JP2001112481A - クリプトスポリジウム・パルバムに由来するｒｎａの検出方法 - Google Patents
クリプトスポリジウム・パルバムに由来するｒｎａの検出方法Info
- Publication number
- JP2001112481A JP2001112481A JP29244399A JP29244399A JP2001112481A JP 2001112481 A JP2001112481 A JP 2001112481A JP 29244399 A JP29244399 A JP 29244399A JP 29244399 A JP29244399 A JP 29244399A JP 2001112481 A JP2001112481 A JP 2001112481A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cryptosporidium parvum
- nucleotide sequence
- parvum
- seq
- mrna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 迅速かつ簡便にクリプトスポリジウム・パル
バムを検出するための、クリプトスポリジウム・パルバ
ムに由来するＲＮＡの検出方法、検出用試薬キット、及
び、クリプトスポリジウム・パルバムに特異的な新規な
塩基配列を有するＤＮＡを提供する。 【解決手段】 クリプトスポリジウム・パルバムに特異
的な塩基配列を有するｍＲＮＡの一部を増幅する行程、
及び、得られた増幅生成物とプローブとをハイブリダイ
ゼーションさせる行程を有するクリプトスポリジウム・
パルバムに由来するＲＮＡの検出方法。
バムを検出するための、クリプトスポリジウム・パルバ
ムに由来するＲＮＡの検出方法、検出用試薬キット、及
び、クリプトスポリジウム・パルバムに特異的な新規な
塩基配列を有するＤＮＡを提供する。 【解決手段】 クリプトスポリジウム・パルバムに特異
的な塩基配列を有するｍＲＮＡの一部を増幅する行程、
及び、得られた増幅生成物とプローブとをハイブリダイ
ゼーションさせる行程を有するクリプトスポリジウム・
パルバムに由来するＲＮＡの検出方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、試料中のクリプト
スポリジウム・パルバム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉ
ｕｍ ｐａｒｖｕｍ）に由来するＲＮＡの検出方法、検
出用試薬キット、及び、新規な塩基配列を有するＤＮＡ
に関する。
スポリジウム・パルバム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉ
ｕｍ ｐａｒｖｕｍ）に由来するＲＮＡの検出方法、検
出用試薬キット、及び、新規な塩基配列を有するＤＮＡ
に関する。
【０００２】
【従来の技術】クリプトスポリジウム・パルバムは、胞
子虫類コクシジウム目アイメリア亜目に属する直径５μ
ｍの小型類円形の消化管寄生原虫である。この原虫に感
染すると、一般に激しい下痢と腹痛が主症状で感染から
１〜４週間後には自然治癒するケースが多いが、乳幼児
や高齢者では長期化、重症化するケースもある。またＡ
ＩＤＳ患者では年余にわたってクリプトスポリジウム・
パルバムが腸粘膜で増殖を繰り返し、やがて衰弱死する
ケースが多い。この原虫は塩素に対して耐性を示すため
通常の浄化施設では完全な処理が困難である。このこと
から、近年水系による下痢症の集団発生を起こす病原微
生物として大きな問題となっている。
子虫類コクシジウム目アイメリア亜目に属する直径５μ
ｍの小型類円形の消化管寄生原虫である。この原虫に感
染すると、一般に激しい下痢と腹痛が主症状で感染から
１〜４週間後には自然治癒するケースが多いが、乳幼児
や高齢者では長期化、重症化するケースもある。またＡ
ＩＤＳ患者では年余にわたってクリプトスポリジウム・
パルバムが腸粘膜で増殖を繰り返し、やがて衰弱死する
ケースが多い。この原虫は塩素に対して耐性を示すため
通常の浄化施設では完全な処理が困難である。このこと
から、近年水系による下痢症の集団発生を起こす病原微
生物として大きな問題となっている。
【０００３】感染経路は、糞便の経口感染に起因するヒ
トからヒトへの感染、飲料水、食品汚染による経口感染
に起因する家畜からヒトへの感染、放牧場、畜舎周辺、
有機肥料使用の農地等の環境汚染による水を介してのヒ
トへの感染等様々な経路がある。
トからヒトへの感染、飲料水、食品汚染による経口感染
に起因する家畜からヒトへの感染、放牧場、畜舎周辺、
有機肥料使用の農地等の環境汚染による水を介してのヒ
トへの感染等様々な経路がある。
【０００４】クリプトスポリジウム・パルバムに対する
有効な薬剤や治療法は確立していない。そのため早期発
見による予防処置が大変重要である。実際の環境水の感
染リスクを正確に知るためには、生存するオーシストの
有無を知ることが必要となる。現在クリプトスポリジウ
ム・パルバムの生死判定法としては、ＤＡＰＩ／ＰＩ染
色が知られている。この方法は、ＤＡＰＩ及びＰＩ溶液
で試料を染色し、その染まり具合の差を顕微鏡で観察す
る方法であるが、熟練を要し時間がかかる等の問題点が
ある。
有効な薬剤や治療法は確立していない。そのため早期発
見による予防処置が大変重要である。実際の環境水の感
染リスクを正確に知るためには、生存するオーシストの
有無を知ることが必要となる。現在クリプトスポリジウ
ム・パルバムの生死判定法としては、ＤＡＰＩ／ＰＩ染
色が知られている。この方法は、ＤＡＰＩ及びＰＩ溶液
で試料を染色し、その染まり具合の差を顕微鏡で観察す
る方法であるが、熟練を要し時間がかかる等の問題点が
ある。
【０００５】クリプトスポリジウム・パルバムのＤＮＡ
をＰＣＲによって増幅し、電気泳動やハイブリダイゼー
ションを用いて検出する方法は既に開発されており、こ
の方法により簡便かつ迅速に試料中のオーシストを検出
できるが、一般的にＤＮＡは生物の死亡後も長期間残っ
ており、サンプル中からＰＣＲによってクリプトスポリ
ジウム・パルバムのＤＮＡを増幅し検出した場合、死亡
しているクリプトスポリジウム・パルバムからのＤＮＡ
も検出してしまう可能性が高い。そのため、実際のリス
クよりも高く評価してしまう可能性がある。
をＰＣＲによって増幅し、電気泳動やハイブリダイゼー
ションを用いて検出する方法は既に開発されており、こ
の方法により簡便かつ迅速に試料中のオーシストを検出
できるが、一般的にＤＮＡは生物の死亡後も長期間残っ
ており、サンプル中からＰＣＲによってクリプトスポリ
ジウム・パルバムのＤＮＡを増幅し検出した場合、死亡
しているクリプトスポリジウム・パルバムからのＤＮＡ
も検出してしまう可能性が高い。そのため、実際のリス
クよりも高く評価してしまう可能性がある。
【０００６】一方、ｍＲＮＡは、生物の死亡後すばやく
分解されるため、生きた生物にしか検出されない（Ａｐ
ｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．（１９９
８）６４，１３１３−１３１８）。したがってクリプト
スポリジウム・パルバムのｍＲＮＡを増幅し検出するこ
とで、生存するクリプトスポリジウム・パルバムのオー
シストのみを検出できる可能性がある。
分解されるため、生きた生物にしか検出されない（Ａｐ
ｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．（１９９
８）６４，１３１３−１３１８）。したがってクリプト
スポリジウム・パルバムのｍＲＮＡを増幅し検出するこ
とで、生存するクリプトスポリジウム・パルバムのオー
シストのみを検出できる可能性がある。
【０００７】これまでに、ＲＴ−ＰＣＲを用いてクリプ
トスポリジウム・パルバムのＲＮＡを検出する前例（Ａ
ｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．（１９
９６）６２，３３８５−３３９０）はあるが、ＲＴ−Ｐ
ＣＲはＲＮＡとともにＤＮＡも増幅するため、増幅生成
物がＲＮＡ由来のものかＤＮＡ由来のものか区別できな
い。そのためＲＴ−ＰＣＲによるＲＮＡの増幅を行う前
に試料をＤＮａｓｅにより処理する必要がある。それに
対しＮＡＳＢＡ等により増幅する方法はＲＮＡのみを増
幅するため、ＤＮａｓｅ処理を必要としない。またＲＴ
−ＰＣＲに比べ、短時間で増幅が行われる。
トスポリジウム・パルバムのＲＮＡを検出する前例（Ａ
ｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．（１９
９６）６２，３３８５−３３９０）はあるが、ＲＴ−Ｐ
ＣＲはＲＮＡとともにＤＮＡも増幅するため、増幅生成
物がＲＮＡ由来のものかＤＮＡ由来のものか区別できな
い。そのためＲＴ−ＰＣＲによるＲＮＡの増幅を行う前
に試料をＤＮａｓｅにより処理する必要がある。それに
対しＮＡＳＢＡ等により増幅する方法はＲＮＡのみを増
幅するため、ＤＮａｓｅ処理を必要としない。またＲＴ
−ＰＣＲに比べ、短時間で増幅が行われる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記現状に
鑑み、迅速かつ簡便にクリプトスポリジウム・パルバム
を検出するための、クリプトスポリジウム・パルバムに
由来するＲＮＡの検出方法、検出用試薬キット、及び、
クリプトスポリジウム・パルバムに特異的な新規な塩基
配列を有するＤＮＡを提供することを目的とするもので
ある。
鑑み、迅速かつ簡便にクリプトスポリジウム・パルバム
を検出するための、クリプトスポリジウム・パルバムに
由来するＲＮＡの検出方法、検出用試薬キット、及び、
クリプトスポリジウム・パルバムに特異的な新規な塩基
配列を有するＤＮＡを提供することを目的とするもので
ある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、クリプトスポ
リジウム・パルバムに特異的な塩基配列を有するｍＲＮ
Ａの一部を増幅する行程、及び、得られた増幅生成物と
プローブとをハイブリダイゼーションさせる行程を有す
るクリプトスポリジウム・パルバムに由来するＲＮＡの
検出方法である。以下に本発明を詳述する。
リジウム・パルバムに特異的な塩基配列を有するｍＲＮ
Ａの一部を増幅する行程、及び、得られた増幅生成物と
プローブとをハイブリダイゼーションさせる行程を有す
るクリプトスポリジウム・パルバムに由来するＲＮＡの
検出方法である。以下に本発明を詳述する。
【００１０】クリプトスポリジウム・パルバムのＲＮＡ
を検出する方法としては既にヒートショックタンパク質
７０（ＨＳＰ７０）遺伝子のｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲに
より増幅し、検出する方法が既に発表されているが、本
発明は更に効率のよい方法を提供する。
を検出する方法としては既にヒートショックタンパク質
７０（ＨＳＰ７０）遺伝子のｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲに
より増幅し、検出する方法が既に発表されているが、本
発明は更に効率のよい方法を提供する。
【００１１】本発明は、サンプル中から抽出したＲＮＡ
を増幅し、その増幅生成物にクリプトスポリジウム・パ
ルバムに対し特異的なプローブをハイブリダイズさせる
ことによって、サンプル中のクリプトスポリジウム・パ
ルバムの存在を決定するものである。
を増幅し、その増幅生成物にクリプトスポリジウム・パ
ルバムに対し特異的なプローブをハイブリダイズさせる
ことによって、サンプル中のクリプトスポリジウム・パ
ルバムの存在を決定するものである。
【００１２】本発明においては、まず、クリプトスポリ
ジウム・パルバムに特異的な塩基配列を有するｍＲＮＡ
の一部を増幅する。クリプトスポリジウム・パルバムに
特異的な塩基配列を有するｍＲＮＡとしてはクリプトス
ポリジウム・パルバムに特異的であれば特に限定されな
いが、ヒートショックタンパク質８６（ｈｅａｔ ｓｈ
ｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ８６、以下、ＨＳＰ８６とい
う）遺伝子のｍＲＮＡが好適に用いられる。本発明に用
いる核酸増幅領域は、ＨＳＰ８６遺伝子内の塩基配列の
一部であり、ＨＳＰ遺伝子は一般に熱ショックをかける
ことにより大量のｍＲＮＡを生成する利点がある。配列
番号１に示すＤＮＡは、増幅されるＨＳＰ８６遺伝子の
一部分であり、ハイブリダイゼーションの標的領域配列
である。配列番号１に示す塩基配列は新規なものであ
る。
ジウム・パルバムに特異的な塩基配列を有するｍＲＮＡ
の一部を増幅する。クリプトスポリジウム・パルバムに
特異的な塩基配列を有するｍＲＮＡとしてはクリプトス
ポリジウム・パルバムに特異的であれば特に限定されな
いが、ヒートショックタンパク質８６（ｈｅａｔ ｓｈ
ｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ８６、以下、ＨＳＰ８６とい
う）遺伝子のｍＲＮＡが好適に用いられる。本発明に用
いる核酸増幅領域は、ＨＳＰ８６遺伝子内の塩基配列の
一部であり、ＨＳＰ遺伝子は一般に熱ショックをかける
ことにより大量のｍＲＮＡを生成する利点がある。配列
番号１に示すＤＮＡは、増幅されるＨＳＰ８６遺伝子の
一部分であり、ハイブリダイゼーションの標的領域配列
である。配列番号１に示す塩基配列は新規なものであ
る。
【００１３】クリプトスポリジウム・パルバムに特異的
な塩基配列を有するｍＲＮＡは、クリプトスポリジウム
・パルバムが含まれている試料から抽出される。上記試
料としては特に限定されず、例えば、生体試料や環境試
料等を挙げることができる。上記生体試料としては、糞
便検体や生検試料等を挙げることができる。上記環境試
料としては、水道水、排液のような環境中から採取され
た試料を挙げることができる。
な塩基配列を有するｍＲＮＡは、クリプトスポリジウム
・パルバムが含まれている試料から抽出される。上記試
料としては特に限定されず、例えば、生体試料や環境試
料等を挙げることができる。上記生体試料としては、糞
便検体や生検試料等を挙げることができる。上記環境試
料としては、水道水、排液のような環境中から採取され
た試料を挙げることができる。
【００１４】本発明において、クリプトスポリジウム・
パルバムに特異的な塩基配列を有するｍＲＮＡの一部を
増幅する工程においては、配列番号２に示す塩基配列の
少なくとも一部分を含み少なくとも１０ヌクレオチドの
鎖長であるＤＮＡと、配列番号３に示す塩基配列の少な
くとも一部分を含み少なくとも１０ヌクレオチドの鎖長
であるＤＮＡとを、プライマーセットとして用いるのが
好ましい。配列番号２及び配列番号３に示す塩基配列
は、いずれも新規なものである。また、増幅工程におい
ては、ＮＡＳＢＡ技術を用いるのが好ましい。増幅は、
クリプトスポリジウム・パルバムに特異的な塩基配列を
有するｍＲＮＡが検出可能なレベルにまで行うことが必
要である。
パルバムに特異的な塩基配列を有するｍＲＮＡの一部を
増幅する工程においては、配列番号２に示す塩基配列の
少なくとも一部分を含み少なくとも１０ヌクレオチドの
鎖長であるＤＮＡと、配列番号３に示す塩基配列の少な
くとも一部分を含み少なくとも１０ヌクレオチドの鎖長
であるＤＮＡとを、プライマーセットとして用いるのが
好ましい。配列番号２及び配列番号３に示す塩基配列
は、いずれも新規なものである。また、増幅工程におい
ては、ＮＡＳＢＡ技術を用いるのが好ましい。増幅は、
クリプトスポリジウム・パルバムに特異的な塩基配列を
有するｍＲＮＡが検出可能なレベルにまで行うことが必
要である。
【００１５】ＮＡＳＢＡ技術による増幅の際には、配列
番号３に示すオリゴヌクレオチドにＴ７プロモーター配
列を連結させた配列番号４に示すオリゴヌクレオチドを
プライマーに用いるのが好ましい。配列番号４に示す塩
基配列は新規なものである。
番号３に示すオリゴヌクレオチドにＴ７プロモーター配
列を連結させた配列番号４に示すオリゴヌクレオチドを
プライマーに用いるのが好ましい。配列番号４に示す塩
基配列は新規なものである。
【００１６】本発明においては、次いで、得られた増幅
生成物とプローブとをハイブリダイゼーションさせる。
本発明において、上記プローブには、ストリンジェント
な条件下で得られた増幅生成物に対して特異的なハイブ
リダイズを達成することが可能なすべてのオリゴヌクレ
オチドが含まれる。したがって、上記増幅生成物に対し
て必ずしも完全に相補的な塩基配列である必要はない。
即ち、上記増幅生成物に相補的な塩基配列に対して、１
つ又は複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は、付
加した塩基配列によって構成され、上記増幅生成物に特
異的にハイブリダイゼーションすることができるオリゴ
ヌクレオチドをも含む。また、ハイブリダイズに必要な
塩基配列で構成される部分に対して、更に付加的な領域
を持つこともできる。また、上記プローブはＤＮＡであ
ってもＲＮＡであってもよい。
生成物とプローブとをハイブリダイゼーションさせる。
本発明において、上記プローブには、ストリンジェント
な条件下で得られた増幅生成物に対して特異的なハイブ
リダイズを達成することが可能なすべてのオリゴヌクレ
オチドが含まれる。したがって、上記増幅生成物に対し
て必ずしも完全に相補的な塩基配列である必要はない。
即ち、上記増幅生成物に相補的な塩基配列に対して、１
つ又は複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は、付
加した塩基配列によって構成され、上記増幅生成物に特
異的にハイブリダイゼーションすることができるオリゴ
ヌクレオチドをも含む。また、ハイブリダイズに必要な
塩基配列で構成される部分に対して、更に付加的な領域
を持つこともできる。また、上記プローブはＤＮＡであ
ってもＲＮＡであってもよい。
【００１７】本発明においてストリンジェントな条件と
しては特に限定されず、例えば、５×ＳＳＣ、０．５％
ブロッキング試薬、０．５％ポリビニルピロリドンＫ−
３０、１％ＳＤＳ、５５℃でのハイブリダイゼーショ
ン、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５５℃での洗浄とい
う条件を挙げることができる。これらの条件は限定され
るものではなく、同様のストリンジェンシーを与える条
件も含まれる。
しては特に限定されず、例えば、５×ＳＳＣ、０．５％
ブロッキング試薬、０．５％ポリビニルピロリドンＫ−
３０、１％ＳＤＳ、５５℃でのハイブリダイゼーショ
ン、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５５℃での洗浄とい
う条件を挙げることができる。これらの条件は限定され
るものではなく、同様のストリンジェンシーを与える条
件も含まれる。
【００１８】上記プローブとしては、配列番号５に示す
塩基配列の少なくとも一部分を含むＤＮＡを好適に用い
ることができる。なお、配列番号５に示す塩基配列は新
規なものである。配列番号５に示す塩基配列の少なくと
も一部分を含むＤＮＡは、少なくとも１０塩基の鎖長で
あるのが好ましい。ストリンジェントな条件下で特異的
なハイブリダイゼーションを達成するには、より好まし
くは２０〜３０塩基の鎖長である。
塩基配列の少なくとも一部分を含むＤＮＡを好適に用い
ることができる。なお、配列番号５に示す塩基配列は新
規なものである。配列番号５に示す塩基配列の少なくと
も一部分を含むＤＮＡは、少なくとも１０塩基の鎖長で
あるのが好ましい。ストリンジェントな条件下で特異的
なハイブリダイゼーションを達成するには、より好まし
くは２０〜３０塩基の鎖長である。
【００１９】本発明において、上記プローブは標識して
用いる。上記プローブを標識するための標識物質及びそ
れをプローブに修飾する方法としては特に限定されず、
例えば、ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）、32Ｐ、他の認識さ
れうる官能基、ビオチン、蛍光色素、アルカリホスファ
ターゼ、西洋ワサビパーオキシダーゼ等の容易に検出可
能な反応生成物を生成することのできる酵素、又は、そ
れに対して特異的な抗血清又はモノクローナル抗体が得
られる抗原等を標識物質として用いてプローブを修飾す
る方法を挙げることができる。このうち、ジゴキシゲニ
ンのような抗原やアルカリフォスタファーゼのような酵
素によって修飾したものをプローブとして用いるのが好
ましい。
用いる。上記プローブを標識するための標識物質及びそ
れをプローブに修飾する方法としては特に限定されず、
例えば、ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）、32Ｐ、他の認識さ
れうる官能基、ビオチン、蛍光色素、アルカリホスファ
ターゼ、西洋ワサビパーオキシダーゼ等の容易に検出可
能な反応生成物を生成することのできる酵素、又は、そ
れに対して特異的な抗血清又はモノクローナル抗体が得
られる抗原等を標識物質として用いてプローブを修飾す
る方法を挙げることができる。このうち、ジゴキシゲニ
ンのような抗原やアルカリフォスタファーゼのような酵
素によって修飾したものをプローブとして用いるのが好
ましい。
【００２０】本発明においては、増幅生成物とプローブ
とをハイブリダイゼーションが可能な条件で接触させ
る。本発明において、ハイブリダイゼーションとは核酸
の２本の相補鎖を一緒にして２本鎖分子を形成させるこ
とをいう。ハイブリダイゼーションが可能な条件下で接
触させるとは、融解温度（Ｔｍ）よりも低い温度条件下
で、両者を接触させることを意味する。Ｔｍは、相補的
な塩基配列を構成する部分の塩基組成、ハイブリダイゼ
ーション環境の塩濃度、又は、共存する各種の成分等に
よって決定される。Ｔｍに近いほどストリンジェンシー
が高い条件ということができ、特異的なハイブリダイズ
が発現される。増幅生成物と標識プローブとの接触は、
ｍＲＮＡの増幅反応後に行うことができる。
とをハイブリダイゼーションが可能な条件で接触させ
る。本発明において、ハイブリダイゼーションとは核酸
の２本の相補鎖を一緒にして２本鎖分子を形成させるこ
とをいう。ハイブリダイゼーションが可能な条件下で接
触させるとは、融解温度（Ｔｍ）よりも低い温度条件下
で、両者を接触させることを意味する。Ｔｍは、相補的
な塩基配列を構成する部分の塩基組成、ハイブリダイゼ
ーション環境の塩濃度、又は、共存する各種の成分等に
よって決定される。Ｔｍに近いほどストリンジェンシー
が高い条件ということができ、特異的なハイブリダイズ
が発現される。増幅生成物と標識プローブとの接触は、
ｍＲＮＡの増幅反応後に行うことができる。
【００２１】本発明において、得られた増幅生成物とプ
ローブとをハイブリダイゼーションさせる方法としては
特に限定されず、例えば、スロットブロットハイブリダ
イゼーション法、ドットブロットハイブリダイゼーショ
ン法等を挙げることができる。
ローブとをハイブリダイゼーションさせる方法としては
特に限定されず、例えば、スロットブロットハイブリダ
イゼーション法、ドットブロットハイブリダイゼーショ
ン法等を挙げることができる。
【００２２】本発明において、検出とはある試料中にク
リプトスポリジウム・パルバムに由来するＲＮＡが一定
の基準を超えて存在しているかどうかを判定するための
試験をいう。クリプトスポリジウム・パルバムの管理基
準が設定されている場合には、その値を基準として、基
準を越えている場合に陽性の結果を得られるように検出
系の感度を設定してもよい。感度の調整は、ＮＡＳＢＡ
の反応サイクルやプライマーセットの使用量といったＲ
ＮＡ増幅反応の条件を一定にすると共に、増幅生成物に
対する標識プローブの添加濃度等を適宜調整することに
よって行うことができる。
リプトスポリジウム・パルバムに由来するＲＮＡが一定
の基準を超えて存在しているかどうかを判定するための
試験をいう。クリプトスポリジウム・パルバムの管理基
準が設定されている場合には、その値を基準として、基
準を越えている場合に陽性の結果を得られるように検出
系の感度を設定してもよい。感度の調整は、ＮＡＳＢＡ
の反応サイクルやプライマーセットの使用量といったＲ
ＮＡ増幅反応の条件を一定にすると共に、増幅生成物に
対する標識プローブの添加濃度等を適宜調整することに
よって行うことができる。
【００２３】本発明の検出方法は、検出のみならず、分
離された微生物がクリプトスポリジウム・パルバムであ
るかどうかを判定するための試験である同定に利用する
こともできる。
離された微生物がクリプトスポリジウム・パルバムであ
るかどうかを判定するための試験である同定に利用する
こともできる。
【００２４】本発明はクリプトスポリジウム・パルバム
のオーシストの直接検出を可能にし顕微鏡観察を必要と
しない。本発明は糞便検体及び水道水、下水のような環
境サンプル中のクリプトスポリジウム・パルバムの検出
を可能にする。
のオーシストの直接検出を可能にし顕微鏡観察を必要と
しない。本発明は糞便検体及び水道水、下水のような環
境サンプル中のクリプトスポリジウム・パルバムの検出
を可能にする。
【００２５】本発明１のクリプトスポリジウム・パルバ
ムに由来するＲＮＡの検出方法は、本発明２の検出用試
薬キットを用いて実施することができる。即ち、本発明
２は、クリプトスポリジウム・パルバムに特異的な塩基
配列を有するｍＲＮＡの一部を増幅するためのプライマ
ー、及び、得られた増幅生成物に特異的にハイブリダイ
ズすることができるプローブを含むクリプトスポリジウ
ム・パルバムに由来するＲＮＡの検出用試薬キットであ
る。クリプトスポリジウム・パルバムに特異的な塩基配
列を有するＲＮＡを増幅するためのプライマーとして
は、本発明１において用いるプライマーと同様のものを
挙げることができる。増幅生成物に特異的にハイブリダ
イズすることができるプローブとしては、本発明１にお
いて用いるプローブと同様のものを挙げることができ
る。本発明２の検出用試薬キットは、更に、逆転写酵
素、ＲＮアーゼＨ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、ヌクレオ
チド基質、反応液を構成する緩衝液成分、そして校正用
の標準試料等を含んでいてもよい。本発明２の検出用試
薬キットは、これら核酸試料の分析用試薬類に加えて、
各種生体試料、又は、環境試料からクリプトスポリジウ
ム・パルバムの核酸を抽出するための界面活性剤や酵素
成分等を前処理用の試薬として更に含んでいてもよい。
ムに由来するＲＮＡの検出方法は、本発明２の検出用試
薬キットを用いて実施することができる。即ち、本発明
２は、クリプトスポリジウム・パルバムに特異的な塩基
配列を有するｍＲＮＡの一部を増幅するためのプライマ
ー、及び、得られた増幅生成物に特異的にハイブリダイ
ズすることができるプローブを含むクリプトスポリジウ
ム・パルバムに由来するＲＮＡの検出用試薬キットであ
る。クリプトスポリジウム・パルバムに特異的な塩基配
列を有するＲＮＡを増幅するためのプライマーとして
は、本発明１において用いるプライマーと同様のものを
挙げることができる。増幅生成物に特異的にハイブリダ
イズすることができるプローブとしては、本発明１にお
いて用いるプローブと同様のものを挙げることができ
る。本発明２の検出用試薬キットは、更に、逆転写酵
素、ＲＮアーゼＨ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、ヌクレオ
チド基質、反応液を構成する緩衝液成分、そして校正用
の標準試料等を含んでいてもよい。本発明２の検出用試
薬キットは、これら核酸試料の分析用試薬類に加えて、
各種生体試料、又は、環境試料からクリプトスポリジウ
ム・パルバムの核酸を抽出するための界面活性剤や酵素
成分等を前処理用の試薬として更に含んでいてもよい。
【００２６】
【実施例】以下に実施例を掲げて本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるもの
ではない。 実施例１ クリプトスポリジウム・パルバムＨＮＪ−１株のオーシ
スト懸濁液を段階希釈した。各濃度の希釈液をそれぞれ
のチューブに入れ、４２℃で２０分間熱処理した後、Ｒ
ＮＡを抽出した。
明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるもの
ではない。 実施例１ クリプトスポリジウム・パルバムＨＮＪ−１株のオーシ
スト懸濁液を段階希釈した。各濃度の希釈液をそれぞれ
のチューブに入れ、４２℃で２０分間熱処理した後、Ｒ
ＮＡを抽出した。
【００２７】（ＲＮＡ抽出）ＲＮＡ抽出はＭａｇＥｘｔ
ｒａｃｔｏｒ（東洋紡績社製）を用いて行った。まず熱
処理したオーシスト希釈液を３０００×ｇで５分間遠心
した。上清を捨て、２−メルカプトエタノールを１％含
む７００μＬの溶解・吸着液を加えて懸濁した。この懸
濁液をドライアイス−エタノールで凍結し、６５℃に設
定したホットブロックで融解した。この凍結−融解処理
を５回行った。懸濁液に５μＬの磁性ビーズ溶液を加
え、ボルテックスで２０秒間攪拌した。室温に１分間放
置して懸濁液中のＲＮＡを磁性ビーズに吸着させた。３
０００×ｇで１０秒間遠心し、上清を捨てた。６００μ
Ｌの洗浄液Ｉを加え、ボルテックスで１０秒間攪拌し
た。３０００×ｇで１０秒間遠心し、上清を捨てた。８
００μＬの洗浄液IIを加え、ボルテックスで１０秒間攪
拌した。３０００×ｇで１０秒間遠心し、上清を捨て
た。再度８００μＬの洗浄液IIを加え、同様のことを行
った。溶出液５μＬを加え、ボルテックスで５秒間攪拌
した。６５℃で２分間放置し、ビーズに吸着したＲＮＡ
を溶出させた。再度ボルテックスで５秒間攪拌した。３
０００×ｇで１０秒間遠心し、上清に含まれるＲＮＡを
回収した。
ｒａｃｔｏｒ（東洋紡績社製）を用いて行った。まず熱
処理したオーシスト希釈液を３０００×ｇで５分間遠心
した。上清を捨て、２−メルカプトエタノールを１％含
む７００μＬの溶解・吸着液を加えて懸濁した。この懸
濁液をドライアイス−エタノールで凍結し、６５℃に設
定したホットブロックで融解した。この凍結−融解処理
を５回行った。懸濁液に５μＬの磁性ビーズ溶液を加
え、ボルテックスで２０秒間攪拌した。室温に１分間放
置して懸濁液中のＲＮＡを磁性ビーズに吸着させた。３
０００×ｇで１０秒間遠心し、上清を捨てた。６００μ
Ｌの洗浄液Ｉを加え、ボルテックスで１０秒間攪拌し
た。３０００×ｇで１０秒間遠心し、上清を捨てた。８
００μＬの洗浄液IIを加え、ボルテックスで１０秒間攪
拌した。３０００×ｇで１０秒間遠心し、上清を捨て
た。再度８００μＬの洗浄液IIを加え、同様のことを行
った。溶出液５μＬを加え、ボルテックスで５秒間攪拌
した。６５℃で２分間放置し、ビーズに吸着したＲＮＡ
を溶出させた。再度ボルテックスで５秒間攪拌した。３
０００×ｇで１０秒間遠心し、上清に含まれるＲＮＡを
回収した。
【００２８】（ＮＡＳＢＡ法）抽出したＲＮＡをＮＡＳ
ＢＡキット（東洋紡績社製）を用いて増幅した。まずＮ
ＡＳＢＡ凍結乾燥試薬に、ＮＡＳＢＡ溶解液５０μＬを
加えて溶解した。次いで５１．６μＬの水、８．４μＬ
のＫＣｌ（２Ｍ）、５μＬのプライマー１（配列番号
２、１００μＭ）、５μＬのプライマー２（配列番号
４、１００μＭ）を加えてプライマー溶液を作成した。
作成したプライマー溶液１０μＬをチューブにそれぞれ
加え、更にオーシスト懸濁液から抽出した５μＬのＲＮ
Ａ溶液を加えた。各チューブを６５℃、５分、次いで４
１℃、５分処理した。更に各々にＮＡＳＢＡ酵素溶液５
μＬを加え、軽くタッピングした後４１℃、５分保温し
た。これを軽く遠心した後、４１℃で１時間半保温しＲ
ＮＡを増幅させた。
ＢＡキット（東洋紡績社製）を用いて増幅した。まずＮ
ＡＳＢＡ凍結乾燥試薬に、ＮＡＳＢＡ溶解液５０μＬを
加えて溶解した。次いで５１．６μＬの水、８．４μＬ
のＫＣｌ（２Ｍ）、５μＬのプライマー１（配列番号
２、１００μＭ）、５μＬのプライマー２（配列番号
４、１００μＭ）を加えてプライマー溶液を作成した。
作成したプライマー溶液１０μＬをチューブにそれぞれ
加え、更にオーシスト懸濁液から抽出した５μＬのＲＮ
Ａ溶液を加えた。各チューブを６５℃、５分、次いで４
１℃、５分処理した。更に各々にＮＡＳＢＡ酵素溶液５
μＬを加え、軽くタッピングした後４１℃、５分保温し
た。これを軽く遠心した後、４１℃で１時間半保温しＲ
ＮＡを増幅させた。
【００２９】（プローブの作成）実験に用いたプローブ
の作成は、ＤＩＧ ＤＮＡ標識及び検出キット（ベーリ
ンガーマンハイム社製）を用いて行った。まずクリプト
スポリジウム・パルバムＨＮＪ−１株のＲＮＡから、Ｒ
Ｔ−ＰＣＲを用いて、配列番号５の領域を増幅した。得
られた増幅生成物を精製し、精製物の内の４５μＬを１
００℃、５分で変成し、氷上で急冷した。これに６μＬ
のヘキサヌクレオチド混合液、６μＬのｄＮＴＰ標識溶
液および２μＬのＫｌｅｎｏｗ酵素（２ｕｎｉｔ／μ
Ｌ）を加え、３７℃で２０時間インキュベーションして
プローブを作成した。エタノール沈殿によってプローブ
を沈殿させ、沈殿を７０％エタノールで洗浄した後、乾
燥させて５０μＬの超純水に溶かし、これをプローブ溶
液として使用した。
の作成は、ＤＩＧ ＤＮＡ標識及び検出キット（ベーリ
ンガーマンハイム社製）を用いて行った。まずクリプト
スポリジウム・パルバムＨＮＪ−１株のＲＮＡから、Ｒ
Ｔ−ＰＣＲを用いて、配列番号５の領域を増幅した。得
られた増幅生成物を精製し、精製物の内の４５μＬを１
００℃、５分で変成し、氷上で急冷した。これに６μＬ
のヘキサヌクレオチド混合液、６μＬのｄＮＴＰ標識溶
液および２μＬのＫｌｅｎｏｗ酵素（２ｕｎｉｔ／μ
Ｌ）を加え、３７℃で２０時間インキュベーションして
プローブを作成した。エタノール沈殿によってプローブ
を沈殿させ、沈殿を７０％エタノールで洗浄した後、乾
燥させて５０μＬの超純水に溶かし、これをプローブ溶
液として使用した。
【００３０】（ドットブロットハイブリダイゼーショ
ン）ＮＡＳＢＡ増幅生成物はドットブロットハイブリダ
イゼーションにより検出した。まずナイロンメンブレン
を適切な大きさに切り、各ＮＡＳＢＡ増幅生成物を１μ
Ｌずつブロットしていった。ブロットしたメンブレンを
０．５Ｍ ＮａＯＨ／１．５Ｍ ＮａＣｌに２分間浸
し、ＲＮＡを変性させた。メンブレンを５×ＳＳＣ
（０．６Ｍ ＮａＣｌ、６０ｍＭ クエン酸三ナトリウ
ム二水和物 ｐＨ７．０）中に移し、数分間振とうし
た。メンブレンを乾いた濾紙の上に置き風乾した。乾い
たメンブレンをラップに包み、ブロットした面を下にし
て、ＵＶトランスイルミネーター上に置いた。５分間Ｕ
Ｖを照射してＲＮＡを固定した。
ン）ＮＡＳＢＡ増幅生成物はドットブロットハイブリダ
イゼーションにより検出した。まずナイロンメンブレン
を適切な大きさに切り、各ＮＡＳＢＡ増幅生成物を１μ
Ｌずつブロットしていった。ブロットしたメンブレンを
０．５Ｍ ＮａＯＨ／１．５Ｍ ＮａＣｌに２分間浸
し、ＲＮＡを変性させた。メンブレンを５×ＳＳＣ
（０．６Ｍ ＮａＣｌ、６０ｍＭ クエン酸三ナトリウ
ム二水和物 ｐＨ７．０）中に移し、数分間振とうし
た。メンブレンを乾いた濾紙の上に置き風乾した。乾い
たメンブレンをラップに包み、ブロットした面を下にし
て、ＵＶトランスイルミネーター上に置いた。５分間Ｕ
Ｖを照射してＲＮＡを固定した。
【００３１】ＲＮＡが固定されたメンブレンを５×ＳＳ
Ｃで湿らせた。メンブレンをハイブリバック（コスモ・
バイオ社製）に移し、５ｍＬのハイブリダイゼーション
バッファー（５×ＳＳＣ、０．５％ブロッキング試薬、
０．５％ポリビニルピロリドンＫ−３０、１％ＳＤＳ）
を加えた後、５５℃のウォーターバス中で３０分間イン
キュベーションした。メンブレンを新しいハイブリバッ
クに入れ、３μＬのプローブ溶液を含む１ｍＬのハイブ
リダイゼーションバッファーを加えて５５℃で一晩イン
キュベートした。
Ｃで湿らせた。メンブレンをハイブリバック（コスモ・
バイオ社製）に移し、５ｍＬのハイブリダイゼーション
バッファー（５×ＳＳＣ、０．５％ブロッキング試薬、
０．５％ポリビニルピロリドンＫ−３０、１％ＳＤＳ）
を加えた後、５５℃のウォーターバス中で３０分間イン
キュベーションした。メンブレンを新しいハイブリバッ
クに入れ、３μＬのプローブ溶液を含む１ｍＬのハイブ
リダイゼーションバッファーを加えて５５℃で一晩イン
キュベートした。
【００３２】メンブレン上のスポットは、ベーリンガー
マンハイム社製のＤＩＧ ＤＮＡ標識及び検出キットを
用いて発色させ、検出した。メンブレンをチューブから
取り出し、５０ｍＬの２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液
に浸して、室温で５分間振とうした。これを２回行なっ
た。５０ｍＬの０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液に
浸して、５５℃で２０分間振とうした。これを２回行な
った。５０ｍＬの洗浄バッファー（０．１Ｍマレイン
酸、０．１５ＭＮａＣｌ、０．３％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐ
Ｈ７．５）に浸して室温で１０分振とうした。その後メ
ンブレンを１０ｍＬのバッファー２（０．１Ｍマレイン
酸、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１％ブロッキング剤、ｐＨ
７．５）に浸して室温で１時間静置した。２μＬのアル
カリフォスファターゼ標識−抗ジゴキシゲニン抗体（７
５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）を含む１０ｍＬのバッファー２
の中にメンブレンを移し、更に１時間静置した。メンブ
レンを５０ｍＬの洗浄バッファーに移し室温で１５分振
とうした。これを２回行なった。メンブレンを１０ｍＬ
の検出バッファーに浸した後、２００μＬのＮＢＴ／Ｂ
ＣＩＰ溶液を含む１０ｍＬの発色溶液に移して発色させ
た。結果は図１に示した。なお、図１において、スポッ
ト１はオーシスト１０5 個、スポット２はオーシスト１
０4 個、スポット３はオーシスト１０ 3 個、スポット４
はオーシスト１０2 個、スポット５はオーシスト１０1
個、スポット６はオーシスト１０0 個、スポット７はオ
ーシストなし、を示す。図１に示したとおり、２０分後
には１０0 〜１０5 個のスポットすべてにはっきりとし
た発色が現れた。この結果オーシスト１個からでも検出
可能であることが示された。
マンハイム社製のＤＩＧ ＤＮＡ標識及び検出キットを
用いて発色させ、検出した。メンブレンをチューブから
取り出し、５０ｍＬの２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液
に浸して、室温で５分間振とうした。これを２回行なっ
た。５０ｍＬの０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液に
浸して、５５℃で２０分間振とうした。これを２回行な
った。５０ｍＬの洗浄バッファー（０．１Ｍマレイン
酸、０．１５ＭＮａＣｌ、０．３％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐ
Ｈ７．５）に浸して室温で１０分振とうした。その後メ
ンブレンを１０ｍＬのバッファー２（０．１Ｍマレイン
酸、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１％ブロッキング剤、ｐＨ
７．５）に浸して室温で１時間静置した。２μＬのアル
カリフォスファターゼ標識−抗ジゴキシゲニン抗体（７
５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）を含む１０ｍＬのバッファー２
の中にメンブレンを移し、更に１時間静置した。メンブ
レンを５０ｍＬの洗浄バッファーに移し室温で１５分振
とうした。これを２回行なった。メンブレンを１０ｍＬ
の検出バッファーに浸した後、２００μＬのＮＢＴ／Ｂ
ＣＩＰ溶液を含む１０ｍＬの発色溶液に移して発色させ
た。結果は図１に示した。なお、図１において、スポッ
ト１はオーシスト１０5 個、スポット２はオーシスト１
０4 個、スポット３はオーシスト１０ 3 個、スポット４
はオーシスト１０2 個、スポット５はオーシスト１０1
個、スポット６はオーシスト１０0 個、スポット７はオ
ーシストなし、を示す。図１に示したとおり、２０分後
には１０0 〜１０5 個のスポットすべてにはっきりとし
た発色が現れた。この結果オーシスト１個からでも検出
可能であることが示された。
【００３３】実施例２ 表１に示した、クリプトスポリジウム・パルバム杏林大
株、クリプトスポリジウム・パルバムＨＮＪ−１株、ク
リプトスポリジウム・バイレイタイプ株、サッカロマイ
セス・セレビシエ、エシェリヒア・コリの５株を用いた
以外は、実施例１と同様に行った。
株、クリプトスポリジウム・パルバムＨＮＪ−１株、ク
リプトスポリジウム・バイレイタイプ株、サッカロマイ
セス・セレビシエ、エシェリヒア・コリの５株を用いた
以外は、実施例１と同様に行った。
【００３４】
【表１】
【００３５】結果を図２に示した。図２において、スポ
ット１はクリプトスポリジウム・パルバム杏林大株、ス
ポット２はクリプトスポリジウム・パルバムＨＮＪ−１
株、スポット３はクリプトスポリジウム・バイレイタイ
プ株、スポット４はサッカロマイセス・セレビシエＩＦ
Ｏ ０２３４株、スポット５はエシェリヒア・コリＩＦ
Ｏ ３３０１株、を示す。図２に示したとおり、クリプ
トスポリジウム・パルバム杏林大株とクリプトスポリジ
ウム・パルバムＨＮＪ−１株のみを特異的に検出した。
ット１はクリプトスポリジウム・パルバム杏林大株、ス
ポット２はクリプトスポリジウム・パルバムＨＮＪ−１
株、スポット３はクリプトスポリジウム・バイレイタイ
プ株、スポット４はサッカロマイセス・セレビシエＩＦ
Ｏ ０２３４株、スポット５はエシェリヒア・コリＩＦ
Ｏ ３３０１株、を示す。図２に示したとおり、クリプ
トスポリジウム・パルバム杏林大株とクリプトスポリジ
ウム・パルバムＨＮＪ−１株のみを特異的に検出した。
【００３６】
【発明の効果】今まで検査時間が長くかかったり、煩雑
な操作が必要とされたクリプトスポリジウム・パルバム
の検出が、本発明によるプローブ及びプライマーを用
い、迅速かつ簡便に行えるようになる。更に、生きたク
リプトスポリジウム・パルバムのみを検出できる。その
ため、水道水や環境水等におけるクリプトスポリジウム
・パルバムに対するリスク管理が今まで以上に迅速かつ
安価に行えるようになる。
な操作が必要とされたクリプトスポリジウム・パルバム
の検出が、本発明によるプローブ及びプライマーを用
い、迅速かつ簡便に行えるようになる。更に、生きたク
リプトスポリジウム・パルバムのみを検出できる。その
ため、水道水や環境水等におけるクリプトスポリジウム
・パルバムに対するリスク管理が今まで以上に迅速かつ
安価に行えるようになる。
【００３７】
【配列表】 <110> Towa Kagaku Co.,Ltd. <120> Method for detecting RNA of Cryptosporidium parvum <130> TW02 <160> 5 <210> 1 <211> 430 <212> DNA <213> Cryptosporidium parvum <400> 1 caaacatcaa agagtggtga ggaactcaca agcttaagag aatatgttga tagaatgaag 60 gaaaatcaaa aggaaattta ctacattact ggtgaatcta ttcaagcagt acaaaactca 120 ccattccttg agaagcttag aaagttagat tatgaggtaa tttacatggt tgacccaatt 180 gacgaatact gtgtacaaca aatgaaggaa ttcgatggca agaagttgag atgctgtact 240 aaggaaggtc ttactttaga ggaaactgct gaggagaagg aagcctttga agctctccag 300 aaggaatatg agcctttatg ccagttaatt aaagaggttc ttcatgataa ggttgataag 360 gttatcacat ctcagcgtat ttctgactca ccatgtgtac tcgttacatc tgaatttgga 420 tggtctgcaa 430 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence for Cryptosporidium parvum <400> 2 caaacatcaa agagtggtga gg 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence for Cryptosporidium parvum <400> 3 ttgcagacca tccaaattca 20 <210> 4 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence for Cryptosporidium parvum <400> 4 aattctaata cgactcacta tagggagaag gttgcagacc atccaaattc a 51 <210> 5 <211> 262 <212> DNA <213> Cryptosporidium parvum <400> 5 actcaccatt ccttgagaag cttagaaagt tagattatga ggtaatttac atggttgacc 60 caattgacga atactgtgta caacaaatga aggaattcga tggcaagaag ttgagatgct 120 gtactaagga aggtcttact ttagaggaaa ctgctgagga gaaggaagcc tttgaagctc 180 tccagaagga atatgagcct ttatgccagt taattaaaga ggttcttcat gataaggttg 240 ataaggttat cacatctcag cg 262
【図１】実施例１における各濃度のオーシスト懸濁液の
ＲＮＡから増幅したＮＡＳＢＡ増幅生成物についてドッ
トブロットハイブリダイゼーションを行った結果を示す
図である。
ＲＮＡから増幅したＮＡＳＢＡ増幅生成物についてドッ
トブロットハイブリダイゼーションを行った結果を示す
図である。
【図２】実施例２における微生物５株のＲＮＡを増幅し
たＮＡＳＢＡ増幅生成物についてドットブロットハイブ
リダイゼーションを行った結果を示す図である。
たＮＡＳＢＡ増幅生成物についてドットブロットハイブ
リダイゼーションを行った結果を示す図である。
フロントページの続き (72)発明者 大田 美咲 広島県広島市中区舟入町６番５号 東和科 学株式会社内 (72)発明者 白井 勝久 東京都中央区日本橋箱崎町10番２号 東和 科学株式会社内 (72)発明者 保科 定頼 東京都港区西新橋３−25−８ 東京慈恵会 医科大学内 (72)発明者 鶴岡 誠 広島県広島市安佐南区沼田町大塚7024番地 (72)発明者 軽部 征夫 神奈川県川崎市宮前区東有馬１−３−16 (72)発明者 平田 強 神奈川県相模原市渕野辺１−17−71 麻布 大学内 Ｆターム(参考） 4B024 AA13 CA09 CA12 HA14 4B063 QA01 QA18 QQ03 QQ05 QQ18 QQ53 QR13 QR56 QR62 QS03 QS15 QS25 QS34 QX01
Claims (11)
- 【請求項１】 クリプトスポリジウム・パルバムに特異
的な塩基配列を有するｍＲＮＡの一部を増幅する行程、
及び、得られた増幅生成物とプローブとをハイブリダイ
ゼーションさせる行程を有することを特徴とするクリプ
トスポリジウム・パルバムに由来するＲＮＡの検出方
法。 - 【請求項２】 クリプトスポリジウム・パルバムに特異
的な塩基配列を有するｍＲＮＡは、ヒートショックタン
パク質８６遺伝子のｍＲＮＡであることを特徴とする請
求項１記載のクリプトスポリジウム・パルバムに由来す
るＲＮＡの検出方法。 - 【請求項３】 クリプトスポリジウム・パルバムに特異
的な塩基配列を有するｍＲＮＡの一部を増幅する行程に
おいて、配列番号２に示す塩基配列の少なくとも一部分
を含み少なくとも１０ヌクレオチドの鎖長であるＤＮＡ
と、配列番号３に示す塩基配列の少なくとも一部分を含
み少なくとも１０ヌクレオチドの鎖長であるＤＮＡと
を、プライマーセットとして用いることを特徴とする請
求項１又は２記載のクリプトスポリジウム・パルバムに
由来するＲＮＡの検出方法。 - 【請求項４】 プローブは、配列番号５に示す塩基配列
の少なくとも一部分を含むＤＮＡであることを特徴とす
る請求項１、２又は３記載のクリプトスポリジウム・パ
ルバムに由来するＲＮＡの検出方法。 - 【請求項５】 クリプトスポリジウム・パルバムに特異
的な塩基配列を有するｍＲＮＡの一部を増幅する工程に
おいて、ＮＡＳＢＡ技術を用いることを特徴とする請求
項１、２、３又は４記載のクリプトスポリジウム・パル
バムに由来するＲＮＡの検出方法。 - 【請求項６】 クリプトスポリジウム・パルバムに特異
的な塩基配列を有するｍＲＮＡの一部を増幅するための
プライマー、及び、得られた増幅生成物に特異的にハイ
ブリダイズすることができるプローブを含むことを特徴
とするクリプトスポリジウム・パルバムに由来するＲＮ
Ａの検出用試薬キット。 - 【請求項７】 配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮ
Ａ。 - 【請求項８】 配列番号２に示す塩基配列を有するＤＮ
Ａ。 - 【請求項９】 配列番号３に示す塩基配列を有するＤＮ
Ａ。 - 【請求項１０】 配列番号４に示す塩基配列を有するＤ
ＮＡ。 - 【請求項１１】 配列番号５に示す塩基配列を有するＤ
ＮＡ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29244399A JP4431775B2 (ja) | 1999-10-14 | 1999-10-14 | クリプトスポリジウム・パルバムに由来するｒｎａの検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29244399A JP4431775B2 (ja) | 1999-10-14 | 1999-10-14 | クリプトスポリジウム・パルバムに由来するｒｎａの検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001112481A true JP2001112481A (ja) | 2001-04-24 |
| JP4431775B2 JP4431775B2 (ja) | 2010-03-17 |
Family
ID=17781873
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29244399A Expired - Lifetime JP4431775B2 (ja) | 1999-10-14 | 1999-10-14 | クリプトスポリジウム・パルバムに由来するｒｎａの検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4431775B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003033184A (ja) * | 2001-07-18 | 2003-02-04 | Goda Hiroshi | クリプトスポリジウムの検出用キット及び検出方法 |
| JP2009538148A (ja) * | 2006-05-24 | 2009-11-05 | ジェン−プロウブ インコーポレイテッド | 試験サンプルにおけるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ複合体生物の存在を決定するためのプローブおよびキット、ならびに捕捉プローブを使用するグラム陽性桿菌または真菌の増幅方法 |
| CN111607656A (zh) * | 2020-06-28 | 2020-09-01 | 哈密市动物疫病预防控制中心 | 犬类粪便中绦虫与孢子虫三重pcr检测引物、方法与试剂盒 |
-
1999
- 1999-10-14 JP JP29244399A patent/JP4431775B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003033184A (ja) * | 2001-07-18 | 2003-02-04 | Goda Hiroshi | クリプトスポリジウムの検出用キット及び検出方法 |
| JP2009538148A (ja) * | 2006-05-24 | 2009-11-05 | ジェン−プロウブ インコーポレイテッド | 試験サンプルにおけるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ複合体生物の存在を決定するためのプローブおよびキット、ならびに捕捉プローブを使用するグラム陽性桿菌または真菌の増幅方法 |
| JP2013106617A (ja) * | 2006-05-24 | 2013-06-06 | Gen-Probe Inc | 試験サンプルにおけるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ複合体生物の存在を決定するためのプローブおよびキット、ならびに捕捉プローブを使用するグラム陽性桿菌または真菌の増幅方法 |
| CN111607656A (zh) * | 2020-06-28 | 2020-09-01 | 哈密市动物疫病预防控制中心 | 犬类粪便中绦虫与孢子虫三重pcr检测引物、方法与试剂盒 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4431775B2 (ja) | 2010-03-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hodson et al. | In situ PCR for visualization of microscale distribution of specific genes and gene products in prokaryotic communities | |
| Lawson et al. | Polymerase chain reaction detection and speciation of Campylobacter upsaliensis and C. helveticus in human faeces and comparison with culture techniques | |
| JPH10503655A (ja) | ミコバクテリアの検出 | |
| JP2024026545A (ja) | 改良された核酸検出方法 | |
| US6436638B1 (en) | Cryptosporidium detection method | |
| US5770368A (en) | Cryptosporidium detection method | |
| JP5838550B2 (ja) | クラミジア・トラコマチスｒｎａの検出方法及び検出試薬 | |
| CN114207154A (zh) | 用于检测一种或多种病原体的选择性富集肉汤 | |
| CN110923346A (zh) | 一种用于rna恒温扩增检测牛支原体的引物和探针、试剂盒及检测方法 | |
| JP2003164282A (ja) | 微生物の検出方法、及び微生物の検出用プライマーセット | |
| US20100297637A1 (en) | Primer for amplification of rrna or bacterium belonging to the genus legionella, detection method, and detection kit | |
| JP2003516764A (ja) | マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種の核酸増幅および検出 | |
| JP2001112481A (ja) | クリプトスポリジウム・パルバムに由来するｒｎａの検出方法 | |
| AU716766B2 (en) | Nucleic acid assay for the detection and differentiation of three chlamydia species | |
| CA3132581C (en) | Method for determining whether organism having cell wall exists and method for identifying organism having cell wall | |
| JP2009535052A (ja) | 微生物の検出および計数方法 | |
| EP1252331B1 (en) | Methods and compositions for detection of mycobacterium avium complex species | |
| US20040072145A1 (en) | Method of detecting norwalk-like virus (gII) | |
| JPH05184399A (ja) | ジアルジン遺伝子含有ジアルジアの検出方法 | |
| ES2329343T3 (es) | Deteccion de micro-organismos utilizando genes inducibles. | |
| JP2003033184A (ja) | クリプトスポリジウムの検出用キット及び検出方法 | |
| JP2022025844A (ja) | 生存細菌の検出方法及びそのためのキット | |
| JP2004147550A (ja) | 核酸断片、微生物の検出方法及び微生物検出用キット | |
| CN113512609A (zh) | 新型冠状病毒实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针 | |
| JP2007075018A (ja) | Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｃｏｌｉの検出法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20061010 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090820 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091016 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20091110 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20091203 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20091203 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20091203 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4431775 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130108 Year of fee payment: 3 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |