KR20110100625A

KR20110100625A - 세포 검정 수행 방법

Info

Publication number: KR20110100625A
Application number: KR1020117014001A
Authority: KR
Inventors: 피터-제임스 타트넬; 스테펜 게임; 안 미셸 도일
Original assignee: 지이 헬스케어 유케이 리미티드
Priority date: 2008-12-18
Filing date: 2009-12-16
Publication date: 2011-09-14
Also published as: CA2747675A1; GB201109718D0; JP2012512637A; SG172255A1; EP2369918A2; HK1161530A1; GB0823056D0; JP5943607B2; CN102256481B; WO2010079058A3; GB2477698A; AU2009336729A1; GB2477698B; US20110250632A1; CN102256481A; WO2010079058A2

Abstract

본 발명은 냉동보존된 세포 배양물, 세포를 냉동보존하는 방법, 및 상기 세포에 대한 세포 검정을 수행하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 냉동보존된 세포 배양물은 폴리-리신으로 코팅된 적어도 하나의 표면을 갖는 용기, 및 표면 상에 지지된 냉동된 세포를 포함한다.

Description

세포 검정 수행 방법{METHODS FOR CONDUCTING CELLULAR ASSAYS}

본 발명은 세포 검정 또는 세포 기반 검정, 및 특히, 상기 검정에서 사용하기 위한 극저온으로-보존된 세포를 제공하는 방법에 관한 것이다.

당업계에서 현재 실시되고 있는 바와 같이, 약물을 발견한다는 것은 장시간이 소요되는 다단계 과정이다. 먼저 이러한 과정은 특이적인 질환 표적의 확인, 특이적인 표적에 기초한 검정의 개발, 상기 검정의 실증, 최적화, 및 이어서 상기 검정의 자동화를 통해 스크린 작성이라는 과정을 포함한다. 이어서, 상기 검정을 사용하여 화합물 라이브러리에 대한 고처리량 스크리닝 (HTS)을 수행함으로써 효능이 있는 약물로서 장래성이 있는 후보 화합물을 확인할 수 있고; 이어서, 이러한 화합물을 실증하고, 화학적으로 최적화시킨다. 이 과정의 산출물은 전-임상 시험에 들어가게 되고, 만약 실증된 것이라면, 결국은 임상 시험에 들어가게 되는 선도 화합물이다. 이 과정에서, 스크리닝하는 단계는 검정 개발 단계와는 완전히 다르며, 이는 살아있는 생물계에서 화합물의 효능을 시험하는 것을 포함한다.

역사적으로 볼 때, 약물을 발견한다는 것은 수년간에 걸쳐 이루어질 수 있고, 생산되는 약물 1개당 수억 달러가 소비되는, 장시간 소요되고 비용이 많이 드는 과정이다. 게놈 및 HTS 분야에서의 개발을 통해 표적 확인 및 화합물 스크리닝 영역에서의 능력 및 효율이 증가하였다.

HTS 기술의 적용은 현재 약물 발견 과정의 당면 애로사항을 처리하고 완화시켜 줄 수 있는 가능성을 제공한다. HTS 과정에서는 약물 후보물질을 생물계에서의 가능한 효과, 및 특정의 표적에 대한 선별된 선두 화합물의 특이성에 대해 스크리닝한다. 1차 스크리닝은 HTS 분석 과정의 개발 및 마이크로타이터 웰 플레이트 포맷을 사용하여 이루어지는 분석의 소형화를 통해 처리되었는데, 여기서, 96개, 384개, 1,536개 또는 그 초과의 소형화된 웰이 사용되었으며, 이를 통해 처리량 수준은 1일당 100,000개의 시험을 능가하게 된다.

기판으로부터 반응 생성물을 분리할 필요가 없는 검출 시스템을 적용시킴으로써 원래는 정제된 단백질, 대개는 효소의 생화학적 활성을 측정하기 위해 개발되었던 많은 유형의 무세포 검정을 쉽게 HTS로 전환시킬 수 있다. 예를 들어, 형광-기반 기법을 통해 분리, 분별화, 또는 정제 절차를 거칠 필요없이 효소 활성 뿐만 아니라, 분자 상호작용을 검출할 수 있다 (문헌 [Hertzbamerg R P and Pope AJ . High-throughput screening : new technology for the 21 st century . Curr . Opin . Chem. Biol . 4, pp445 -451, 2000]). 이러한 자동화 검정을 통해 큰 화합물 라이브러리를 신속하게 스크리닝함으로써 소위 '히트'라 불리는, 즉, 단리된 시험관내 시스템에서 특이 표적의 생화학적 활성에 대하여 바람직한 효과를 보이는 화합물을 확인할 수 있다. 이어서, 히트를 화학적으로 변형시키고, 추가로 HTS 시스템을 통해 스크리닝함으로써, 이른바, '선두' 화합물이라는 특이성이 보다 크고 강력한 유도체를 선별해 낼 수 있다. 고전적인 약물 발견 과정에서는 이어서 임상 시험을 위한 약물 후보물질이 될 수 있는 화합물을 선별해 내기 위해 세포 및 동물을 모델을 사용하여 선두 화합물을 각종 생체내 검정으로 시험한다.

지난 수년간 약물 발견 과정의 조기 단계에서 공학처리된 세포 및 미생물을 사용한 세포-기반 검정이 HTS에 대한 시험관내 생화학적 검정에 대한 대안으로서 점점 더 많은 관심을 받았다. 상기 검정에 대한 요건은 정의된 표적에 의해 유발된 세포 과정을 조사할 수 있는 능력, 및 HTS 시스템에서 그의 산출 결과를 쉽게 측정할 수 있는 수단이다. 세포 및 미생물을 유전적으로 변형시키는 생명공학적 도구를 점점 더 많이 이용할 수 있게 됨으로써 HTS에서 자동화 시스템에 쉽게 응용될 수 있는 세포 과정에 대한 간단한 판독 검정을 개발할 수 있었다.

세포-기반 검정은 종래의 시험관내 생화학적 검정에 비하여 놀랄만한 이점을 가지고 있다. 먼저, 이러한 세포 검정에서는 표적 단백질을 정제할 필요가 없고, 이에 생화학상 활성인 표적을 수득하는데 필요한 지식 습득에 대해 투자할 필요가 없는데-그에 대한 천연 기질이 대체로 공지되지 않은 상태로 남아있는 수백 가지의 새로운 단백질에 대하여 특이적인 생화학적 검정을 설정한다는 것이 사실상 어렵기 때문에 잠재능이 있는 약물 치료법에 대해 표적화될 수 있는 단백질이 점점 증가하고 있는 바, 상기와 같은 이점은 특히 중요시되었다. 두번째로는, 시험관내 검정에서보다 더 유사하게 천연 생리학적 상태를 나타낼 수 있는 가능성이 가장 높은 세포 환경하에서 표적 단백질의 입체형태 및 활성 뿐만 아니라, 화합물의 효능을 모니터링할 수 있는 판독값을 조사할 수 있다는 점이다. 세번째로는, 세포-기반 검정이 일반적으로는 세포독성이거나, 세포내 표적에 이르는 세포막을 투과하지 못하는 화합물을 즉시 선별해 낼 수 있다는 점이다. 세포-기반 검정을 통해 확인된 히트 및 선두 화합물은 중요한 실증 단계를 통과하였다. 이러한 정보의 이용가능성을 통해 시험관내 검정에서의 다수에 비하여 유리한 위치에서 출발할 수 있고, 약물 개발에 필요한 귀중한 시간 및 비용을 절약할 수 있었다.

그러나, 최근 약물 발견, 특히 HTS를 위한 세포 사용에 있어서의 성장은 세포 제공자와 사용자에게 많은 도전 과제; 즉, 배취 성능 변동, 세포 생산 일정 계획, 및 능력과 역량이라는 도전 과제를 제기한다.

세포주는 일반적으로 주당 2회에 걸쳐 계대배양되어 각 분석을 위한 것으로 규모가 확장된다. 이러한 계대배양과 규모 확장은 일반적으로 수개월이라는 기간에 걸쳐 주기적으로 반복된다. 대형의 단일 배취에서 성장되고, 냉동기에서 저장된 냉동보존된 세포를 사용하면 하기와 같은 현저한 이점이 있다: (a) 일단 냉동되면, 동일한 세포 배취를 장기간 동안에 사용할 수 있는 바, 세포-기반 검정 결과에 대한 일관성은 개선될 수 있고, (b) 화합물이 시험을 위해 도착하기만 하면 어느 순간이든 새로운 검정을 개시할 수 있는 바, 유연성은 증가될 수 있고, (c) 약물 스크리닝 활동을 수행함과 동시에 배양물 중에서 세포주를 유지시키는데 소비되는 시간을 절약할 수 있는 바, 그 비용을 절감할 수 있다. 결과적으로, 세포 배양 시약, 일회용품 및 세포 배양 설비의 사용도 감소하게 된다.

냉동보존이라는 그 자체가 일반적으로 화합물의 약리학적 성질에는 어떤 영향도 미치지 않고, 다수의 세포 유형과 검정에 적용될 수 있다 (문헌 [Guido J.R. Zaman, et al. Cryopreserved cells facilitate cell-based drug discovery. Drug Discovery Today . Volume 12, Numbers 13/14, July 2007]). 예를 들어, 프레그난 X 수용체 (PXR) 트랜스활성화 검정에서 사용하기 위해 냉동보존된, 일시적으로 형질감염된 HepG2 세포를 새로 형질감염된 HepG2 세포와 비교하였다. 검정 수행능은 2가지 세포 시료 모두에서 유사하였지만; 냉동보존된 세포의 경우, 검정간의 변동이 더 작은 것으로 입증되었다. PXR 활성화 효능 및 유효성이 다른 약물을 사용한 실증을 통해 냉동보존된 세포와 신선한 세포 사이에 탁월한 상관관계 (r ² > 0.95)가 있는 것으로 입증되었다. 냉동보존으로 인해 세포 투과성이 부족한 공지의 CYP3A4 유도제의 효과는 변경되지 않았으며, 이는 냉동보존이 막 투과성에는 거의 영향을 미치지 않는다는 것을 시사한다. 추가로, 일시적으로 형질감염된 대조군 세포와 비교하여 냉동보존된 HepG2 세포는 세포 독성 화합물에 대하여 증진된 감수성을 나타내지 않았다. 냉동보존된 세포를 사용하면 증진된 효율로 이러한 검정을 수행할 수 있다 (문헌 [Zhu, Z. et al. Use of cryopreserved transiently transfected cells in high-throughput pregnane X receptor transactivation assay . Journal of Biomolecular Screening . 12, 248-254, 2007]). 상기 문헌에 기재되어 있는 일례로는 약물 스크리닝에 광범위하게 사용되는 세포 유형, 예컨대, CHO 및 HEK293, 및 판독기, 예컨대, 베타-락타마제 및 FLIPR이 있다.

아스트라제네카(AstraZeneca) (스웨덴 몬달 소재)의 루이스 스트젠보그(Louise Stjernborg)과 그의 동료들은 루비듐 유출 검정에서 인간 ERG (hERG) 채널에 미치는 화합물의 부작용을 스크리닝하기 위해 냉동된 세포를 사용하는 것에 관해 기술한 바 있다. 그들 단체에서는, 충분한 새로운 화합물이 조립되었을 때 hERG 채널 스크리닝을 매일 수행하지 않고, 1개월 단위로 수행하였다. 냉동된 세포를 사용함으로써 세포 배양물을 유지시키는데 소요되는 시간을 상당 절약할 수 있었다 (문헌 [Ding, M. et al. Application of cryopreserved cells to hERG screening using a non-radioactive Rb+ efflux assay. Assay Drug Dev. Technol. 4, 83-88, 2006.])

따라서, 약물 발견에 있어 냉동보존된 세포를 사용하는 것에는 3가지 이점이 있다. 먼저, 어느 순간이든 새로운 검정을 개시할 수 있기 때문에 유연성이 증가되어 있다. 두번째로는, 특정 검정에서 특정 화합물에 대하여 수행된 모든 시험 결과는 동일한 배취의 세포를 사용함으로써 생성될 수 있기 때문에 데이터의 질이 개선되어 있다. 세번째로는, 냉동된 세포를 사용하여 수행되는 실험에서는 세포 배양 작업, 특히 세포주 유지에 소요되는 시간이 상당수 단축되어, 결과적으로는 세포 배양 설비, 재료 및 일회용품의 사용을 감소시킨다.

폴리-리신이 세포를 위한 비특이 부착 인자로서 사용되며, 특정 세포 유형을 고체 기판, 예컨대, 합성 배양물 표면; 유리 슬라이드 전자 현미경 그리드 등에 부착시키는 것을 촉진시키는데 통상적으로 사용된다 (문헌 [Jacobson, B. et al. Plasma membrane : rapid isolation and exposure of the cytoplasmic surface by use of positively charged beads . Science 195: 302-304,1977]). 이는 보통 고체 표면에 부착되지 않는 세포에 대해 일반적으로 사용된다 (문헌 [Mazia , et al . Adhesion of cells to surfaces coated with polylysine . Applications to electron microscopy . The Journal of Cell Biology , Vol 66, 198-200, 1975]). 이는 간단하게 고체 표면 (플라스틱, 유리 등)을 양이온성 폴리-리신 용액으로 코팅함으로써 달성된다. 폴리-리신 부분은 플라스틱 및 유리 표면에 존재하는 음으로 하전된 분자와 정전기 상호작용을 형성한다.

그러나, 폴리-리신은 또한 종래 생세포-기반 분석에서부터 면역조직화학법까지에 이르는 기법에서 많은 다른 비-포유동물 세포 및 조직의 부착을 증가시키는데에도 사용된다. 포유동물/비-포유동물 세포의 부착을 촉진시키는데 있어서의 그의 용도에 관한 많은 일례는 과학 문헌에 제시되어 있다. 폴리-리신은 포유동물과, 곤충과, 양서류과, 어류과, 파충류과 및 조류과를 비롯한 주된 생물학적 종들 모두로부터 유래된 세포를 부착시키는데 사용된다. 추가로, 그 일례는 세균, 선충류 및 복족류 만큼 다양한 종으로부터 유래된 세포를 포함하는 것으로서 제시된다.

통상 폴리-리신 상에서 배양되는 세포주의 일부 예로는 HEK293 인간 배아 신장 세포 (문헌 [Sugawara , T. et al . A missense mutation of the Na + channel alpha II subunit gene Na (v)1.2 in a patient with febrile and afebrile seizures causes channel dysfunction . Proc Natl Acad Sci USA . 98(11), 6384-9, 2001]), MDA-231, 유방암 세포주 (문헌 [Yoneda , T. et al . Inhibition of osteolytic bone metastasis of breast cancer by combined treatment with the bisphosphonate ibandronate and tissue inhibitor of the matrix metalloproteinase-2. J. Clin . Invest . 99(10), 2509-17, 1997]), 뇌하수체 전엽 세포 (문헌 [Hinuma , S, et al . A prolactin - releasing peptide in the brain . Nature, 393(6682), 272-6, 1998]), 미세아교세포 MG-7 세포 (문헌 [Szczepanik , AM. et al . Amyloid - beta peptide fragments p3 and p4 induce pro - inflammatory cytokine and chemokine production in vitro and in vivo . J. Neurochemistry , 77(1), 304-17, 2001]), 및 래트 1차 성상세포 (문헌 [Little , EB . et al . A short segment within the cytoplasmic domain of the neural cell adhesion molecule (N- CAM ) is essential for N- CAM - induced NF - kappa B activity in astrocytes. PNAS USA , 98(5), 2238-43, 2001])를 포함한다.

GB2427411A는 알기네이트/다당류 마이크로캡슐/히드로겔을 사용하여 조직으로부터 유래된 세포를 냉동보존하는 방법에 관한 것이다. 세포를 다당류에 부착시키는 것을 촉진시키는데 폴리-리신이 사용된다. 상기 문헌에서는 검정의 성능을 개선시키는데 있어 폴리-리신이 사용된 것에 관해서는 언급된 바 없었다.

미국 특허 번호 6657003에는 장기간의 안정성 & 세포 부착 특성을 입증하는 기판 코팅용 액체 용액이 개시되어 있다. 더욱 특히, 세포학적 표면 슬라이드에 도포시키기 위한 것으로서, 교차결합된 아미노산 중합체를 포함하는 용액에 관한 것이다. 본 발명에서 사용되는 바와 같이, 아미노산 중합체는 중성 또는 염기성 아미노산, 예컨대, 폴리 1-리신 또는 폴리 1-아르기닌으로부터 선택된다.

WO 2005/034625는 세포 부착 내성 (CAR) 물질이 결합되어 있는 지지체, 및 CAR에 결합되어 있는 콜라겐 VI 또는 그의 생물학상 활성인 단편 또는 변이체, 및 임의로 하나 이상의 다른 ECM 단백질, 또는 그의 생물학상 활성인 단편 또는 변이체 및/또는 하나 이상의 폴리양이온성 중합체를 포함하는 표면 (예컨대, 세포 배양물 표면)에 관한 것이다.

미국 특허 번호 5512474에는 세포 생물학 분야에서의 생체반응기의 세포 배양물 표면, 및 특히 세포 부착 및 세포 성장이 잘 일어날 수 있도록 상기 표면을 개선시키는 방법이 기술되어 있다. 마이크로캐리어 형태의 지지재를 포함하고, 양으로 하전된 분자 및 아크릴아미드 또는 메타크릴아미드로부터 중합화된 아크릴성 물질을 포함하는 조합물을 보유하는 표면인 세포의 부착을 위한 지지 표면을 포함하는 세포 배양 지지체가 개시되어 있다.

미국 특허 번호 5932473에는 염 용액 중 세포 부착 촉진제를 함유하는 조성물로 코팅된 세포 배양 기판이 기술되어 있다. 기판, 예컨대, 플라스틱, 유리 또는 미소공성 섬유를 0.005 M 내지 약 0.5 M 시트르산염 또는 황산염 용액 중 약 5 ㎍/ml 내지 약 1,000 ㎍/ml의 폴리-D-리신을 함유하는 조성물로 코팅함으로써 기판 1 ㎠당 조성물 약 50 ㎕ 내지 약 500 ㎕를 제공한다.

문헌 [Ma, M. et al., 2006 (Neuroscience Lett., 403, 84-89)]에는 부착성을 띠는 포유동물의 뉴런 네트워크를 냉동보존하는 것이 기술되어 있다. 2개의 부착 인자, 폴리-D-리신 및 라미닌으로 코팅된 35 mm 페트리 접시에 해리된 척수 세포를 부착시켰다. 이어서, 네트워크를 콜라겐 중에 포매시키고, 그에 항냉동제 트레할로스를 적재한 후, DMSO, FBS 및 배양 배지를 함유하는 냉동 배지로 옮겨 놓았다. 네트워크를 -196℃ 액체 질소 중에서 2개월까지 저장하였다. 냉동보존 이후 네트워크의 특징을 규명하는 것은 형광 프로브 (생존가능성/세포독성 키트, 몰레큘라 프로브스(Molecular Probes))를 사용한 세포 생존가능성의 측정, 면역세포화학법에 의한 뉴런 마커 발현의 측정, 및 형광 프로브 FM1-43 (몰레큘라 프로브스)을 사용한 시냅스 소포 재생의 해명을 포함하였다.

문헌 [Son, J.H. et al., 2004 (Biotechnology Letters, 26, 829-833)]에는 래트 간세포의 냉동보존을 촉진시키기 위하여 1형 콜라겐이 코팅된 6-웰 플레이트, 및 DMSO, 우태아 혈청 및 배양 배지를 함유하는 냉동 혼합물을 사용하는 것이 기술되어 있다. 세포를 오직 단기간 (24 hr) 동안 -70℃에서 냉동보존하였다. 냉동보존 후 간세포의 특징을 규명하는 것은 단순 분광광도 MTT 검정을 사용한 세포 생존가능성의 측정 및 ELISA-기반 시스템을 사용한 알부민 분비의 측정을 포함하였다.

문헌 [Shoji R. et al., 2000 (Cytotechnology, 32, 147-155)]에는 1형 콜라겐, 프로넥틴 F 또는 피브로넥틴으로 코팅된 96-웰 플레이트를 사용한 인간 간암 세포의 냉동보존이 기술되어 있다. 이러한 제제는 세포 부착을 촉진시키기 위하여 사용되었다. -85℃에서 10% DMSO로 보충된 간세포 배양 배지를 사용함으로써 냉동보존을 달성하였다. 이러한 조건은 약 7일 동안 세포를 최상의 상태로 유지시켜 주었다. 냉동보존 후 간세포의 특징을 규명하는 것은 오직 7일 동안만 저장된 세포로 제한되었고, 산성 포스파타제 활성 측정에 의한 세포 생존가능성의 측정 및 시험관내 세포독성 시험 (독성 시약 투여에 대한 반응으로 일어나는 생/사(live/dead) 용량 반응 곡선)을 포함하였다.

기술상의 문제점

제약 산업내에서는 저온 저장 및 그 이후의 스크리닝 목적을 위해서도 사용될 수 있는 용기 중에서 세포를 냉동보존하는 것에 대해 요구되고 있다; 이에, 용기는 영하의 온도에서 저장되고, 간단하게 냉동기로부터 제거함으로써 세포를 해동시킬 수 있고, HTS에 직접 사용될 것이다. 현재는 일반적으로 세포를 바이알 (예컨대, 냉동바이알) 중에서 냉동보존하고, 상기 바이알을 시험에서 요구할 때까지 저온에서 저장한다; 이후, 재구성하고/서서히 해동시키고, 완충액으로 세척하고, HTS에서의 시험/분석을 위한 준비가 된 배양 접시 또는 마이크로웰 플레이트로 옮겨 놓는다. 이 시점에서, 세포는 해동시의 높은 사망율과 분석 반응에서의 가변성으로 인해 배양 접시 또는 마이크로웰 플레이트에서 냉동보존될 수 없다. 후자의 경우, 예컨대, 검정에서 얻은 낮은 Z 값에서 명백히 나타난다. 세포를 냉동보존할 수 있고, 같은 용기 또는 베쓸 중 재구성된 세포에 관한 검정을 수행할 수 있는 능력이 제약 산업에 이용가능한 기술을 제공하게 될 것이다.

그러므로, 바이알/냉동바이알로부터 배양 접시/마이크로웰 플레이트로 옮기는 과정에서 하나 이상의 단계를 생략하여 본 방법을 간소화시켜 비용을 절감하고 시간을 단축시킴으로써 작업의 흐름을 개선시키는 것에 관해 요구되고 있다. 추가로, 배양 접시 또는 마이크로웰 플레이트에서 냉동보존된 세포의 세포 생존가능성 및/또는 분석 수행능을 개선시키는 것에 관해 요구되고 있다.

본 발명은 상기와 같은 문제를 처리하고, 냉동보존된 세포 배양물 및 상기를 생산하는 방법을 제공함으로써 단일 용기 중에서 재구성된 세포를 냉동보존하고 분석할 수 있도록 허용한다.

본 발명의 요약

본 발명의 제1 측면에 따라, 적어도 하나의 표면을 갖는 용기, 상기 표면 상에 지지된 냉동된 세포를 포함하며, 여기서 표면은 폴리-리신으로 코팅된 것인, 냉동보존된 세포 배양물을 제공한다.

폴리-리신은 특정 세포 유형을 표면에 부착시키는 것을 촉진시키는 것으로 알려져 있으며, 또한 놀랍게도 세포 부착과는 독립된 방법에 의해 분석 수행능 (심지어는 장기간 냉동보존된 후에도)을 개선시키는 것으로 밝혀졌다.

폴리-리신은 통상 포유동물 세포를 세포 배양물로 처리된 표면에 부착시키는 것을 증가시키는 분자로서 사용된다. 이는 간단하게 고체 표면 (플라스틱, 유리 등)을 양이온성 폴리-리신 용액으로 코팅함으로써 달성된다. 폴리-리신 부분은 플라스틱 및/또는 유리 표면에 존재하는 음으로 하전된 분자와 정전기 상호작용을 형성할 수 있다.

폴리-리신은 다수의 공급업체들로부터 이용가능하다 (예컨대, 시그마(Sigma), P7405, >300 k 또는 P6407, 70-150 k). 폴리-리신은 세포막의 음으로 하전된 이온과 배양물 표면 사이의 정전기 상호작용을 증진시킨다. 폴리-리신이 배양물 표면 상에 흡착되면, 폴리-리신은 세포 결합에 이용가능한 양으로 하전된 부위의 수를 증가시킨다. 고체 표면을 코팅시키는데 폴리-D-리신 및 폴리-L-리신 둘 다의 중합체 및 그의 혼합물이 사용될 수 있다. 그러나, 특정 세포는 폴리-L-리신을 단백질분해 방법에 의해 분해시킬 수 있으며, 이러한 상황하에서는 과도한 분해와 궁극적인 L-리신의 흡수를 막기 위해서 일반적으로 폴리-D-리신이 사용된다.

저분자량 폴리-리신 (M_r = 30,000 - 70,000 kD)은 용액 중에서 점성이 더 낮기 때문에 사용이 더 용이하기는 하지만, > 300,000 kD인 고분자량의 것은 분자당 더 우수한 세포 부착을 제공한다. 세포 분자학에서 일반적으로 사용하기 위한 폴리-리신의 분자량은 전형적으로 70,000 - 150,000 kD 범위이다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 세포 배양 용기는 베쓸, 바이알, 마이크로타이터 플레이트 및 세포 배양 플레이트로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 추가의 또 다른 측면에서, 세포 배양물 표면 상에서 냉동되는 세포는 포유동물 세포, 곤충 세포, 양서류 세포, 어류 세포, 파충류 세포 및 조류 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 세포는 포유동물 세포이다. 더욱 바람직하게는, 세포는 CHO 세포 (공급원: ECACC -85050302), HEK293 세포 (공급원: ATCC-CRL1573) 및 AD293 세포 (공급원: 인비트로겐(Invitrogen) R705-07)로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 제2 측면에 따라,

a) 세포를 함유하는 배지를 용기 표면에 첨가하여 세포가 표면에 부착될 수 있게 하여 세포 배양물을 형성하는 단계;

b) 냉동보존 배지를 첨가하는 단계; 및

c) 세포 배양물의 온도를 -20℃ 또는 그 아래로 감소시키는 단계

를 포함하며, 여기서 상기 단계 a) 이전에 상기 표면을 폴리-리신으로 코팅하는 것인, 세포 배양물 중의 세포를 냉동보존하는 방법을 제공한다.

폴리-리신은 세포를 플라스틱 및 유리 표면에 부착시키는 것을 증진시키는 코팅제로서 사용되는 분자이다. 뉴런, 신경아교세포 및 형질감염된 세포를 비롯한, 매우 광범위한 세포 유형을 배양하는데 사용되어 왔다. 다양한 뉴런 및 형질감염된 세포주의 부착, 성장, 및 분화를 촉진시키기 위한 배양 기판으로서 폴리-D-리신이 보편적으로 사용된다. 폴리-D-리신, 폴리-L-리신 둘 다 및 그의 혼합물이 고체 표면을 코팅시키는데 사용될 수 있고, 전통적으로는 세포용의 비특이 부착 인자로서 작용할 수 있다. 폴리-리신의 공지 기능 중 하나는 세포막과 회합된 음으로 하전된 이온과 세포 배양물 표면 사이의 정전기 상호작용을 증진시키는 것이다. 폴리-리신이 배양물 표면 상에 흡착되면, 폴리-리신은 세포 결합에 이용가능한 양으로 하전된 부위의 수를 증가시킨다.

본 발명의 추가의 또 다른 측면에서, 세포 배양 시스템의 표면 상에서 냉동되는 세포는 포유동물 세포, 곤충 세포, 양서류 세포, 어류 세포, 파충류 세포 및 조류 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 세포는 포유동물 세포이다. 더욱 바람직하게는, 세포는 CHO 세포, HEK293 세포 및 AD293 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 세포를 -80℃ 미만의 온도에서 저장하였다. 더욱 바람직하게는, 세포 배양 플레이트를 16 hr 동안 -80℃로 냉동시킨 후, 이를 옮겨 -140℃에서 더 장기간 동안 저장하였다.

본 발명의 제3 측면에서, a) 세포를 함유하는 배지를 용기 표면에 첨가하여 세포가 표면에 부착될 수 있게 하여 세포 배양물을 형성하는 단계; b) 냉동보존 배지를 첨가하는 단계; c) 세포 배양물의 온도를 감소시켜 세포를 냉동시키는 단계; d) 세포 배양물을 -20℃ 미만의 온도에서 저장하는 단계; e) 세포 배양물의 온도를 상승시켜 세포를 해동시키는 단계; 및 f) 세포에 대한 세포 검정을 수행하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 단계 a) 이전에 상기 용기 표면을 폴리-리신으로 코팅하는 것인, 세포 검정을 수행하는 방법을 제공한다.

한 측면에서, 본 발명은 세포를 함유하는 배지를 용기 표면에 첨가하여 16 hr의 기간 동안 세포가 표면에 부착될 수 있게 하여 세포 배양물을 형성하는 단계, 성장 배지를 냉동보존 배지 (90% 우태아 혈청 및 10%의 디메틸 술폭시드 (DMSO))로 대체하는 단계, 세포 배양물의 온도를 감소시켜 세포를 냉동시키는 단계, 세포 배양물을 -20℃ 미만의 온도에서 저장하는 단계, 이어서, 세포 배양물의 온도를 상승시켜 세포를 해동시키는 단계, 및 세포에 대한 세포 검정을 수행하는 단계를 포함한다.

또 다른 측면에서, 세포 배양물을 -80℃ 온도에서 저장한다.

추가 측면에서, 폴리-리신은 폴리-D-리신, 폴리-L-리신 및 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또 다른 측면에서, 용기는 베쓸, 바이알, 마이크로타이터 플레이트 및 세포 배양 플레이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 용기는 세포 배양 플레이트이다.

한 측면에서, 세포는 부착 세포이다. 특히, 세포는 포유동물 세포, 곤충 세포, 양서류 세포, 어류 세포, 파충류 세포 및 조류 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 세포는 포유동물 세포이다. 더욱 바람직하게는, 세포는 CHO 세포, HEK293 세포 및 AD293 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또 다른 측면에서, 단계 a)에서 사용되는 세포는 하나 이상의 마이크로캐리어에 부착된다. 바람직하게는, 마이크로캐리어는 폴리-리신으로 코팅된다.

본 발명의 추가의 또 다른 측면에서, 단세포 배양 용기는 베쓸, 바이알, 마이크로타이터 플레이트 및 세포 배양 플레이트로 이루어진 군으로부터 선택된다.

정의:

하기 용어는 본 발명과 관련하여 이해되어야 한다:

세포 검정 - 화합물의 작용에 의해 유발된 세포 과정을 조사하는 방법 또는 시험, 및 세포 산출물을 측정하는 수단. 예컨대, 검정은 특별히 약물 스크리닝에 사용된다. 세포 사멸 또는 생존가능성이 본 정의에는 포함되지 않는다는 것을 당업자는 이해할 것이다.

냉동보존된 - 냉동보존 (온전한 세포 및 생존가능한 세포를 비롯한 생물학적 조직을 극저온 온도, 전형적으로 -20℃ 및 그 아래의 온도에서 보존하는 것)을 사용함으로써 보존된 것.

냉동된 세포 - -20℃ 또는 그 아래의 온도에서 유지된 온전한 및 생존가능한 생물학적 세포.

냉동보존 배지 - 종종 "세포 냉동 배지"로도 지칭되는 것으로서, 냉동보존 또는 냉동시에 일어나는 세포 장애 또는 손상을 감소시키는 시약 또는 조성물을 함유하는 임의의 배지이다. 그러한 냉동보존 배지의 예로는 디메틸 술폭시드 (DMSO), 우태아 혈청, 글리세롤, 둘베코스 변형된 이글스 배지 (DMEM), 트레할로스 및 그의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

신호: 배경 (S:B)

이는 본질적으로는 (+) 효능제 (자극) 검정의 평균값을 (-) 효능제 (자극) 검정의 평균값으로 나눈 것이다.

신호: 잡음 (S:N)

하기 식은 신호 및 배경 검정, 둘 모두에서 관찰되는 표준 편차를 고려한 것이다. 이는 분석 수행능을 나타낸다.

Z 값

이는 일반적으로 제약 산업에서 분석 수행능을 평가하는데 사용된다. 통계학상, Z 값은 고처리량 스크리닝 검정의 우수성 또는 검정력을 나타내는 수치이다. 본 식은 (+) 및 (-) 효능제 검정의 평균 및 표준 편차를 포함한다. 그 값이 1에 가까울수록 수행능은 우수한 것이다. 세포 기반 검정의 경우, 일반적으로 > 0.40이면 우수한 것으로 간주되는 반면, 0.5 및 그 초과의 값은 탁월한 것으로 간주된다 (문헌 [Zhang et al (1999) A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. (J Biomol Screen., 4 (2) 67-73]).

본 발명의 추가의 특징 및 이점은, 단지 일례로서 제공되며 첨부되는 도면을 참고로 하는 본 발명의 바람직한 실시양태에 관한 하기의 상세한 설명을 통해 자명해질 것이다.

단지 일례로서만 제공되는 하기의 설명은 본 발명을 기술된 어느 구체적인 실시양태로 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 설명은 본원에 참고로 포함되어 있는 첨부 도면과 더불어 이해될 수 있을 것이다.
도 1a는 냉동보존 이전 및 냉동보존 이후의, 폴리-리신으로 코팅된 플레이트 및 폴리-리신으로 코팅되지 않는 플레이트 상에서 성장시킨 수포성 구내염 바이러스 에피토프 태그-β2 아드레날린 수용체-증강된 녹색 형광 단백질 세포로 이루어진 재조합 단백질에서 안정하게 발현된 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO VSV-β2AR-EGFP 안정 세포)의 영상을 비교한 것을 나타낸 것이다.
도 1b는 냉동보존 이전 및 냉동보존 이후의, 폴리-리신으로 코팅된 플레이트 및 폴리-리신으로 코팅되지 않는 플레이트 상에서 성장시킨 인간 배아 신장 293-수포성 구내염 바이러스 태그-β2 아드레날린 수용체-증강된 녹색 형광 단백질 세포 (HEK293 VSV-β2AR-EGFP 안정 세포)의 영상을 비교한 것을 나타낸 것이다.
도 2는 세포 타이터-글로 발광 세포 생존가능성 검정(Cell Titer-Glo luminescent cell Viability Assay) (프로메가(Promega))을 사용하여 해동 후에 측정된, 폴리-리신으로 코팅된 플레이트 및 폴리-리신으로 코팅되지 않는 플레이트 상에 시딩된 세포주 (CHO VSV-β2AR-EGFP 안정 세포주 및 HEK293 VSV-β2AR-EGFP 안정)의 생존가능성을 비교한 것을 나타낸 것이다.
도 3은 폴리-리신으로 코팅된 플레이트 및 폴리-리신으로 코팅되지 않는 플레이트 상에 시딩된 냉동보존된 AD293 세포의 분석 수행능을 비교한 것을 나타낸 것이다.
도 4는 CHO VSV-β2AR-EGFP 세포에 대한 효능제 (a) 및 길항제 (b) 용량 반응 곡선을 나타낸다.
도 5는 HEK293 VSV-β2AR-EGFP 세포에 대한 효능제 (a) 및 길항제 (b) 용량 반응 곡선을 나타낸다.

제1 측면에서, 본 발명은 냉동된 세포가 그에 지지되어 있는 적어도 하나의 표면을 갖는 용기로 구성되며, 세포 배양물 표면은 폴리-리신으로 코팅된 것인, 냉동보존된 세포 배양물이다. 세포 배양 시스템 중에 사전 분배된 냉동보존된 세포를 공급하면 세포 배양물을 다루는데 소요되는 시간량을 단축시킬 수 있을 것이다. 세포는 일시적으로 또는 안정적으로 형질감염된 것일 수 있다. "즉시 사용가능한" 미리-냉동된 세포를 처리하는 과정은 간단하게 플레이트를 해동시키고, 냉동 배지를 제거한 후, 단순 PBS 세척액을 제거하고 분석용 배지를 첨가하는 것을 포함할 것이다.

놀랍게도 폴리-리신 화합물은 세포 부착과는 독립된 방법에 의해 분석 수행능 (심지어는 장기간 냉동보존된 후에도)을 개선시키는 것으로 밝혀졌다. 하기와 같은 적어도 2개의 별도의 기전 작용에 의해 상기와 같은 개선이 이루어진다:

i) 특히 장기간 냉동보존된 후에도 다중의 다단계식 세척 단계 동안 HEK293 세포 부착을 촉진시키고 유지시키는 기전. 폴리-리신 매개 세포 부착은 HEK293 세포에 대해 잘 확립된 현상으로서; 실제로, 세포 부착을 증가시키는 것이 폴리-리신의 생물학적인 주된 용도 중 하나이다.

ii) 폴리-리신은 CHO 세포주의 형태학적 성질에 영향을 미친다 (문헌 [Sordel et al . Influence of glass and polymer coatings on CHO cell morphology and adhesion . Biomaterials Vol . 28, Issue 8, 1572-1584, 2007]). 전통적인 CHO 세포 배양에서는 CHO 세포가 "세포 배양 플라스틱"에 매우 효율적으로 부착되기 때문에 폴리-리신이 불필요한 것으로 간주되는 바, 통상 사용되지 않는다. 그러나, 세포 냉동보존 이전에 폴리-리신을 사용하면 세포 부착에는 영향을 주지 않으면서 분석 수행능을 증진시키는 것으로 보인다. CHO 세포 ± 폴리-리신을 좀더 면밀히 조사해 본 결과, (Z 값 측정에 의해 결정된 바) 융기된 형태학성 성질을 보이는 세포 개수와 개선된 분석 수행능 사이에는 상관관계가 존재하는 것으로 보인다.

폴리-D-리신 및 폴리-L-리신 둘 다는 고체 표면을 코팅시키는데 사용될 수 있고, 전통적으로는 세포를 위한 비특이 부착 인자로서 사용된다. 폴리-리신의 공지 기능 중 하나는 세포막과 회합된 음으로 하전된 이온과 세포 배양물 표면 사이의 정전기 상호작용을 증진시키는 것이다. 폴리-리신이 세포 배양물 표면 상에 흡착되면, 폴리-리신은 세포 결합에 이용가능한 양으로 하전된 부위의 수를 증가시킨다. 폴리-리신는 상이한 분자량 범위, M _r 30,000 - 70,000의 것이 이용가능하며, 용액 중에서는 점성이 낮고, 이로써 분배가 보다 용이하지만, > 300,000인 폴리-리신은 분자 1개당 더 많은 부착 부위를 제공한다. 절충안으로서 바람직한 폴리-리신 M _r 은 70,000 - 150,000이다.

일부 경우에서, 특정 세포는 폴리-L-리신을 단백질분해 방법에 의해 분해시킬 수 있으며, 이러한 상황하에서는 세포가 L-리신의 과도한 흡수에 의해 파괴될 수 있는 바, 이에 폴리-D-리신이 폴리양이온으로서 사용되어야 한다.

세포 배양 용기는 베쓸, 바이알, 마이크로타이터 플레이트 및 세포 배양 플레이트로 이루어진 군으로부터 선택된다.

세포 배양물 표면 상에서 냉동되는 세포는 포유동물 세포, 곤충 세포, 양서류 세포, 어류 세포, 파충류 세포 및 조류 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 세포는 포유동물 세포이고; 더욱 바람직하게는 CHO 세포, HEK293 세포 및 AD293 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 포유동물 세포이다.

하기 목록은 본 발명의 사용에 적용될 가능성이 있는 것을 나타내는 포유동물 세포로 구성된다. 본 목록은 일례로서 제공된 것이며, 제한하고자 하는 것으로 간주되서는 안된다. 추가로, 이종성 유전자를 안정하게 발현하는 세포, 예컨대, 상기 기술된 바와 같이, β2 아드레날린 수용체를 안정하게 발현하는 세포주 HEK293 및 CHO 또한 본 실시양태의 일부가 된다.

a. 대표적인 세포주

HeLa 니그로이드계 자궁경부선암종 (인간)

HEK 293 배아 신장 (인간)

1321-N1 뇌 성상세포종 (인간)

U-2 OS 뼈의 골육종 세포 (인간)

Huh-7 간암 (인간)

K-562 림프모구 (만성 골수성 백혈병) (인간)

HepG2 간 간세포 암종 (인간)

Hep3B 간세포 암종 (인간)

BJ 포피 섬유아세포 (인간)

CACO2 결장직장 선암종 (인간)

MCF7 인간 유선 선암종 (인간)

스위스 및 NIH 3T3(Swiss and NIH 3T3) 배아 섬유아세포 (마우스)

COS-1 및 -7 SV40 형질전환된 신장 세포주 (아프리카 녹색 원숭이)

CHO (CHO-K1) 차이니즈 햄스터 난소 세포 (햄스터)

b. 대표적인 1차 세포

HUVEC 제대 정맥 내피 세포 (인간)

MHEpC 유방 상피 세포 (인간)

HTEpC 기관 상피 세포 (인간)

HAOEC 대동맥 내피 세포 (인간)

PBMC 말초 혈액 단핵 세포 (인간)

c. 대표적인 줄기/전구 세포

hESC-BG01V 배아 줄기 세포주 (인간)

ES-C57BL/6 배아 줄기 세포주 (마우스)

MLPC 다계통 전구 세포 제대혈 (인간)

d. 대표적인 암종 세포

NTERA 1 및 2 고환 배아 암종 세포 (인간)

폴리-리신 처리된 고체 표면은 신경돌기 성장을 지지하고, 중추 신경계로부터 유래된 많은 세포의 생존을 개선시키는 것으로 나타났다. 폴리-α-리신은 합성 화합물이기 때문에, 이는 일반적으로는 배양된 세포에서의 생물학적 반응을 자극시키지 못한다. 이는 합성적으로 생성되었기 때문에, 다른 천연 중합체와 관련하여 문제가 될 수 있는 임의의 생물학적 불순물을 통상 함유하고 있지 않다.

통상 폴리-리신 상에서 배양되는 세포주의 일부 예로는 HEK293 인간 배아 신장 세포 (문헌 [Sugawara , T. et al . A missense mutation of the Na + channel alpha II subunit gene Na (v)1.2 in a patient with febrile and afebrile seizures causes channel dysfunction . Proc Natl Acad Sci USA . 98(11), 6384-9, 2001]), MDA-231, 유방암 세포주 (문헌 [Yoneda , T. et al . Inhibition of osteolytic bone metastasis of breast cancer by combined treatment with the bisphosphonate ibandronate and tissue inhibitor of the matrix metalloproteinase-2. J. Clin . Invest . 99(10), 2509-17, 1997]), 뇌하수체 전엽 세포 (문헌 [Hinuma , S, et al . A prolactin - releasing peptide in the brain . Nature, 393(6682), 272-6, 1998]), 미세아교세포 MG-7 세포 (문헌 [Szczepanik , AM. et al. Amyloid - beta peptide fragments p3 and p4 induce pro - inflammatory cytokine and chemokine production in vitro and in vivo . J. Neurochemistry , 77(1), 304-17, 2001]), 및 래트 1차 성상세포 (문헌 [Little , EB . et al. A short segment within the cytoplasmic domain of the neural cell adhesion molecule (N- CAM ) is essential for N- CAM - induced NF - kappa B activity in astrocytes. PNAS USA , 98(5), 2238-43, 2001])를 포함한다.

폴리-L-리신은 패턴화된 공동배양물로서 2개의 상이한 세포를 배양하는데에도 사용되었다. 히알루론산을 사용하여 시원 세포를 유리 기판 상에 고정화시켰다. 이어서, 배양물 표면의 특성을 변경시켜 제2 세포 유형의 부착을 촉진시킴으로써 별개의 패턴으로 히알루론산 상에 폴리-L-리신을 흡착시켰다. 이러한 접근법의 유용성은 배아 줄기 세포와 섬유아세포를 공동배양함으로써 입증된 바 있다 (문헌 [Khademhosseinin , A. et al . Layer - by - layer deposition of hyaluronic acid and poly -L- lysine for patterned cell co - cultures . Biomaterials , 25, 3583-92, 2004]).

폴리-리신으로 코팅된 전자 현미경 표본 필름을 사용하여 더블 및 싱글 스트랜드 DNA 분자를 시각화하였다 (문헌 [Williams , RC . Use of polylysine for adsorption of nuclei acids and enzymes to electron microscope specimen films . PNAS, 74(6), 2311- 2315, 1977]).

비피도박테리움(Bifidobacterium)은 인간 장관 내균 총에 존재하는 그램-양성의 비-운동성인 혐기성 세균이다. 이러한 세균은 냉동보존을 촉진시키기 위해 마이크로캡슐 제조시 알기네이트 폴리-L-리신 마이크로캡슐 내로 도입시켰다. 세균이 부하된 마이크로캡슐을 냉동-건조시키고, 장기간 동안 극저온에서 저장시킨다. 이러한 경우, 폴리-리신이 실제로는 항냉동제로서 작용하지는 않지만, 기본 알기네이트 구조를 안정화시키는 수단으로서 사용되었다 (문헌 [Cui , JH . et al. Effect of Additives on the Viability of Bifidobacteria Loaded in Alginate Poly-1-lysine Microparticles during the Freeze - drying Process . Arch Pharm . Res., 29(8), 707-711, 2006]).

폴리-L-리신으로 코팅된 플라스틱 및 유리 접시 또한 어류 배아의 발생과 관련된 과정들을 연구하는데 사용되어 왔다. 어란은 일반적으로는 다수의 세포 배양물로 처리된 표면에 부착되지 않는다. 그러나, 난은 폴리-리신으로 코팅된 플라스틱 및 유리 접시에는 부착될 것이다. 이어서, 정액을 도입하고, 난을 수정시켜 생성된 발생 과정을 모니터링한다 (문헌 [Andoh , T. et al. The use of poly -L- lysine to facilitate examination of sperm entry into pelagic , non - adhesive fish eggs . Int . J. Dev . Biol . 52, 753-7, 2008]).

실험부

본 실시예는 단지 예시적인 목적으로 제공되는 것이며, 첨부되는 특허청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 범주를 제한하는 것으로서 해석되서는 안된다. 하기 및 본 명세서 다른 곳에서 제공된 모든 참고 문헌은 본원에 참고로 포함된다.

1. 폴리 -D- 리신을 이용한 세포 배양 플레이트의 코팅.

폴리-D-리신 히드로브로마이드 (시그마, P7405, > 300 k 또는 P6407, 70-150 k) - 폴리-D-리신을 멸균 인산염 완충처리된 염수 (PBS) 중 100 ng/ml의 농도로 용해시켰다. 세포 배양 96-웰 플레이트의 웰에 분취량 (50 ㎕)을 분배하였다. 이를 30분 동안 실온 (전형적으로 25℃)에서 인큐베이션시켰다. 상기 시간 후, 임의의 남은 폴리-D-리신 용액은 버리고, 웰을 멸균 인산염 완충처리된 염수 (PBS) (200 ㎕)로 3회에 걸쳐 세척하였다.

건조되는 것을 막기 위해 최종의 100 ㎕ PBS 첨가는 계속하여 유지시켰다. 폴리-리신으로 코팅된 플레이트를 냉장고에서 수일 동안 저장할 수는 있지만, 통상은 48 hr 이내에 사용된다.

폴리-D-리신의 사용은 일례로서 제공되며, 이는 어느 방식으로든 제한적인 것은 아니다.

2. 냉동보존

문헌 [Cells - A laboratory Manual ", Spector D.L., Goldman R.D. and Leinwand L.A., Cold Spring Harbor laboratory press (1998)])에 기재된 바와 같이, 세포를 통상의 세포 배양 기법을 사용하여 세포 배양 베쓸 중에서 성장시켰다. 적절한 성장 단계에서, 상업적으로 이용가능한 x 1 트립신/EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산)를 사용하여 세포 배양 베쓸 표면으로부터 세포를 제거하고, 적절한 세포 배양 배지 중에 재현탁시켰다. 제조사의 설명서에 따라 케모테크 뉴클레오카운터(Chemotec Nucleocounter)를 사용하여 세포 개수를 측정하였다.

세포 20,000개 또는 5,000개를 100 ㎕ & 20 ㎕의 부피로 각각 96- 또는 384-웰 폴리-리신으로 코팅된 코스타(Costar) 조직 배양 처리된 백색 폴리스티렌 세포 배양물 분석용 플레이트 (카탈로그 번호 3917 및 3712) 내로 분배하고, 부착시키고, 16 hr 동안 회복시켰다. 다음날 배지를 제거하고, 상업적으로 이용가능한 PBS로 세포를 2회에 걸쳐 세척하였다. 90% 우태아 혈청 및 10% DMSO로 구성된 냉동보존 배지를 부착된 세포 상단 상에 분배하였다. 이어서, 세포 배양 플레이트 가장자리를 파라핀 (페시네 플라스틱 패키지(Pechiney Plastic Packages)) 또는 와트만 라보라토리 실링(Whatman Laboratory Sealing) 필름으로 실링하고, 전체 플레이트를 사란 배리어 랩(Saran Barrier Wrap) (다우 케미칼 컴퍼니(Dow Chemical Company))으로 랩핑하였다. 세포 배양 플레이트를 16 hr 동안 -80℃로 냉동시킨 후, 이를 옮겨 -140℃에서 더 장기간 동안 저장하였다.

3. 분석 수행능

회생시, 냉동된 세포 배양 플레이트를 -140℃로부터 제거하고, 해동시켰다. 냉동보존 배지를 제거하고, 미리-가온된 PBS로 세포를 2회에 걸쳐 세척하였다. 이어서, 적절한 효능제로 보충된 분석용 배지를 첨가하였다. 사용된 리포터 시스템에 대하여 가장 적절한 방법 및/또는 상업적으로 이용가능한 키트를 사용하여 세포-기반 검정을 수행하였다.

(i) 폴리 - 리신이 세포 부착 및 형태학적 성질에 미치는 효과

폴리-리신이 세포 부착 및 형태학적 성질에 미치는 효과를 이해하는 과정에서는 냉동보존 이전 및 냉동보존 이후의, 폴리-리신으로 코팅된 플레이트 및 폴리-리신으로 코팅되지 않는 플레이트 상에서 성장시킨 세포의 영상을 비교하였다 (도 1).

CHO VSV-β2AR-EGFP 안정 세포주 (도 1a)의 경우, 폴리-리신의 존재하에서는 융기된 세포의 형태학적 성질이 관찰되었다. 이러한 형태학적 성질은 세포가 폴리-리신의 부재하에서 성장된 경우에는 관찰되지 않았다.

HEK293 VSV-β2AR-EGFP 안정 세포 (도 1b)의 경우, 폴리-리신은 세포 부착을 촉진시키고 유지시킴으로써 그의 기능을 확실히 발휘하였다. 폴리-리신의 부재하에서는 아마도 세포가 냉동보존 및 세척 단계 동안에 탈착된 것으로 보였다.

( ii ) 폴리 - 리신이 세포주의 생존가능성에 미치는 효과

폴리-리신으로 코팅된 플레이트 상에 시딩된 세포주를 해동시킨 후에 세포 타이터-글로 발광 세포 생존가능성 검정 (프로메가)을 사용하여 그의 생존가능성을 측정하였다.

세포를 96-웰 플레이트 (±폴리-리신) 내로 시딩하고, 냉동보존한 후에 회생시켰다.

도 2로부터 알 수 있는 바와 같이, CHO VSV-β2AR-EGFP 안정 세포주의 경우, CHO 세포를 폴리-리신의 존재 또는 부재하에 플레이팅시켰을 때, 세포 생존가능성에 있어서 어떤 유의적인 차이도 발견되지 않았는데, 이는 폴리-리신이 세포 부착을 촉진시키지 않거나, 또는 냉동보존을 개선시키지 않는다는 것을 시사한다.

그러나, HEK293 VSV-β2AR-EGFP 안정 세포주의 경우에는 폴리-리신 존재가 생성되는 발광 신호를 유의적으로 개선시켰다. 세포 영상 데이터와 함께, 상기의 데이터는 폴리-리신이 냉동보존 및 세척 절차 동안 HEK293 세포 부착을 지지하고 유지시킨다는 것을 시사한다.

iii ) 폴리 - 리신이 세포 분석 수행능에 미치는 효과

폴리-리신을 포함 (+) 및 포함하지 않는 (-) 96-웰 플레이트 중 웰당 20,000개의 세포로 세포를 시딩하고, 밤새도록 부착시키고, 성장 배지를 제거하고, 냉동 배지를 첨가하였다 (90% 우태아 혈청 및 10% DMSO). 플레이트를 실링하고, 냉동보존하였다. 대조군으로서, 세포를 또한 전통적인 "냉동바이알" 보존 시스템을 사용하여 냉동보존하였다. (문헌 [Cells - A laboratory Manual , Spector D. L., Goldman R.D. and Leinwand L.A., Cold Spring Harbor laboratory press (1998)]).

냉동바이알 내에 포함되어 있는 세포를 해동시키기 위하여 냉동보존 배지를 세포-특이 성장 배지로 희석시키고, 현탁액을 원심분리하였다 (5 min 동안 1,000 x g). 생성된 세포 펠릿을 새로운 성장 배지 중에 재현탁시키고, 세포를 96-웰 플레이트 ((+) 및 (-) 폴리-리신 코팅)의 웰에 웰당 20,000개의 세포로 분배하였다. 분석 이전에 세포를 16 hr 동안 37℃, 5% CO₂에서 인큐베이션시켜 세포 부착을 촉진시켰다.

분석시, 플레이트를 냉동기로부터 제거하여 해동시켰다. 냉동 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 세척하고, β2AR 효능제인 이소프로테레놀을 함유하는 배지를 첨가하였다. 디스커버엑스의 히트헌터(DiscoverX's Hithunter) cAMP II 및 리드시커 인스트루먼트(Leadseeker Instrument) (GE 헬쓰케어((GE Healthcare))를 사용하여 GPCR 활성화시의 cAMP 수준 증가를 모니터링하였다. 대조군으로서 포스콜린 (나타내지 않음)을 사용하여 아데닐레이트 시클라제를 측정하였다.

기술된 실험에서, β2 AR로 안정하게 형질감염된 HEK293 및 CHO 세포 둘 다를 β2AR 효능제인 이소프로테레놀 또는 길항제인 이소프로프라놀롤을 사용하여 유발 검사하였다. 효능제에 노출되었을 때, 세포내 cAMP 농도는 상승하였는데, 이는 각종의 상업적으로 이용가능한 발광 키트, 예컨대, 히트헌터 cAMP II 키트 (디스커버엑스)를 리드시커 인스트루먼트 플랫폼 (GE 헬쓰케어)과 조합하여 함께 사용함으로써 모니터링할 수 있었다.

대조군으로서는, 편재하여 발현된 아데닐레이트 시클라제 활성을 그의 각각의 효능제 포스콜린을 사용하여 유발 검사하였을 때, 세포내 cAMP 농도의 증가 또한 따로따로 모니터링하였다. 오직 AD293 세포주에서만 아데닐레이트 시클라제 활성이 모니터링되었다.

세포내 cAMP 농도를 모니터링하도록 디스커버엑스 분석 시스템을 디자인하였을 때, 분석용 배지를 최종 농도 1 mM의 일반 포스포디에스터라제 억제제인 이소부틸메틸크산틴 (IBMX)으로 보충하였다.

이소프로테레놀 검정 - 이소프로테레놀 (시그마 I2760)을 물에 용해시켜 스톡 농도가 100 mM이 되도록 만들었다. 이어서, 상기를 분석용 배지 중에 희석시켜 최종 이소프로테레놀 농도 범위가 200 μM - 1 pM이 되도록 만들었다.

포스콜린 검정 - 포스콜린 (시그마 F6886-10 mg)을 DMSO에 용해시켜 스톡 농도가 10 mM이 되도록 만들었다. 이어서, 상기를 ½-로그 희석법을 사용하여 분석용 배지 중에 연속적으로 희석시켜 최종 포스콜린 농도 범위가 316 μM - 3.16 nM이 되도록 만들었다.

프로프라놀롤 검정 - 프로프라놀롤 (시그마 P8688)을 물에 용해시켜 스톡 농도가 100 mM이 되도록 만들었다. 이어서, 상기를 분석용 배지 중에 희석시켜 최종 프로프라놀롤 농도 범위가 200 μM - 1 pM이 되도록 만들었다. 20 nM 이소프로테레놀의 존재하에서 프로프라놀롤 용량 반응 곡선을 달성하였다.

분석용 배지를 (-) 효능제 또는 길항제인 세포에 첨가한, 비-효능제 대조군에서도 또한 수행하였다.

디스커버엑스 분석 히트헌터 cAMP II 검정 - 본 검정은 제조사의 설명서에 따라 수행하였으며, 간략하면, 하기 과정을 포함하였다. -140℃의 저장으로부터 회생시킬 때, 세포 배양물로 처리된 96-웰 플레이트 상에서 냉동된 세포를 해동시켰다. 해동시, 냉동보존 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 2회에 걸쳐 세척하였다. 이어서, 1 mM IBMX 및 적절한 효능제 및/또는 길항제로 보충된 분석용 배지를 첨가하였다.

전형적으로는 96-웰의 세포 배양물로 처리된 플레이트에서 수행되는 검정을 위해서 20,000개의 세포를 사용하였다. 분석용 배지를 세포에 첨가할 때, 분석용 플레이트를 30 min 동안 37℃에서 인큐베이션시키고, 이후, 40 ㎕의 디스커버엑스 cAMP II ED/기질 혼합물을 첨가하였다. 이는 1부의 기질 작동 용액 (기질 작동 용액은 1부의 갈락톤-스타(Galacton-Star), 5부의 에메랄드 II(Emerald II) 및 19부의 기질 희석제(Substrate Diluent)로 구성되었다)과 함께 1부의 cAMP II ED 시약으로 구성되었다. 분석용 플레이트를 와동시켜 세포가 확실하게 효율적으로 도포될 수 있도록 하였다. 이어서, 동량의 EA-Ab/용해 믹스 (40 ㎕)를 첨가하였다. 이는 1부의 cAMP II EA-Ab 시약 및 1부의 cAMP II 용해 완충액으로 구성되었다. 분석용 플레이트를 4 hr 동안 실온에서 인큐베이션시키고, 리드시커 인스트루먼트 플랫폼을 사용하여 발광 신호의 발생을 모니터링함으로써 cAMP 농도를 측정하였다.

384-웰의 세포 배양물로 처리된 플레이트에서 수행되는 검정은 상기 기술된 바와 같이 수행하되, 단, 웰당 오직 5,000개의 세포를 분배하였고, 부피가 50% 감소된 (즉, 20 ㎕로 감소된) 디스커버엑스 cAMP II ED/기질 혼합물 및 EA-AB/용해 믹스를 사용하였다.

CHO VSV-β2AR-EGFP 세포의 경우, 폴리-리신으로 코팅된 냉동바이알 및 플레이트와 비교하였을 때, 폴리-리신의 부재하에서 4주를 초과하는 기간 동안 냉동된 플레이트의 분석 수행능은 S/B, S/N 및 특히 Z 값에 있어서 감소하였다. (i) 폴리-리신으로 코팅된 플레이트 및 폴리-리신으로 코팅되지 않는 플레이트 상에서 분석하였을 때, 냉동바이알에서 보존된 세포, 및 (ii) 직접 냉동보존되고, 폴리-리신으로 코팅된 플레이트 상에서 분석된 세포 둘 다는 유사한 분석 수행능을 나타내었다. 냉동바이알 중에서 냉동보존된 후, 이어서, 회생되고, 분석용 마이크로타이터 플레이트로 옮겨진 세포의 경우, 표 1로부터 알 수 있는 바와 같이, 폴리-리신은 분석 수행능에는 거의 영향을 미치지 않는 것으로 보였다.

HEK293 VSV-β2AR-EGFP 세포주의 경우, 냉동보존 및 분석 시스템, 둘 다, 즉, (i) 냉동보존되고 냉동된 플레이트 상에서 분석하였을 때, 및 (ii) 냉동바이알 중에서 냉동보존되고, 분석용 플레이트로 옮겼을 때, 폴리-리신이 분석 수행능에 미치는 효과가 양성인 것으로 관찰되었다. (표 2). 폴리-리신의 부재하에서 회생된 세포의 분석 수행능은 열악하였다.

iv) 폴리-리신은 냉동보존된 AD293 세포의 분석 수행능에 유익한 효과를 발휘하였다 (도 3 및 표 3). 이는 개선된 부착 특성을 보이도록 공학처리된 HEK293 세포였다.

상기 데이터로부터 알 수 있는 바와 같이, 폴리-리신은 포스콜린 자극에 대한 AD293 세포의 반응 크기를 현저하게 증가시킬 뿐만 아니라 (도 3 & 표 3), 우수한 분석 수행능을 시사하는 개선된 Z 값을 갖도록 하였다.

CHO VSV -β2 AR - EGFP - 효능제 및 길항제 용량 반응 곡선

이소프로테레놀 EC50 값 - i) 전통적인 냉동바이알 시스템을 사용하여 냉동보존된 (후, ±폴리-리신으로 코팅된 분석용 마이크로타이터 플레이트로 옮겨지고 분석된) 세포 또는 ii) 직접 폴리-리신으로 코팅된 마이크로타이터 플레이트 상에서 냉동보존되고 분석된 세포를 사용하여 수행된 분석에 있어서 유사한 분석 수행능을 나타내었다 (도 4a).

세포를 폴리-리신의 부재하에 마이크로타이터 포맷을 사용하여 냉동보존하였을 때, 보다 열악한 분석 수행능이 관찰되었다. 효능제 자극에 대한 반응으로 신호 변동이 증가한 것으로 뚜렷하게 나타났고, 효능제에 의해 유도되는 반응의 크기는 감소하였다.

흥미롭게도, 모든 검정에서 효능제 이소프로테레놀에 대한 반응으로 유사한 EC50 값이 관찰되었다. 그러므로, 모든 세포가 적절한 효능제 유도성 반응을 발생시키는 것으로 보였으나; 그 반응의 크기는 세포를 폴리-리신의 부재하에서 플레이트 상에서 냉동보존하였을 때보다는 낮았다.

프로프라놀롤 IC50 값 - (20 nM 이소프로테레놀 (ISPL)의 존재하에서 수행되고) β2AR 길항제 프로프라놀롤을 사용하여 수행된 검정에서 유사한 경향이 관찰되었다. CHO VSV-β2AR-EGFP 세포를 폴리-리신의 부재하에서 마이크로타이터 플레이트내에서 직접 냉동보존하는 검정에서만 오직 수행능이 감소된 것으로 관찰되었다. 다시 한번 수행하였을 때, 유사한 IC50 결과가 관찰되었다 (도 4b).

앞서 제시한 바와 같이, 폴리-리신은 CHO 세포 생존가능성 또는 부착에 영향을 미치지 않았다. 그러므로, 이러한 데이터는, 폴리-리신의 존재가 오직 96-웰 마이크로타이터 플레이트내에서 직접 냉동보존된 세포의 분석 수행능만을 개선시킨다는 것을 시사한다. 이러한 세포의 수행능은 냉동바이알에서 냉동보존된 후 분석용 플레이트로 옮겨진 세포에 의해 입증된 것과 등가한다. 그러므로, 또한 분석용 플레이트로서도 사용하기에 적합한 폴리-리신으로 코팅된 플레이트에서 직접 냉동보존된 세포는 필요한 시간량과 수작업량은 감소시킨다.

HEK293 VSV -β2 AR - EGFP - 효능제 및 길항제 용량 반응 곡선 (도 5)

이소프로테레놀 EC50 값 - 유사한 분석 수행능은 오직 세포를 폴리-리신으로 코팅된 마이크로타이터 플레이트 상에 시딩시킨 검정에서만 나타났다. 이는 i) 냉동바이알에서 냉동보존된 후, 분석용 폴리-리신으로 코팅된 플레이트로 옮겨진 세포 및 ii) 직접 폴리-리신으로 코팅된 플레이트내에서 직접 냉동보존된 세포를 포함한다 (도 5a).

HEK293 세포는 전통적으로 마이크로타이터 플레이트에서의 세포 부착을 촉진시키는데 폴리-리신이 필요하다. 폴리-리신으로 코팅된 플레이트 상에서 냉동보존된 동일의 세포와 비교하였을 때, 코팅되지 않은 플레이트 상에 시딩된 후, 냉동보존된 HEK293 세포는 그 개수가 감소되어 있었다. 그러므로, HEK293 세포 분석 수행능을 개선시키는 폴리-리신의 특성 중 하나는 세포 부착 증진과 관련이 있다.

세포를 폴리-리신의 부재하에서 마이크로타이터 포맷을 사용하여 냉동보존하였을 때 (및 심지어는 냉동바이알에서 냉동보존하고, 코팅되지 않은 플레이트로 옮겼을 때)에는 분석 수행능이 보다 열악한 것으로 나타났다. 다시 한번 수행하였을 때, 효능제 자극에 대한 반응으로 신호 변동이 증가한 것으로 뚜렷하게 나타났고, 효능제에 의해 유도되는 반응의 크기는 감소하였다.

조건과는 상관없이 모든 검정에서 효능제 이소프로테레놀에 대한 반응으로 유사한 EC50 값이 관찰되었는 바, 이에 모든 세포는 적절한 반응을 나타낸 것으로 보였으나; 그 반응의 크기는 세포를 폴리-리신의 부재하에서 냉동보존하였을 때 (냉동보존하고, 플레이트 상에서 분석하였을 때)보다는 낮았다.

프로프라놀롤 IC50 값 - (20 nM ISPL의 존재하에서 수행되고) β2AR 길항제 프로프라놀롤을 사용하여 수행된 검정에서 유사한 경향이 관찰되었다. 냉동보존 배지와는 상관없이, HEK293 세포를 폴리-리신의 부재하에서 마이크로타이터 플레이트내에서 분석한 검정에서만 오직 수행능이 감소된 것으로 관찰되었다. 다시 한번 수행하였을 때, 모든 검정에 대하여 유사한 IC50 결과가 관찰되었고, ± 폴리-리신으로 코팅된 플레이트에서 그 크기 및 변이만이 차이가 있었다 (도 5b).

이러한 데이터는, 폴리-리신의 존재가 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서 직접 냉동보존된 세포 뿐만 아니라, 냉동바이알에서 보존된 후, 폴리-리신으로 코팅된 분석용 플레이트로 옮겨진 세포의 분석 수행능도 개선시킨다는 것을 시사한다. 직접 폴리-리신으로 코팅된 플레이트내에서 냉동보존된 HEK293 세포의 수행능은 냉동바이알에서 냉동보존된 후 분석용 플레이트로 옮겨진 세포에 의해 입증된 것과 등가한다. 이후에 분석에서 사용될 수 있는, 세포를 플레이트 상에서 직접 냉동보존하는 것은 필요한 시간량과 수작업량 둘 다를 감소시킨다.

이러한 데이터는 또한 냉동보존 이전에 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 폴리-리신로 미리 코팅시키면 해동시 세포의 분석 수행능은 개선된다는 것을 입증한다. 추가 이점은 필요한 시간량과 수작업량 둘 다를 감소시킨다는 것이다.

Claims

적어도 하나의 표면을 갖는 용기,
상기 표면 상에 지지된 냉동된 세포
를 포함하며, 상기 표면이 폴리-리신으로 코팅된 것임을 특징으로 하는, 냉동보존된 세포 배양물.
제1항에 있어서, 폴리-리신이 폴리-D-리신, 폴리-L-리신 및 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 세포 배양물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 용기가 베쓸, 바이알, 마이크로타이터 플레이트 및 세포 배양 플레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 세포 배양물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 부착 세포인 세포 배양물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 포유동물 세포, 곤충 세포, 양서류 세포, 어류 세포, 파충류 세포 및 조류 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 세포 배양물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 포유동물 세포인 세포 배양물.
제6항에 있어서, 상기 세포가 CHO 세포, HEK293 세포 및 AD293 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 세포 배양물.
a) 세포를 함유하는 배지를 용기 표면에 첨가하여 상기 세포가 상기 표면에 부착될 수 있게 하여 세포 배양물을 형성하는 단계;
b) 냉동보존 배지를 첨가하는 단계; 및
c) 상기 세포 배양물의 온도를 -20℃ 또는 그 아래로 감소시키는 단계
를 포함하며, 여기서 상기 단계 a) 이전에 상기 표면을 폴리-리신으로 코팅하는 것을 특징으로 하는, 세포 배양물 중의 세포를 냉동보존하는 방법.
제8항에 있어서, 폴리-리신이 폴리-D-리신, 폴리-L-리신 및 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제8항 또는 제9항에 있어서, 표면을 폴리-리신 용액으로 세척함으로써 표면을 코팅하는 것인 방법.
제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 용기가 베쓸, 바이알, 마이크로타이터 플레이트 및 세포 배양 플레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 부착 세포인 방법.
제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 포유동물 세포, 곤충 세포, 양서류 세포, 어류 세포, 파충류 세포 및 조류 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 포유동물 세포인 방법.
제8항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 CHO 세포, HEK293 세포 및 AD293 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제8항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양물을 -80℃ 미만의 온도에서 저장하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
a) 세포를 함유하는 배지를 용기 표면에 첨가하여 상기 세포가 상기 표면에 부착될 수 있게 하여 세포 배양물을 형성하는 단계;
b) 냉동보존 배지를 첨가하는 단계;
c) 상기 배지의 온도를 감소시켜 상기 세포 배양물을 냉동시키는 단계;
d) 세포 배양물을 -20℃ 미만의 온도에서 저장하는 단계;
e) 세포 배양물의 온도를 상승시켜 상기 세포를 해동시키는 단계;
f) 세포에 대한 세포 검정을 수행하는 단계
를 포함하며, 여기서 상기 단계 a) 이전에 상기 용기 표면을 폴리-리신으로 코팅하는 것을 특징으로 하는, 세포 검정을 수행하는 방법.
제17항에 있어서, 세포 배양물을 -80℃ 미만의 온도에서 저장하는 방법.
제17항 또는 제18항에 있어서, 폴리-리신이 폴리-D-리신, 폴리-L-리신 및 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 용기가 베쓸, 바이알, 마이크로타이터 플레이트 및 세포 배양 플레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 부착 세포인 방법.
제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)의 세포가 하나 이상의 마이크로캐리어에 부착되는 것인 방법.
제22항에 있어서, 상기 하나 이상의 마이크로캐리어가 폴리-리신으로 코팅되는 것인 방법.
제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 포유동물 세포, 곤충 세포, 양서류 세포, 어류 세포, 파충류 세포 및 조류 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 포유동물 세포인 방법.
제17항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 CHO 세포, HEK293 세포 및 AD293 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.