mm培养皿上，该培养皿上已涂布有两种粘着因子：聚D-赖氨酸和层粘连蛋白。然后将该网络嵌入胶原，并装载冷冻保护剂海藻糖，随后转移到包含DMSO、FBS和培养基的冷冻培养基。将该网络在-196的液氮中贮藏至多2个月。深低温保藏后该网络的表征包括：利用发光探针(Viability/Cytotoxity试剂盒，Molecular Probes)测定细胞生存力、通过免疫细胞化学测定神经元标记的表达和利用发光探针FM1-43(Molecular Probes)阐明突触小泡再循环。
Son，J.H.等，2004(Biotechnology Letters，26，829-833)描述了利用1型胶原涂覆的6孔板和包含DMSO、胎牛血清和培养基的冷冻混合物促进大鼠肝细胞的深低温保藏。细胞在-70℃仅进行短期(24hr)深低温保藏。深低温保藏后肝细胞的表征包括利用简单的分光光度法MTT测定法测定细胞生存力和利用基于ELISA的系统测定白蛋白分泌。
Shoji R.等，2000(Cytotechnology，32，147-155)描述了利用1型胶原、纤维结合素连接蛋白(pronectin F)或粘连蛋白涂覆的96孔板深低温保藏人肝癌细胞。这些试剂用来促进细胞附着。深低温保藏在-85℃利用补充有10％DMSO的肝细胞培养基完成。这些条件讲细胞维持最佳状态约7天。深低温保藏后肝细胞的表征限于仅贮藏7天的细胞，包括通过测量酸性磷酸酶活性测定细胞生存力和体外细胞毒性试验(响应有毒试剂挑战的存活/死亡剂量应答曲线)。
技术问题
在制药工业中需要在容器中深低温保藏细胞，该容器可用于低温贮藏和随后用于筛选目的二者；因此，该容器能贮藏在零下温度，并简单地从冰箱中移走使得细胞能够解冻和直接用于HTS。目前，细胞通常深低温保藏在小瓶(例如冷冻小瓶)中，并于低温贮藏在这些小瓶中直到试验所需；然后将细胞逐渐复苏/解冻、用缓冲液洗涤并转移到培养皿或微孔板上，为HTS的检验/测定作准备。此时，细胞由于解冻时的高死亡率和测定应答的易变性二者而不能深低温保藏在培养皿或微孔板中。后者在这样的测定中获得的低Z-因子中明显。深低温保藏细胞并在相同容器或器皿中对复苏细胞进行测定的能力将为制药工业提供可行的技术。
因此，存在通过去掉从小瓶/冷冻小瓶转移到培养皿/微孔板的过程中的一个或多个步骤来改进工艺流程从而简化步骤以减少成本和时间的需要。此外，存在改善已深低温保藏在培养皿或微孔板中的细胞的细胞生存力和/或测定性能的需要。
本发明解决上述问题，并提供深低温保藏细胞培养物和制备它们的方法，其使得能够在单个容器中深低温保藏和测定复苏细胞。
发明概述
依据本发明第一方面，提供深低温保藏细胞培养物，其包括：至少具有表面的容器、承载在所述表面上的冷冻细胞，其中所述表面涂覆有聚赖氨酸。
已知聚赖氨酸促进某些细胞类型附着到表面，但也已令人惊奇地发现其通过独立于细胞附着的过程改善测定性能(甚至在长时间的深低温保藏后)。
聚赖氨酸常规用作增进哺乳动物细胞粘着到细胞培养处理表面的分子。这通过简单地用阳离子聚赖氨酸的溶液涂布固体表面(塑料、玻璃等)来实现。聚赖氨酸部分可与存在于塑料和/或玻璃表面的带负电荷的分子产生静电引力。
聚赖氨酸可获自多个供应商(例如Sigma，P7405，＞300k或P6407，70-150k)。聚赖氨酸增强细胞膜的带负电荷离子和培养表面之间的静电相互作用。当被吸附到培养表面上时，聚赖氨酸增加了可用于细胞结合的带正电荷位点的数目。聚D-赖氨酸聚合物和聚L-赖氨酸聚合物二者以及其混合物均可用于涂覆固体表面。但是，某些细胞能够以蛋白酶解方式降解聚L-赖氨酸，在这种情况下，聚D-赖氨酸通常用于防止L-赖氨酸的过度降解和最终吸收。
低分子量聚赖氨酸(Mr＝30,000-70,000kD)比较容易利用，因为它在溶液中粘性较小，但是＞300,000kD的高分子量为每个分子提供更好的细胞附着。细胞生物学中通常使用的聚赖氨酸的分子量范围一般为70,000-150,000kD。
在本发明另一个方面，细胞培养容器选自器皿、小瓶、微量滴定板和细胞培养板。
在本发明又一个方面，在细胞培养表面上冷冻的细胞选自哺乳动物细胞、昆虫细胞、两栖动物细胞、鱼类细胞、爬行动物细胞和禽类细胞。优选所述细胞为哺乳动物细胞。更优选所述细胞选自CHO细胞(来源：ECACC-85050302)、HEK293细胞(来源：ATCC-CRL1573)和AD293细胞(来源：Invitrogen R705-07)。
依据本发明第二方面，提供在细胞培养物中深低温保藏细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将含有细胞的培养基加到容器表面，使得细胞附着在所述表面上并形成细胞培养物
b)加入深低温保藏培养基，和
c)将所述细胞培养物的温度降低至-20℃或更低；
其中在步骤a)之前用聚赖氨酸涂覆所述表面。
聚赖氨酸是用作涂料以增强细胞附着到塑料和玻璃表面的分子。它已用于培养多种类型细胞，包括神经元、胶质细胞和转染细胞。聚D-赖氨酸通常用作培养基材，以促进多种神经元细胞系和转染细胞系的粘着、生长和分化。聚D-赖氨酸、聚L-赖氨酸二者和其混合物均可用于涂覆固体表面，且传统上用作细胞的非特异性附着因子。聚赖氨酸的已知功能之一是增强与细胞膜相关联的带负电离子和细胞培养表面之间的静电相互作用。当被吸附到细胞培养表面上时，聚赖氨酸增加了可用于细胞结合的带正电荷位点的数目。
在本发明另一个方面，细胞培养容器选自器皿、小瓶、微量滴定板和细胞培养板。
在本发明又一个方面，在细胞培养系统的表面上冷冻的细胞选自哺乳动物细胞、昆虫细胞、两栖动物细胞、鱼类细胞、爬行动物细胞和禽类细胞。优选所述细胞为哺乳动物细胞。更优选所述细胞选自CHO细胞、HEK293细胞和AD293细胞。
在本发明另一个方面，细胞贮藏在低于-80℃的温度。更优选地，将细胞培养板冷冻至-80℃并持续16小时，之后转移到-140℃长期贮藏。
依据本发明第三方面，提供用于进行细胞测定的方法，所述方法包括以下步骤：a)将含有细胞的培养基加到容器表面，使得细胞附着在所述表面上并形成细胞培养物；b)加入深低温保藏培养基；c)降低所述细胞培养物的温度以冷冻细胞；d)在低于-20℃的温度下贮藏所述细胞培养物；e)通过升高所述细胞培养物的温度解冻细胞；和f)对细胞进行细胞测定，其中在步骤a)之前用聚赖氨酸涂覆所述容器表面。
在一个方面，所述方法包括：将含有细胞的培养基加到容器表面，使得细胞在所述表面上附着16小时的时间和形成细胞培养物；用深低温保藏培养基(90％胎牛血清和10％二甲基亚砜(DMSO))替换生长培养基；降低所述细胞培养物的温度以冷冻细胞；在低于-20℃的温度下贮藏所述细胞培养物；接着通过升高所述细胞培养物的温度解冻细胞；和对细胞进行细胞测定。
在另一个方面，所述细胞培养物贮藏于-80℃的温度。
在又一个方面，聚赖氨酸选自聚D-赖氨酸、聚L-赖氨酸和其混合物。
在又一个方面，所述容器选自器皿、小瓶、微量滴定板和细胞培养板。优选所述容器是细胞培养板。
在一个方面，所述细胞是贴壁细胞。特别地，所述细胞选自哺乳动物细胞、昆虫细胞、两栖动物细胞、鱼类细胞、爬行动物细胞和禽类细胞。优选所述细胞为哺乳动物细胞。更优选所述细胞选自CHO细胞、HEK293细胞和AD293细胞。
在另一个方面，将步骤a)中所用细胞附着到一种或多种微载体上。优选所述微载体涂覆有聚赖氨酸。
在本发明又一个方面，所述细胞培养容器选自器皿、小瓶、微量滴定板和细胞培养板。
定义：
以下术语在本发明的上下文中应理解为：
细胞测定—用于检查由化合物作用所引发的细胞过程的方法或试验和用于测量细胞输出的工具。这样的测定尤其可用于药物筛选。技术人员将会理解，细胞死亡或生存力不包括在该定义中。
深低温保藏—通过利用深低温保藏法保藏(在一般为-20℃和更低的深冷温度保藏包含完整活细胞的生物组织)。
冷冻细胞—在-20℃或更低的温度维持的完整活生物细胞。
深低温保藏培养基—有时称为“细胞冷冻培养基”，是包含在深低温保藏或冷冻期间减少细胞损伤或伤害的试剂或成分的任何培养基。这样的深低温保藏培养基的实例包括但不限于二甲基亚砜(DMSO)、胎牛血清、甘油、Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、海藻糖及其混合物。
信号:本底(S:B)
这实质上是用+激动剂(刺激物)测定的平均值除以-激动剂(刺激物)测定的平均值。
信号:噪音(S:N)
该公式考虑了用信号测定和本底测定观察的标准差。它是测定性能的指示。
Figure BPA00001390383700111
Z-因子
其通常被制药工业用来评价测定性能。在统计学中，Z-因子是高通量筛选测定质量或能力的量度。该公式包括+激动剂和-激动剂测定的平均数和标准差。值越接近于1，性能越好。对于基于细胞的测定，＞0.40通常认为良好，而0.5以上的值认为是极好(Zhang等.(1999)A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation andValidation of High Throughput Screening Assays(用于高通量筛选测定的评估和验证的简单统计学参数).(J Biomol Screen.，4(2)67-73)。
Figure BPA00001390383700121
通过本发明优选实施方案的下述描述，本发明的更多特征和优点将变得明显，该描述是参考附图仅以实施例的方式给出。
附图说明
以实施例方式给出的以下描述并非旨在将本发明限制到描述的任何具体实施方案。该描述可结合通过引用结合到本文中的附图理解。
图1a显示深低温保藏前后在涂覆和未涂覆聚赖氨酸的板上生长的稳定表达由水泡性口膜炎病毒表位标签-β2肾上腺素能受体-增强绿色发光蛋白质细胞组成的重组蛋白质的中国仓鼠卵巢细胞(CHOVSV-β2AR-EGFP稳定细胞)图的比较。
图1b显示深低温保藏前后在涂覆和未涂覆聚赖氨酸的板上生长的人胚肾293-水泡性口膜炎病毒标签-β2肾上腺素能受体-增强绿色发光蛋白质细胞(HEK293 VSV-β2AR-EGFP稳定细胞)图的比较。图2显示在涂覆和未涂覆聚赖氨酸的板上接种的细胞系(CHO VSV-β2AR-EGFP稳定细胞系和HEK293 VSV-β2AR-EGFP稳定细胞系)在解冻后利用Cell Titer-Glo发光细胞生存力测定(luminescent cellViability Assay，Promega)测定的生存力的比较。
图3显示在涂覆和未涂覆聚赖氨酸的板上接种的深低温保藏AD293细胞的测定性能比较。
图4显示CHO VSV-β2AR-EGFP细胞的激动剂(a)和拮抗剂(b)的剂量应答曲线。
图5显示HEK293 VSV-β2AR-EGFP细胞的激动剂(a)和拮抗剂(b)的剂量应答曲线。
发明详述
在第一方面，本发明是深低温保藏细胞培养物，其包括至少具有承载冷冻细胞的表面的容器，其中所述细胞培养表面涂覆有聚赖氨酸。在细胞培养系统中提供预分配的深低温保藏细胞将减少细胞培养物操作所花费的时间量。细胞可以是瞬时转染或稳定转染细胞。处理“即用型”预冷冻细胞包括简单地将板解冻、除去冷冻培养基，之后是简单的PBS洗涤和加入测定培养基。
已令人惊奇地发现聚赖氨酸化合物通过独立于细胞附着的过程改进测定性能(甚至在长时间深低温保藏之后)。该改进通过至少两种单独的机制起作用：
i)促进和维持HEK293细胞粘着尤其在长时间深低温保藏之后和经历多个洗涤步骤。聚赖氨酸介导的细胞附着是HEK293细胞非常确实的现象；确实增强的细胞粘着是聚赖氨酸的主要细胞生物学用途之一。
ii)聚赖氨酸影响CHO细胞系形态(Sordel等，Influence of glassand polymer coatings on CHO cell morphology and adhesion(玻璃或聚合物涂层对CHP细胞形态和粘着的影响).Biomaterials第28卷，第8期，1572-1584，2007)。在传统的CHO细胞培养物中，不常规使用聚赖氨酸，因为CHO细胞很有效地附着于“细胞培养塑料”上，故认为它是不必要的。然而，在细胞深低温保藏前聚赖氨酸的使用似乎增强测定性能，且未影响细胞粘着。根据对CHO细胞±聚赖氨酸更细致的检查，在表现出隆起形态的细胞数目和改进的测定性能(通过Z-因子测量确定)之间似乎存在相关性。
聚D-赖氨酸和聚L-赖氨酸均可用于涂覆固体表面，且传统上用作细胞的非特异性附着因子。聚赖氨酸的已知功能之一是增强与细胞膜相关联的带负电离子和细胞培养表面之间的静电相互作用。当被吸附到细胞培养表面上时，聚赖氨酸增加可用于细胞结合的带正电荷位点的数目。可获得不同分子量范围的聚赖氨酸，例如Mr30,000-70,000的聚赖氨酸在溶液中粘性较小，因此较易分配，然而，＞300,000的聚赖氨酸为每个分子提供更多附着位点。作为折衷，优选聚赖氨酸的Mr是70,000-150,000。
在有些情况下，某些细胞能够以蛋白酶解方式降解聚L-赖氨酸，这种情况下，细胞可因L-赖氨酸的过度吸收而遭到破坏，因此应将聚D-赖氨酸以聚阳离子形式使用。
细胞培养容器选自器皿、小瓶、微量滴定板和细胞培养板。
在细胞培养表面上冷冻的细胞选自哺乳动物细胞、昆虫细胞、两栖动物细胞、鱼类细胞、爬行动物细胞和禽类细胞。所述细胞优选为哺乳动物细胞；更优选为选自CHO细胞、HEK293细胞和AD293细胞的哺乳动物细胞。
下述列表由表示可能适用于本发明用途的细胞的哺乳动物细胞组成。该列表是作为实例给出，不应被认为是限制性的。此外，稳定表达异源基因的细胞也是该实施方案的一部分，例如前述稳定表达β2肾上腺素能受体的HEK293和CHO细胞系。
Figure BPA00001390383700141
Figure BPA00001390383700151
低分子量聚赖氨酸(Mr＝30,000-70,000kD)较易利用，因为它在溶液中粘性较小，但是＞300,000kD的高分子量为每个分子提供更好的细胞附着。细胞生物学中通常使用的聚赖氨酸分子量范围一般为70,000-150,000kD。
已表明经聚赖氨酸处理的固体表面支持神经突长出和提高许多来源于中枢神经系统的细胞的存活。因为聚α-赖氨酸是合成化合物，故它通常不刺激培养细胞中的生物反应。因为它经合成产生，故它通常不包含任何可能是其他天然聚合物相关的问题的生物学杂质。
在聚赖氨酸上常规培养的一些细胞系实例包括—HEK293人胚肾细胞(Sugawara，T.等.A missense mutation of the Na+ channel alpha IIsubunit gene Na(v)1.2 in a patient with febrile and afebrile seizurescauses channel dysfunction(在患有发热性和无热性癫痫患者中Na+通道αII亚基基因Na(v)1.2的错义突变导致通道功能障碍). Proc NatlAcad Sci U S A.98(11)，6384-9，2001)、MDA-231乳腺癌细胞系(Yoneda，T.等.Inhibition of溶骨性骨转移of breast cancer by combinedtreatment with the bisphosphonate ibandronate and tissue inhibitor of the基质金属蛋白酶-2(通过用伊班二膦酸盐和基质金属蛋白酶-2组织抑制剂的联合治疗抑制乳腺癌的溶骨性骨转移).J.Clin.Invest.99(10)，2509-17，1997)、垂体前叶细胞(Hinuma，S，等.A prolactin-releasingpeptide in the brain(脑中释放催乳素的肽).Nature，393(6682)，272-6，1998)、小胶质MG-7细胞(Szczepanik，AM.等.Amyloid-beta peptidefragments p3 and p4 induce pro-inflammatory cytokine and chemokineproduction in vitro and in vivo(淀粉状β肽片段p3和p4诱发体外和体内促炎细胞因子和趋化因子产生).J.Neurochemistry，77(1)，304-17，2001)和大鼠原代星形胶质细胞(Little，EB.等.A short segment within thecytoplasmic domain of the neural cell adhesion molecule(N-CAM)isessential for N-CAM induced NF-kappa B activity in astrocytes(神经细胞粘着分子(N-CAM)的胞质域内的短节段对于星形胶质细胞中的N-CAM诱导的NF-kappa B活性是必不可少的).PNAS USA，98(5)，2238-43，2001)。
聚L-赖氨酸也已用于培养作为图案化共培养的两种不同细胞。透明质酸用于将初始细胞固定到玻璃基材上。随后，将聚L-赖氨酸以不连续图案的方式吸附到透明质酸上，从而改变培养表面的性质，因此促进第二种类型细胞的粘着。已证明利用该方法共培养胚胎干细胞和成纤维细胞(Khademhosseinin，A.等.Layer-by-layerdeposition of hyaluronic acid and poly L-lysine for patterned cell co-cultures(透明质酸和聚赖氨酸的逐层沉积以使细胞共培养物图案化)，Biomaterials，25，3583-92，2004)。
聚赖氨酸涂覆的电子显微镜样品薄膜已用于观察双链和单链DNA分子。(Williams，RC.Use of polylysine for adsorption of nucleiacids and enzymes to electron microscope specimen films(在电镜样品膜中使用聚赖氨酸吸附核酸和酶)，PNAS，74(6)，2311-2315，1977)。
双歧杆菌(Bifidobacterium)是存在于人肠道菌丛中不运动的革兰氏阳性厌氧细菌。在微胶囊制备期间已将这些细菌结合到藻酸盐聚L-赖氨酸微胶囊中，以有助于深低温保藏。载有细菌的微胶囊经冻干，并进行长期深冷贮藏。在这种情况下，聚赖氨酸事实上不起冷冻保护剂的作用，而是用作稳定碱性藻酸盐结构的工具(Cui，JH.等.Effect of Additives on the Viability of Bifidobacteria Loaded in AlginatePoly-l-lysine Microparticles during the Freeze-drying Process(在冻干过程期间添加剂对装载在藻酸盐聚赖氨酸微粒中的双歧杆菌的生存力的影响)，Arch Pharm.Res.，29(8)，707-711，2006)。
聚L-赖氨酸涂覆的塑料和玻璃皿也已用于研究鱼胚胎发育相关过程。鱼卵通常不附着于许多经细胞培养物处理的表面。但是，这些卵会附着于已涂覆有聚赖氨酸的塑料和玻璃皿上。然后引入精子使卵子受精，并监测之后的发育过程(Andoh，T.等.The use of poly-L-lysine to facilitate examination of sperm entry into pelagic，non-adhesivefish eggs(使用聚赖氨酸便于观察精子进入深海非粘着型鱼卵)，Int.J.Dev.Biol.52，753-7，2008)。
实验
本发明的实施例仅提供用于阐述目的，不应视为限制由所附权利要求限定的本发明的范围。本说明书下文和他处给出的所有参考文献均通过引用包含于本文中。
1.用聚D-赖氨酸涂覆细胞培养板
将聚D-赖氨酸氢溴酸盐(Sigma，P7405，＞300k或P6407，70-150k)—聚D-赖氨酸溶解到无菌磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，浓度为100ng/ml。将等分试样(50μl)分配到96孔细胞培养板的各孔中。将其在室温(通常为25℃)下温育30min。该时间过后，将任何剩余的聚D-赖氨酸溶液倾析，并用无菌磷酸缓冲盐溶液(PBS)(200μl)洗涤各孔3次。
保留最后加入的100μl PBS以防干燥。聚赖氨酸涂覆的板可在冰箱中贮藏数天，但常规在48小时内使用。
举例给出聚D-赖氨酸的使用，且决非限制性的。
2.深低温保藏
利用描述于“Cells-A laboratory Manual(细胞-实验室手册)”，Spector D.L.，Goldman R.D.和Leinwand L.A.，Cold Spring Harborlaboratory press(1998)的常规细胞培养技术在细胞培养器皿中使细胞生长。在适当的生长期，使用市售x1胰蛋白酶/EDTA(乙二胺四乙酸)将细胞从细胞培养器皿表面移走，并重新悬浮到适当的细胞培养基中。按照制造商的说明书用Chemotec Nucleocounter测定细胞数目。
将体积为100μl和20μl的20,000或5,000个细胞分别分配到96孔或384孔用聚赖氨酸涂覆的Costar组织培养处理的白色聚苯乙烯细胞培养物测定板(商品目录号3917和3712)中，使其附着和复苏16小时。第二天，除去培养基并用市售PBS洗涤细胞2次。将由90％胎牛血清和10％DMSO组成的深低温保藏培养基分配到附着细胞上面。然后，用parafilm(Pechiney Plastic Packages)或WhatmanLaboratory密封膜密封细胞培养板的边缘，并用Saran Barrier Wrap(Dow Chemical Company)缠绕整个平板。将细胞培养板冷冻至-80℃持续16小时，之后转移到-140℃长期贮藏。
3.测定性能
在复苏时，将冷冻的细胞培养板从-140℃移走并使其解冻。除去深低温保藏培养基，并用预热的PBS洗涤细胞2次。然后加入补充有合适激动剂的测定培养基。利用对于所用报道分子系统最为合适的方法和/或市售试剂盒进行基于细胞的测定。
(i)聚赖氨酸对细胞附着和形态的影响
在了解聚赖氨酸对细胞附着和形态的影响的过程中，比较深低温保藏前后在涂覆和未涂覆聚赖氨酸的板上生长的细胞图(图1)。
就CHO VSV-β2AR-EGFP稳定细胞系(图1a)而言，在聚赖氨酸存在下观察到隆起的细胞形态。当细胞在无聚赖氨酸情况下生长时，不存在该形态。
就HEK293 VSV-β2AR-EGFP稳定细胞(图1b)而言，聚赖氨酸清楚地通过促进和维持细胞附着起作用。在无聚赖氨酸情况下，细胞可能在深低温保藏和洗涤步骤期间脱离。
ii)聚赖氨酸对细胞系生存力的影响
在解冻后用Cell Titer-Glo发光细胞生存力测定(Promega)对接种到涂有聚赖氨酸的板上的细胞系的生存力进行测定。
将细胞接种到96孔板(±聚赖氨酸)中、深低温保藏，然后复苏。
可从图2看到，就CHO VSV-β2AR-EGFP稳定细胞系而言，当CHO细胞与或不与聚赖氨酸一起铺板时，未发现细胞生存力的显著差异，表明聚赖氨酸不促进细胞附着或改善深低温保藏。
然而，就HEK293 VSV-β2AR-EGFP稳定细胞而言，聚赖氨酸的存在显著提高了产生的发光信号。与细胞图像数据一起，这些数据表明聚赖氨酸在深低温保藏和洗涤步骤期间支持和维持HEK293细胞附着。
iii)聚赖氨酸对细胞测定性能的影响
将细胞以20,000个细胞/孔的密度接种到带有(+)或未带有(-)聚赖氨酸的96孔板中，并使其附着过夜，除去生长培养基并加入冷冻培养基(90％胎牛血清和10％二甲亚砜)。将板密封并深低温保藏。作为对照，也利用传统的“冷冻小瓶”保藏系统深低温保藏细胞。(Cells-Alaboratory Manual(细胞-实验室手册)，Spector D.L.，Goldman R.D.和Leinwand L.A.，Cold Spring Harbor laboratory press(1998)。
为解冻冷冻小瓶中所含细胞，用细胞特异性生长培养基稀释深低温保藏培养基，并将悬浮液离心(1,000xg，5min)。将得到的细胞沉淀重新悬浮到新鲜的生长培养基中，并以20,000细胞/孔的密度将细胞分配到96孔板(带有(+)和不带(-)聚赖氨酸涂层)的孔中。在测定前，在37℃和5％CO2的条件下将细胞温育16小时，以促进细胞附着。
在测定时，将板从冰箱中移走并解冻。除去冷冻培养基，用PBS洗涤细胞，并加入含β2AR激动剂异丙基肾上腺素的培养基。用DiscoverX的Hithunter cAMP II和Leadseeker Instrument(GEHealthcare)监测在GPCR活化时cAMP水平的上升。利用毛喉素的腺苷酸环化酶测量用作对照(未显示)。
在描述的实验中，用β2AR激动剂异丙基肾上腺素或者拮抗剂异普萘洛尔(isopropranolol)攻击稳定转染β2AR的HEK293和CHO细胞。一旦暴露于激动剂，胞内cAMP浓度上升，这些浓度可通过多种市售发光试剂盒例如HitHunter cAMPII试剂盒(DiscoveRx)联合Leadseeker Instrument平台(GE Healthcare)监测。
作为对照，在用其相应的激动剂毛喉素攻击遍在表达的腺苷酸环化酶活性时，也分别监测胞内cAMP浓度的上升。在AD293细胞系中，仅监测腺苷酸环化酶活性。
由于DiscoveRx测定系统设计用于监测胞内cAMP浓度，故测定培养基补充有终浓度为1mM的一般性磷酸二酯酶抑制剂异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)。
异丙基肾上腺素测定—将异丙基肾上腺素(Sigma I2760)溶于水中至储备浓度为100mM。然后将其稀释以在测定培养基中产生最终的异丙基肾上腺素浓度范围200μM-1pM。
毛喉素测定—将毛喉素(Sigma F6886-10mg)溶于DMSO中至储备浓度为10mM。然后用半对数稀释法将其系列稀释以在测定培养基中产生最终的毛喉素浓度范围316μM-3.16nM。
普萘洛尔测定—将普萘洛尔(Sigma P8688)溶于水中至储备浓度为100mM。然后将其稀释以在测定培养基中产生最终的普萘洛尔浓度范围200μM-1pM。在20nM异丙基肾上腺素存在情况下作普萘洛尔的剂量应答曲线。
也进行无激动剂对照，其中将减去激动剂或拮抗剂的测定培养基加入到细胞。
DiscoveRx HitHunter cAMP II测定—这是按照制造商说明书进行，简要包括以下步骤。在从-140℃的储藏库中复苏时，使在细胞培养处理的96孔板上冷冻的细胞解冻。在解冻时，除去深低温保藏培养基并用PBS洗涤细胞2次。然后加入补充有1mM IBMX和合适的激动剂和/或拮抗剂的测定培养基。
一般地，对于在96孔细胞培养处理的板中进行的测定，使用20,000个细胞。一经加入测定培养基到细胞，将测定板在37℃温育30分钟，之后加入40μl的DiscoveRx cAMP II ED/底物混合物。其由1份cAMP II ED试剂与1份Substrate Working Solution(SubstrateWorking Solution由1份Galacton-Star、5份Emerald II和19份Substrate Diluent组成)组成。涡动测定板以确保有效的细胞覆盖。然后加入等体积的EA-Ab/Lysis混合物(40μl)。其由1份cAMP IIEA-Ab试剂和1份cAMP II裂解缓冲液组成。将测定板在室温下温育4小时，并通过利用Leadseeker Instrument平台监测发光信号的产生来测定cAMP浓度。
除了每孔仅分配5,000个细胞以及使用体积减少50％的DiscoveRx cAMP II ED/Substrate混合物和EA-AB/Lysis混合物(即减少至20μl)之外，在384孔细胞培养处理的板中进行的测定与上述一样。
就CHO VSV-β2AR-EGFP细胞而言，在无聚赖氨酸情况下，相比用聚赖氨酸涂覆的冷冻小瓶和板，冷冻超过4周的板的测定性能在S/B、S/N和尤其Z-因子方面下降。以下两种情况的细胞均表现出相当的测定性能：(i)在涂覆和未涂覆聚赖氨酸的板上测定时的冷冻小瓶保藏细胞，和(ii)在涂覆聚赖氨酸的板上直接深低温保藏和测定的细胞。可从表1看出，对于在冷冻小瓶中深低温保藏并随后复苏和转移到微量滴定板以测定的细胞，聚赖氨酸似乎对测定性能基本无影响。
表1
Figure BPA00001390383700221
就HEK293 VSV-β2AR-EGFP细胞系而言，在两种深低温保藏和测定系统(即(i)在冷冻板上深低温保藏和测定，和(ii)在冷冻小瓶中深低温保藏并转移到板上测定)中，均观察到聚赖氨酸对测定性能的积极影响。(表2)。在无聚赖氨酸情况下，复苏细胞的测定性能差。
表2
Figure BPA00001390383700231
iv)聚赖氨酸对深低温保藏AD293细胞的测定性能具有有利的影响(图3和表3)。这些是已被基因工程改造以提高粘着性质的HEK293细胞。
表3：
Figure BPA00001390383700232
从这些数据可看出，聚赖氨酸不但显著增加AD293细胞对毛喉素刺激的应答程度(图3和表3)，而且产生提高的Z-因子，表明更好的测定性能。
CHO VSV-β2AR-EGFP—激动剂和拮抗剂剂量应答曲线
异丙基肾上腺素Ec50值—利用细胞进行的测定表现出相当的测定性能，这些细胞或i)利用传统的冷冻小瓶系统深低温保藏(并随后转移到有或无聚赖氨酸涂覆的测定微量滴定板上测定)，或ii)在聚赖氨酸涂覆的微量滴定板上直接深低温保藏和测定(图4a)。
当在无聚赖氨酸的情况下用微量滴定板形式深低温保藏细胞时，观察到较差的测定性能。响应激动剂刺激的信号变化明显增强，激动剂诱导应答的程度下降。令人感兴趣的是，所有测定响应激动剂异丙基肾上腺素表现出相当的Ec50值。因此，所有细胞似乎产生适当的激动剂诱导应答；但是，当在无聚赖氨酸的板上深低温保藏细胞时，应答程度较低。
普萘洛尔Ic50值—对于利用β2AR拮抗剂普萘洛尔进行(在20nM异丙基肾上腺素(ISPL)存在情况下进行)的测定，观察到类似的趋势。仅在CHO VSV-β2AR-EGFP细胞直接深低温保藏到无聚赖氨酸的微量滴定板中的那些测定中观察到性能下降。同样观察到相当的Ic50结果。(图4b)。
如先前所示，聚赖氨酸不影响CHO细胞生存力或附着。因此，这些数据表明聚赖氨酸的存在仅提高直接深低温保藏在96孔微量滴定板中的那些细胞的测定性能。这些细胞的性能与深低温保藏在冷冻小瓶中并随后转移到测定板中的细胞所表现的性能相当。因此，直接深低温保藏在亦适合用作测定板的聚赖氨酸涂覆的板中的细胞减少了所需的时间量和人工操作。
HEK293 VSV-β2AR-EGFP—激动剂和拮抗剂的剂量应答曲线(图5)
异丙基肾上腺素Ec50值—仅对于其中细胞已接种到聚赖氨酸涂覆的微量滴定板上的那些测定表现出相当的测定性能。这包括i)深低温保藏在冷冻小瓶中并随后转移到聚赖氨酸涂覆的板上测定的细胞，和ii)直接深低温保藏在聚赖氨酸涂覆的板中的细胞(图5a)。
HEK293细胞传统上需要聚赖氨酸促进细胞附着微量滴定板。相比于深低温保藏在聚赖氨酸涂覆的板上的相同细胞，接种在未涂覆的板上并随后深低温保藏的HEK293细胞数目减少。因此，提高HEK293细胞测定性能的聚赖氨酸性质之一涉及增强的细胞附着。
当细胞用无聚赖氨酸的微量滴定板形式深低温保藏(甚至当在冷冻小瓶中深低温保藏并转移到未涂覆的板上时)，观察到较差的测定性能。同样，响应激动剂刺激的信号变化明显增大，激动剂诱导应答的程度下降。
不管条件如何，所有测定表现出响应激动剂异丙基肾上腺素的相当的Ec50值，因此所有细胞表现适当的应答；但是，当细胞在无聚赖氨酸情况下深低温保藏(并在板上测定)时，应答程度较低。
普萘洛尔Ic50值—对于利用β2AR拮抗剂普萘洛尔进行(在20nM ISPL存在下进行)的测定，观察到类似的倾向。仅在无聚赖氨酸的微量滴定板上测定HEK293细胞(与深低温保藏培养基无关)的那些测定中观察到性能下降。对于所有测定，同样观察到相当的Ic50结果，仅程度和变化在有无(±)聚赖氨酸涂覆的板中不同(图5b)。
这些数据表明，聚赖氨酸的存在不仅提高了直接深低温保藏在96孔微量滴定板中的细胞的测定性能，而且提高了保藏在冷冻小瓶中并随后转移到聚赖氨酸涂覆的测定板上的那些细胞的测定性能。直接深低温保藏在聚赖氨酸涂覆的板中的HEK293细胞的性能与深低温保藏在冷冻小瓶中并随后转移到测定板中的细胞所表现的性能相当。将细胞直接深低温保藏在可随后用于测定的板上，既减少了所需的时间量，又减少了所需的人工操作。
这些数据进一步说明，在深低温保藏之前用聚赖氨酸预涂覆的96孔微量滴定板在解冻时提高了细胞测定性能。另外的优点是其还减少了所需的时间量和人工操作。

Claims (14)

1.一种深低温保藏细胞培养物，包括：
至少具有表面的容器、
承载在所述表面上的冷冻贴壁细胞，
深低温保藏培养基，且
其特征在于所述表面涂覆有聚赖氨酸。
2.权利要求1的细胞培养物，其中所述容器选自器皿、小瓶、微量滴定板和细胞培养板。
3.前述权利要求中任一项的细胞培养物，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
4.一种在细胞培养物中深低温保藏细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
a) 将含有贴壁细胞的培养基加到容器表面，使得所述细胞附着在所述表面上并形成细胞培养物，
b) 加入深低温保藏培养基，和
c) 将所述细胞培养物的温度降低至-20℃或更低；
其特征在于在步骤a)之前用聚赖氨酸涂覆所述表面。
5.权利要求4的方法，其中通过用聚赖氨酸的溶液洗涤所述表面来涂覆所述表面。
6.权利要求4-5中任一项的方法，其中所述容器选自器皿、小瓶、微量滴定板和细胞培养板。
7.权利要求4-5中任一项的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
8.权利要求4-5中任一项的方法，还包括在低于-80℃的温度贮藏所述细胞培养物的步骤。
9.一种用于进行细胞测定的方法，所述方法包括以下步骤：
a) 将含有贴壁细胞的培养基加到容器表面，使得所述细胞附着在所述表面上并形成细胞培养物，
b) 加入深低温保藏培养基，
c) 降低所述培养基的温度以冷冻所述细胞培养物，
d) 将所述细胞培养物贮藏在低于-20℃的温度，
e) 通过升高所述细胞培养物的温度解冻所述细胞；
f) 对所述细胞进行细胞测定，
其特征在于在步骤a)之前用聚赖氨酸涂覆所述容器表面。
10.权利要求9的方法，其中所述细胞培养物贮藏在低于-80℃的温度。
11.权利要求9-10中任一项的方法，其中所述容器选自器皿、小瓶、微量滴定板和细胞培养板。
12.权利要求9-10中任一项的方法，其中将步骤a)的细胞附着在一种或多种微载体上。
13.权利要求12的方法，其中用聚赖氨酸涂覆所述一种或多种微载体。
14.权利要求9、10和13中任一项的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
CN200980151813.8A 2008-12-18 2009-12-16 用于进行细胞测定的方法 Expired - Fee Related CN102256481B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0823056.7 2008-12-18
GBGB0823056.7A GB0823056D0 (en) 2008-12-18 2008-12-18 Methods for conducting cellular assays
PCT/EP2009/067249 WO2010079058A2 (en) 2008-12-18 2009-12-16 Methods for conducting cellular assays

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102256481A CN102256481A (zh) 2011-11-23
CN102256481B true CN102256481B (zh) 2014-06-18

Family

ID=40343779

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200980151813.8A Expired - Fee Related CN102256481B (zh) 2008-12-18 2009-12-16 用于进行细胞测定的方法

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20110250632A1 (zh)
EP (1) EP2369918A2 (zh)
JP (1) JP5943607B2 (zh)
KR (1) KR20110100625A (zh)
CN (1) CN102256481B (zh)
AU (1) AU2009336729A1 (zh)
CA (1) CA2747675A1 (zh)
GB (2) GB0823056D0 (zh)
HK (1) HK1161530A1 (zh)
SG (1) SG172255A1 (zh)
WO (1) WO2010079058A2 (zh)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102124098B (zh) * 2008-06-27 2014-03-12 博傲沃德株式会社 细胞及组织的冷冻保存用组合物
CN102719480A (zh) * 2012-07-08 2012-10-10 大连医科大学 悬浮细胞脂质体转染用细胞培养板预处理方法
US20150048085A1 (en) 2013-08-16 2015-02-19 Corning Incorporated Vessels and methods for cryopreservation
CN108430217B (zh) 2015-11-16 2021-10-22 康宁股份有限公司 低温用瓶组件
US10638748B2 (en) 2015-12-22 2020-05-05 Corning Incorporated Break away/tear away cryopreservation vial and methods for manufacturing and using same
JP6911852B2 (ja) 2016-06-15 2021-07-28 日産化学株式会社 凍結保存用容器
CN105936889B (zh) * 2016-06-24 2019-10-18 肇庆大华农生物药品有限公司 一种ad293球形细胞团的培养方法
CN107022571A (zh) * 2017-05-18 2017-08-08 山西大学 一种转染Jurkat细胞的方法
CN107306939B (zh) * 2017-07-31 2020-09-15 山东水发生命科学研究有限公司 一种用于树突状细胞的细胞冻存液
WO2020067434A1 (ja) * 2018-09-27 2020-04-02 テルモ株式会社 細胞の凍結保存方法
CN110437486B (zh) * 2019-08-20 2020-07-07 中南大学 一种疏水材料表面修饰方法及修饰后材料的应用
WO2021070908A1 (ja) 2019-10-08 2021-04-15 岩谷産業株式会社 細胞凍結用組成物、細胞凍結方法、細胞培養方法、及び細胞凍結用キット

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003044045A2 (en) * 2001-11-19 2003-05-30 Becton, Dickinson And Company Peptides promoting cell adherence, growth and secretion

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2631706A1 (fr) * 1988-05-19 1989-11-24 Ire Celltarg Sa Test de diagnostic de maladie virale et procede de congelation de cellules utiles pour ledit test
US20050129776A1 (en) * 2002-05-03 2005-06-16 Inserm Microparticles supporting cells and active substances
US20050054101A1 (en) * 2003-07-17 2005-03-10 Global Cell Solutions Llc Automated cell culture system and process
US7604929B2 (en) * 2005-04-21 2009-10-20 In Vitro Technologies, Inc. Cellular compositions and methods for their preparation

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003044045A2 (en) * 2001-11-19 2003-05-30 Becton, Dickinson And Company Peptides promoting cell adherence, growth and secretion

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A.SAWAGUCHI等.Direct attachment of cell suspensions to high-pressure freezing.《Journal of Microscopy》.2003,第212卷(第1期),13-20.
Direct attachment of cell suspensions to high-pressure freezing;A.SAWAGUCHI等;《Journal of Microscopy》;20031031;第212卷(第1期);第13-20页 *
刘轶等.动物细胞培养及微载体技术研究进展.《吉林农业大学学报》.2007,第29卷(第2期),203-206.
动物细胞培养及微载体技术研究进展;刘轶等;《吉林农业大学学报》;20070430;第29卷(第2期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2747675A1 (en) 2010-07-15
GB201109718D0 (en) 2011-07-27
JP2012512637A (ja) 2012-06-07
SG172255A1 (en) 2011-07-28
EP2369918A2 (en) 2011-10-05
HK1161530A1 (zh) 2012-07-27
GB0823056D0 (en) 2009-01-28
JP5943607B2 (ja) 2016-07-05
WO2010079058A3 (en) 2011-04-28
GB2477698A (en) 2011-08-10
KR20110100625A (ko) 2011-09-14
AU2009336729A1 (en) 2011-06-30
GB2477698B (en) 2013-12-25
US20110250632A1 (en) 2011-10-13
CN102256481A (zh) 2011-11-23
WO2010079058A2 (en) 2010-07-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102256481B (zh) 用于进行细胞测定的方法
US10918671B2 (en) Method of constructing masses of myocardial cells and use of the myocardial cell mass
Xu et al. Efficient generation and cryopreservation of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells
US9617515B2 (en) Non-embryonic totipotent blastomere-like stem cells and methods therefor
CN104080906A (zh) 用于产生诱导多能干细胞或分化细胞的自动化系统
Quinn et al. Production of iPS-derived human retinal organoids for use in transgene expression assays
CN105849254A (zh) 用于纯化视网膜色素上皮细胞的方法
JP2012512632A (ja) 細胞輸送システム
Guzzo et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to chondrocytes
TWI732298B (zh) 包含阿卡波糖或水蘇糖之哺乳動物細胞保存用液
Barruet et al. Using human induced pluripotent stem cells to model skeletal diseases
Bissoyi et al. Adherent cell thawing by infrared radiation
KR101954120B1 (ko) 동결보존효과가 개선된 줄기세포 동결보존용 조성물 및 이를 이용한 방법
WO2002076206A2 (en) Methods and compositions for cryopreservation of dissociated primary animal cells
Chapin et al. Assuring safety without animal testing: the case for the human testis in vitro
Park et al. Integrin heterodimers expressed on the surface of porcine spermatogonial stem cells
Giacomazzi et al. Isolation of mammalian mesoangioblasts: A Subset of pericytes with myogenic potential
Künzel et al. Generation of self-assembling cardiac organoids using hiPSC-derived cardiomyocytes
Gissel et al. Generation and characterization of cardiomyocytes under serum-free conditions
Dhara et al. Nonviral gene delivery in neural progenitors derived from human pluripotent stem cells
US20150218513A1 (en) Hepatocyte preparations
Liu et al. Response of cytoskeleton of murine osteoblast cultures to two-step freezing
Zuppinger Edge-detection for contractility measurements with cardiac spheroids
Kvigstad et al. Cultivation of Schwann cells from fresh and non-fresh adult equine peripheral nerves
Finlay et al. A detailed methodology for the long-term in vitro culture and analysis of three-dimensional, self-structuring bone models generated from cell lines or primary osteoblastic cell populations

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1161530

Country of ref document: HK

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1161530

Country of ref document: HK

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20140618

Termination date: 20171216

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee